Keramische omnidirectionele bioprinting in celbeladen suspensies voor het genereren van botanalogen

Dit protocol maakt de fabricage van botanalogen mogelijk zonder dat verwarming of giftige chemicaliën nodig zijn. Op deze manier worden botstructuren gevormd met het potentieel voor het repareren van een botdefect in klinische omgevingen met behulp van de eigen cellen van een patiënt. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat de botinkt kan worden afgedrukt met levende cellen om een complexe botachtige structuur te vormen en om differentiatie te richten op botvormende afstamming.

Verder kunnen medicijnen in de botinkt worden geladen om tegelijkertijd wondgenezing, botregeneratie en pathologieën zoals kanker te verbeteren. Gagan Jalandhra, een promovendus in mijn lab, en Dr. Sara Romanazzo, die met mij en Dr.Jalandhra aan verschillende projecten heeft gewerkt, waaronder de ontwikkeling van deze technologie, demonstreren de procedure. Begin met het toevoegen van het calciumwaterstoffosfaat en calciumcarbonaat poedermengsel aan een zirkonia-kroes, zodat deze niet meer dan 75% vol is.

Breng de kroes over in een oven, verwarm deze tot 1.400 graden Celsius met een snelheid van vijf graden Celsius per minuut en houd deze drie uur vast. Doof de reactie door de kroes uit de oven te verwijderen en op een top van een vuurvast blok te laten staan. Laat het volledig afkoelen voordat u het hanteert.

Gebruik een vijzel en stamper om de alfa-tricalciumfosfaatkoek te breken en te malen, zodat de resulterende korrels een maximale grootte van 200 micrometer hebben. Voeg drie millimeter yttria-gestabiliseerde zirkoniaballen toe aan het gemalen mengsel, gevolgd door 100% ethanol. Zet het deksel vast en maal gedurende twee uur met 180 omwentelingen per minuut.

Verzamel de suspensie en scheid de ballen, met behulp van 100% ethanol voor het wassen. Droog de suspensie 24 uur in een oven op 120 graden Celsius. Voeg het gedroogde poeder toe aan de maalpotten met één millimeter zirkoniaballen en 100% ethanol in dezelfde gewichtsverhoudingen als in de eerste fase.

Maal gedurende twee uur met 180 rotaties per minuut. Daarna scheiden en drogen in de oven. Haal het monster uit de oven.

Om de bone-ink te maken, voeg 630 microliter glycerol en 130 microliter polysorbaat 80 toe aan een potje ball mil. Voeg vervolgens 100 milligram ammoniumfosfaat dibasiszuur en twee gram alfa-tricalciumfosfaatpoeder toe aan de oplossing en roer continu met een spatel om te combineren. Voeg een zirkoniabal van 25 millimeter toe, bevestig het deksel en plaats het gedurende 60 minuten in een planetaire molen met 180 rotaties per minuut, pauzeer halverwege om de zijkanten van de pot met een spatel met een spatel naar beneden te schrapen.

Plaats de inkt in een spuit van één milliliter. Maak een 10%-oplossing van gelatine type A in 1X PBS zoals beschreven in het tekstmanuscript. Plaats de erlenmeyer op de roerder.

Voeg vervolgens 5,796 milliliter methacrylzuuranhydride toe en blijf 90 minuten roeren in het donker bij 50 graden Celsius. Doof de reactie door de inhoud van de erlenmeyers tweevoudig te verdunnen met PBS. Decanteer in buizen van 50 milliliter en verwijder het niet-gereageerde methacrylzuuranhydride door centrifugatie bij 3000 RCF bij kamertemperatuur gedurende drie minuten en verzamel het supernatant.

Dialyseer het supernatant in 14 kilodalton afgesneden cellulosedialysebuizen tegen gedeïoniseerd water bij 40 graden Celsius gedurende vijf dagen terwijl je voorzichtig roert. Vervang het gedeïoniseerde water elke dag. Bereid je voor op opslag door in buizen van 50 milliliter te decanteren, de dop vast te zetten en 12 uur in de koelkast te plaatsen.

Vries vervolgens de monsters in met vloeibare stikstof en lyofiel onmiddellijk gedurende vijf dagen bij min 54 graden Celsius en 0,4 millibar. Bewaar het resulterende schuim in een vriezer bij min 20 graden Celsius. Om GelMA-microgels te synthetiseren, maakt u een GelMA-oplossing van 10% gewicht in PBS door de gelofiliseerde GelMA te wegen, toe te voegen aan een buis met PBS en te verwarmen in een waterbad op 50 graden Celsius totdat deze volledig gehydrateerd is.

Voeg 37 milliliter olie per milliliter GelMA-oplossing toe aan een bekerglas en zorg ervoor dat het niet meer dan 65% vol is. Zet een dubbel bekersysteem op een hete plaat met magnetisch roeren door het bekerglas met olie in een groter bekerglas te plaatsen. Verwarm al roerend tot 40 graden Celsius.

Laad de GelMA-oplossing in een spuit en voeg deze druppelsgewijs toe aan de roerolie door een filter van 0,45 micrometer. Laat de emulsie gedurende 10 minuten in evenwicht zijn. Verlaag de temperatuur van de emulsie tot 15 graden Celsius tot thermisch.

Stabiliseer de bollen door gemalen ijs toe te voegen aan de ruimte tussen de twee bekers. Voeg aceton toe aan de draaiende GelMA-emulsie. Decanteer de inhoud van het bekerglas in buizen van 50 milliliter en zorg ervoor dat u de wanden van het bekerglas met aceton wast.

Laat het 20 minuten rusten om de uitgedroogde microgels naar de bodem te laten zakken. Gooi het supernatant weg en was de microgels twee keer met aceton. Consolideer in één buis, vul aan met aceton en soniceer gedurende 10 seconden.

Nogmaals, was het twee keer met aceton. Bewaren in aceton bij kamertemperatuur totdat dit nodig is voor het afdrukken. Om de GelMA microgel suspensie voor te bereiden voor afdrukken, formuleert u een 1% gewichtsgewicht oplossing van GelMA in DMEM zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Verdamp de aceton uit de gedehydrateerde microgels en weeg het resulterende poeder in een buis. Voeg aceton toe en breng over naar een steriele omgeving. Om de microgel suspensie te vormen, verdampt u de aceton uit het poeder in de bioveiligheidskast.

Voeg na verdamping DMEM, 1% GelMA-oplossing in DMEM en 2,5% LAP-initiatoroplossing toe om een uiteindelijke verpakkingsfractie van 30% te bereiken Laat toe om ten minste 12 uur bij kamertemperatuur volledig te hydrateren. Kweek de van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen in dmem met een laag glucosegehalte aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot confluent. Verwijder de van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen uit de weefselkweekkolf door het medium te verwijderen en te wassen met steriel PBS.

Pelleteer de cellen door gedurende vijf minuten te centrifugeren bij 150 RCF bij kamertemperatuur. Tel de cellen en bereken minstens 5 x 10 tot de vijf cellen voor elke milliliter GelMA-microgels. Wijs het vereiste volume van de celsuspensie toe aan een afzonderlijke buis en pellet zoals eerder gedemonstreerd.

Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant met behulp van een pipet, waarbij alleen de celkorrel overblijft. Voeg het vereiste volume microgelsuspensie toe aan de pellet en pipetteer voorzichtig op en neer om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Laad de celbeladen in microgelsuspensie in een reactor met behulp van een pipet.

Met behulp van een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 23 gauge, deponeren de botinkt, crosslinken van de cel en met botinkt beladen GelMA-microgelconstructies met een UV-crosslinkerlamp op 405 nanometer gedurende 90 seconden. Breng de microgelsuspensie onmiddellijk over op een putplaat van de juiste grootte met volledige DMEM. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Vervang het kweekmedium na 24 uur en vervolgens elke 48 tot 72 uur indien nodig. De botinkt werd geanalyseerd door scanning elektronenmicroscopie om de microstructuur te bepalen, die de vorming van hydroxyapatietkristal na inktinstelling liet zien, vooral zichtbaar in droge omstandigheden. In deze studie werden cellen gemengd met GelMA-microgels en tot vijf dagen in cultuur gehouden, hetzij alleen in micro-gelsuspensie of in het COBICS-systeem.

De cellen vertoonden een goede levensvatbaarheid in de aanwezigheid van de botinkt, zowel op dag één als op dag vijf, wat bevestigde dat de uitlogingsproducten van de inkt niet schadelijk waren voor de cellen. Het is cruciaal om de roersnelheid te regelen terwijl het synthetiseren van microgel, omdat een kleine verandering in het roeren grootteverschillen kan veroorzaken. Het is ook belangrijk om te zorgen voor een homogene verdeling van de cellen binnen de suspensie van microgel.

Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om in gelatine microgel suspensies te printen, die fungeren als opofferingssteunen, waardoor op zichzelf staande botconstructies achterblijven. Maar het gebruik van GelMA opent de weg voor één pot multifasische constructies, zoals osteochondrale of botpeesinterfaces.