Uitbreiding van het begrip van de tumormicro-omgeving met behulp van massaspectrometrie Beeldvorming van formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefselmonsters

Deze protocollen maken kwantificering van de resolutie van één cel, co-expressie van markers en een speciale analyse mogelijk met behulp van een formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde en vers ingevroren weefselmonsters om de rollen van immuuncellen bij kanker op te helderen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel dat de gelijktijdige karakterisering van een 40 marker op een enkele weefselsectie vergemakkelijkt, waardoor de structuur van het weefsel in de monsters op grote schaal behouden blijft. De kritieke stap is antilichaamoptimalisatie en -validatie.

Als u de stap niet voltooit, kan dit leiden tot afbeeldingen van lage kwaliteit die een behoud van reproduceerbare gegevens en resultaten van hoge kwaliteit in gevaar kunnen brengen. Begin met het afdraaien van alle antilichaamhoudende buisjes op 10.000 x G gedurende vijf minuten, voeg individuele antilichamen toe aan de blokkerende buffer en meng goed. Verstoor de onderkant van de antilichaambuis niet bij het pipetteren ervan.

Filter het antilichaampaneel door een centrifugaalfilterapparaat van 0,1 micrometer met 100 microliter blokkeringsbuffer vooraf te bevochtigen. Draai het filter gedurende twee minuten op 10.000 x G en verwijder de blokkerende bufferdoorstroming met een pipet. Breng vervolgens het antilichaampaneel over in een spinkolom en draai het filter gedurende twee minuten op 10.000 x G.

Gooi de spinkolom weg en gebruik de doorstroom als het gefilterde antilichaampaneel. Voor de antilichaamkleuring verwijdert u de blokkerende buffer van de dia's door elke dia op zijn kant te kantelen en de randen zachtjes tegen een taakwisser te tikken. Plaats de dia's in een vochtkamer en voeg 100 tot 200 microliter antilichaam master mix toe aan het weefsel.

Voeg positieve en negatieve controleglaasjes toe aan de kleuringsbatch en incubeer de dia's 's nachts bij 4 graden Celsius. Om het instrument in te stellen, logt u in op de besturingssoftware en klikt u op Wake Up als het instrument in de slaapstand staat. Klik op Exchange Sample om een dia te laden en klik vervolgens op Doorgaan om de deur te openen.

Plaats de schuif in de laadsleuf met een monster naar boven gericht en het label aan de rechterkant, klik op Doorgaan om de deur te sluiten. Selecteer het project en selecteer vervolgens de dianaam voor het geladen voorbeeld. Visualiseer het panoramische beeld op het optische afbeeldingsvenster van de dia voor het gezichtsveld of de FOV-selectie, klik op het menu Modus en selecteer Secundaire elektronendetector, klik vervolgens op het menu Beeldmodus en kies QC 300 micrometer.

Klik op Jog Stage om de FOV-locatie te regelen en klik vervolgens op de pijlen om te navigeren en de positie van de FOV te selecteren. Klik op FOV toevoegen, stel 400 micrometer bij 400 micrometer in als veldgrootte en selecteer Fijn als de imaging-modus en 1 milliseconde dwell time, klik op Bevestigen. Nadat u een FOV-lijst hebt gemaakt, gaat u verder met de beeldfocus en past u de stigmatie aan door de straal naar een weefselgebied te verplaatsen dat niet in beeld wordt gebracht.

Pas de parameters aan totdat een duidelijk centraal beeld is verkregen, klik op Start Run. De verkregen afbeeldingen worden automatisch geüpload en opgeslagen in de webgebaseerde toepassing voor afbeeldingsbeheer. De hier getoonde matrix beschrijft het percentage overspraak afgeleid van de sondezuiverheid en oxiden.

Hier geven blauwe vakjes aan groter dan of gelijk aan 0,5% overspraak en duidelijke vakjes duiden op minder dan 0,5% overspraak. Voor de Mass-tags worden hier sondes weergegeven die ten minste 0,5% overspraak hebben bijgedragen aan geen kanalen, één of twee kanalen of meer dan twee kanalen. Massakanalen die ten minste 0,5% overspraak ontvangen van geen sondes, een of twee sondes of meer dan twee sondes worden ook getoond.

De representatieve kleuringsbeelden in verschillende weefsels zoals longadenocarcinoom, niet-neoplastische nier en amandel zijn hier afgebeeld. Een afbeelding van een amandelweefselsectie gekleurd met behulp van deze techniek en gevisualiseerd met behulp van een digitaal beeldanalysesoftwareprogramma van derden voordat het wordt gefilterd en gecorrigeerd, wordt hier gepresenteerd. De afbeelding van dezelfde sectie onder dezelfde omstandigheden na filter- en correctiestappen wordt hier weergegeven.

Deze methode genereert afbeeldingen die kunnen worden geüpload naar digitale beeldanalysesoftware van derden, waardoor uitgebreide analyse mogelijk is, zoals weefselcompartimentering, celsegmentatie, markerco-expressie, evenals burenanalyse en analyse op afstand. Zeer multiplex beeldvormingsmethoden zijn beschikbaar door middel van onderzoek. Door verschillende panelen te bouwen, kunnen onderzoekers kanker, normale, paraneoplastische, inflammatoire en infectieuze monsters onderzoeken.