Onderzoek naar drivers van antireward in verslavingsgedrag met anatomisch specifieke eencellige genexpressiemethoden
4 augustus 2022
De combinatie van laser capture microdissectie en microfluïdische RT-qPCR biedt anatomische en biotechnische specificiteit bij het meten van het transcriptoom in enkele neuronen en glia. Het toepassen van creatieve methoden met de biologische benadering van een systeem voor psychiatrische ziekten kan leiden tot doorbraken in begrip en behandeling, zoals de neuro-inflammatie antireward hypothese bij verslaving.
Het protocol is zeer gevoelig en maakt het mogelijk om genexpressieprofiel met hoge doorvoer vast te leggen bij een enkele celresolutie. De techniek biedt zowel anatomische ruimtelijke als moleculaire specificiteit bij eencellige resolutie. Na het oogsten van de hersenen, het selecteren van de afzonderlijke cellen en het voorbereiden van het mRNA, injecteert u controlelijnvloeistof in de qPCR-chip voor priming.
Plaats de qPCR-chip in het microfluïdische mengapparaat. Selecteer het Prime-script en voer het programma uit. Verwijder na voltooiing van het programma de geprimeerde qPCR-chip en pipetteer zes microliter van de reactie van de PCR-monsterplaat in de overeenkomstige monsterput in de geprimeerde qPCR-chip.
Pipetteer nu zes microliter van de reactie van de PCR-testplaat in de overeenkomstige testput in de geprimeerde qPCR-chip. Steek vervolgens de chip in het microfluïdische mengapparaat. Selecteer het load mix script en voer het programma uit.
Schakel het microfluïdische RT-qPCR-platform in en warm de lamp op. Verwijder de qPCR-chip uit het microfluïdische mengapparaat en verwijder de beschermende sticker van de onderkant van de chip. Open het microfluïdische RT-qPCR-platform en laad de qPCR-chip in het platform.
Start de software voor gegevensverzameling door op Een nieuwe run starten te klikken. Controleer de chipcode en het chiptype. Klik dan op volgende.
Selecteer het chiprun-bestand en blader door de bestandslocatie voor de opslag van de gegevensverzameling. Klik vervolgens op Toepassingstype en selecteer Genexpressie. Selecteer ROX voor een passieve referentie, één sonde en EVAGreen voor sondetype.
Klik om het thermische cyclusprogramma te selecteren en selecteer Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. pcl-bestand. Download de data-analysesoftware.
Start de software om het microfluïdische RT-qPCR-experiment te analyseren. Klik op Chip Run en open de ChipRun. bml-bestand dat door de experimentator is gemaakt.
Er verschijnt een venster met de experimentele details, waaronder de passieve referentie, sonde en pcr-thermisch programma. Klik op het tabblad Chip Explorer op Sample Plate Setup (instellen van voorbeeldplaat) en maak een nieuwe voorbeeldplaatsjabloon. Kopieer en plak de voorbeeldlabels in de softwarespreadsheet volgens het experimentele ontwerp.
Voer de monsternaam en de RNA-concentratie in die voor de standaardmonsters is gebruikt. Wijs nu het voorbeeld toe door op kaart te klikken in het taakmenu en SBS96-Left.dsp te selecteren. Selecteer vervolgens Detailweergaven om deze wijzigingen in het bestand bij te werken en klik op Analyseren.
Selecteer Detector Plate Setup en maak een nieuwe testplaat. Selecteer het juiste containertype en de juiste indeling. Plak de testnamen volgens het experimentele ontwerp en klik op Analyseren.
Klik in het deelvenster analyse-instellingen op Gebruiker en stel de aanpassing in op automatisch. Bekijk nu handmatig elke reactie in de 96x96-chip. Visualiseer de versterkings- en smeltcurven om te bepalen of elke reactie het verwachte qPCR-patroon volgde.
Als de versterkings- of smeltcurve niet overeenkomt met wat wordt verwacht, faalt die reactie dan. Na QC exporteert u de gegevens door bestand te selecteren, op exporteren te klikken en de gegevensset op te slaan als een csv-bestand. Aangezien het geëxporteerde csv-bestand zowel een pass fail matrix als een matrix met onbewerkte CT-waarden heeft, gebruikt u de pass fail matrix om alle mislukte cellen in de dataset te vervangen door NA. Download de recente versie van open Source R-software en download vervolgens de R Studio-toepassing.
Gebruik voor mediane centrering de R-software om de mediane CT-waarde te berekenen die is berekend op basis van alle CT-waarden voor een individueel monster en trek vervolgens alle individuele CT-waarden af van deze mediane waarde om een minus delta CT-waarde te krijgen. Voor de normalisatie van het huishoudgen berekent u de gemiddelde expressie van de huishoudgenen voor elk monster en gebruikt u deze waarde om de individuele CT-waarden af te trekken. Als u een minus delta delta CT-waarde wilt genereren, voert u de code uit in de R-software.
Upload de genormaliseerde gegevensset naar R en analyseer de gegevens met behulp van de schaalfunctie, genereer de geschaalde gegevens en gebruik vervolgens de R-heatmapfunctie of afzonderlijke software om een heatmap te genereren. Als u de gegevensset wilt ordenen voor andere functionaliteit, berekent u de Pearson-correlaties tussen elk gen, gevolgd door de smeltfunctie. Exporteer en upload deze gegevens naar een gencorrelatienetwerksoftware.
Neuronen vertoonden verhoogde expressie van NeuN en microgliale monsters vertoonden significante expressie van de microgliale markers Cd34 en Cx3xr1. De Th+neuronale monsters vertoonden een significant verhoogde expressie van Th in vergelijking met Th-neuronale en microglia monsters. De Th-neuronen vertoonden een significante expressie van Gcg, wat suggereert dat Th-neuronale monsters zijn verrijkt met neuronen die Glp1 als neurotransmitter gebruiken.
Lineaire discriminate-analyse toonde aan dat deze drie celtypen verschillende genexpressieprofielen hadden voor alle 65 genen. Cellulaire subfenotypen van Glp1 verrijkte neuronmonsters door middel van een alcoholontwenningstijdreeks werden weergegeven met behulp van heatmaps. Het subfenotype A, dat het inflammatoire gencluster één sterk tot expressie brengt, neemt in verhouding toe op het acht uur durende ontwenningstijdstip en bereikt een maximum bij 32 uur terugtrekking.
Het inflammatoire subfenotype wordt genormaliseerd om onder controle te blijven door 176 uur terugtrekking. Subfenotype B, dat gaba-receptorgencluster twee sterk tot expressie brengt, toont een algehele onderdrukking in de expressie van dit gencluster door de 176-uurs ontwenningsconditie. De genexpressie van individuele monsters werd gecombineerd tot gemiddelden, zodat de expressie van genclusters en de eiwitlocatie van dat gentranscript gedurende de tijdreeks konden worden gevisualiseerd.
Deze techniek kan worden toegepast op elk biologisch systeem of weefsel om de cellulaire reactie op een ziekte of een verstoring te begrijpen. Dat is om de moleculaire respons bij eencellige resolutie te ontcijferen met betrekking tot de ruimtelijke en de anatomische architectuur van het weefsel.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van laser capture microdissectie en microfluïdische RT-qPCR om transcriptomen in individuele neuronen en glia te analyseren. Er wordt nadruk gelegd op de hoge sensitiviteit en specificiteit van de methode, die ons begrip van psychiatrische aandoeningen in verband met neuro-inflammatie kan verbeteren, in het bijzonder in de context van verslaving.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Transcriptionele Analyse
- Psychiatrische Stoornissen
Achtergrond
- Het begrijpen van RNA-expressiepatronen in neuronen en gliacellen is essentieel voor het ontrafelen van psychiatrische aandoeningen.
- Eerdere methoden misten zowel anatomische ruimtelijke als moleculaire specificiteit.
- Neuro-inflammatie is betrokken bij de antireward-hypothese van verslaving.
Doel van de studie
- Om een gevoelige methode te ontwikkelen voor het vastleggen van genexpressieprofielen met resolutie op enkelcelniveau.
- Om te analyseren hoe deze moleculaire veranderingen gerelateerd zijn aan gedragsmatige reacties bij psychiatrische aandoeningen.
- Om de rol van neuro-inflammatie in verslavingsgerelateerde mechanismen te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Microfluïdische RT-qPCR werd ingezet, wat high-throughput datacollectie uit individuele cellen mogelijk maakte.
- Individuele cellen werden geïsoleerd uit hersenweefsel na de oogst voor mRNA-preparatie en analyse.
- Gedetailleerde protocollen voor het primen van de chip, datacollectie en analyse werden geïmplementeerd.
- Genexpressiegegevens werden gevalideerd en geanalyseerd met behulp van statistische software.
Belangrijkste resultaten
- Neuronen vertoonden een verhoogde expressie van NeuN, terwijl microglia een significante expressie van Cd34 en Cx3xr1 vertoonden.
- Verschillende subtypes werden geïdentificeerd op basis van genexpressieprofielen, met name als reactie op onthouding en neuroinflammatie.
- Belangrijke conclusies over genclusters en hun regulatie tijdens onthoudingsstress werden getrokken uit heatmap-analyses.
Conclusies
- De studie demonstreert dat de combinatie van deze methodologieën zorgt voor een verrijkt inzicht in celtypespecifieke reacties op neuro-inflammatie.
- De verkregen inzichten kunnen helpen bij de ontwikkeling van gerichte therapeutische benaderingen voor psychiatrische stoornissen waarbij verslaving een rol speelt.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Single-cell genexpressieprofilering met anatomische specificiteit maakt mechanische risicoreductie mogelijk bij de ontdekking van neuropsychiatrische targets, in het bijzonder voor verslavings- en antireward-paden. Deze benadering biedt inzicht met een hoge resolutie in neuro-inflammatoire drijvers, wat de voorspellende betrouwbaarheid ondersteunt op het snijvlak van moleculaire pathologie en gedragsfenotypes. De integratie van deze methoden in vroege discovery-pipelines verbetert de triage van het portfolio en de translationele continuïteit voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar neuro-inflammatoire en antireward-hypothesen mogelijk met resolutie op single-cell niveau.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door genexpressie te koppelen aan anatomische en fenotypische specificiteit.
- Faciliteert mechanische risicoreductie voor CNS-targets die betrokken zijn bij verslaving en onthoudingsverschijnselen.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het verder ontwikkelen van neuropsychiatrische targets.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde cellulaire systemen voor voor downstream transcriptomische en fenotypische screening.
- Levert kwantitatieve, reproduceerbare genexpressie-outputs voor assay-standaardisatie.
- Maakt high-throughput analyse van gennetwerken over gedefinieerde celtypen mogelijk.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van effecten van verbindingen op neuroinflammatoire pathways.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt moleculaire bevindingen aan ziekterelevante neuroanatomische systemen in verslavingsmodellen.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van neuro-inflammatoire biomarkers.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor de voortgang van therapeutische programma's voor het centrale zenuwstelsel.
- Verbeterde ontwikkeling van translationele biomarkers door genexpressie te koppelen aan onthoudingsfenotypes.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door middel van high-throughput, anatomisch precieze genexpressieanalyse in weefsels van het centrale zenuwstelsel.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking voor neuro-inflammatie en antireward-mechanismen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve genexpressiegegevens voor assay-ontwikkeling en compound-screening.
- Analytics: Genereert schaalbare datasets voor netwerkanalyse, heat mapping en statistische vergelijking van cellulaire fenotypes.
- Translational Research: Verbindt moleculaire signaturen aan ziekterelevante onthoudingsstaten en biomarker-afstemming.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor single-cell transcriptomics in diverse CNS- en ziektemodellen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare workflows voor genexpressie op single-cell niveau.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk in neuropsychiatrisch R&D.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van CNS-therapeutische kandidaten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in laser capture microdissectie en microfluidische RT-qPCR-platformen.
- Vereist een robuuste analytische infrastructuur voor high-throughput gegevensverwerking en netwerkanalyse.
- Maakt cross-team standaardisatie van monstervoorbereiding en datanormalisatieprotocollen noodzakelijk.
- Aanpasbaar aan diverse CNS-weefsels en ziektemodellen mits适当 geoptimaliseerd.
- Afhankelijk van toegang tot gespecialiseerde instrumentatie en bioinformatische ondersteuning.
