Name: Intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer intestinale epitheelregeneratie na gammabestraling bij muizen met lineage-tracing en histologische technieken. Dit model volgt celgedrag en helpt onderzoekers het herstelproces te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de Stony Brook Cancer Center Histology Research Core erkennen voor deskundige hulp bij de voorbereiding van weefselmonsters en de afdeling Laboratory Animal Resources aan de Stony Brook University voor hulp bij de verzorging en behandeling van dieren. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK124342 toegekend aan Agnieszka B. Bialkowska en DK052230 aan Dr. Vincent W. Yang.

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dit protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar stralingsschademodel. Het maakt de nauwkeurige analyse mogelijk van de veranderingen in het darmepitheel in de loop van 7 dagen na het letsel. Belangrijk is dat de geselecteerde tijdstippen cruciale stadia van letsel weerspiegelen en worden gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de darm (letsel, apoptose, regeneratie en normalisatiefasen)60. Dit bestralingsmodel is vastgesteld en zorgvuldig beoordeeld, wat een geschikte manifestatie van l...

Het menselijke darmepitheel zou ongeveer het oppervlak van een half badmintonveld bedekken als hetvolledig vlak 1 zou worden geplaatst. In plaats daarvan wordt deze enkele cellaag die mensen scheidt van de inhoud van hun darmen samengeperst in een reeks vingerachtige projecties, villi en inkepingen, crypten die het oppervlak van de darmen maximaliseren. De cellen van het epitheel differentiëren langs een crypte-villusas. De villus bestaat voornamelijk uit voedingsabsorberende enterocyten, slijmafscheidende bokaalcellen en de hormoonproducerende entero-endocriene cellen, terwijl de crypten voornamelijk bestaan uit defensine-producerende Paneth-cellen, actieve en reservestamcellen en voorlopercellen 2,3,4,5. Bovendien genereert de bidirectionele communicatie die deze cellen hebben met de stromale en immuuncellen van het onderliggende mesenchymale compartiment en de microbiota van het lumen een complex netwerk van interacties dat de darmhomeostase handhaaft en van cruciaal belang is voor herstel na letsel 6,7,8.
Het darmepitheel is het snelst zelfvernieuwende weefsel in het menselijk lichaam, met een omloopsnelheid van 2-6 dagen 9,10,11. Tijdens homeostase delen actieve stamcellen aan de basis van darmcrypten (crypt base columnar cells), gekenmerkt door de expressie van leucine-rijke repeat-bevattende G-eiwit gekoppelde receptor 5 (LGR5), zich snel en leveren voorlopercellen die differentiëren in alle andere intestinale epitheellijnen. Vanwege hun hoge mitotische snelheid zijn actieve stamcellen en hun directe voorlopers echter bijzonder gevoelig voor gammastralingsschade en ondergaan ze apoptose na bestraling 5,12,13,14. Na hun verlies ondergaan reservestamcellen en niet-stamcellen (subpopulatie van voorlopers en sommige terminaal gedifferentieerde cellen) in darmcrypten activering en vullen ze het basale cryptecompartiment aan, dat vervolgens celpopulaties van de villi kan reconstitueren en zo het darmepitheel kan regenereren15. Met behulp van afstammingstechnieken hebben meerdere onderzoeksgroepen aangetoond dat reserve (rustige) stamcellen in staat zijn om regeneratie te ondersteunen bij het verlies van actieve stamcellen 13,16,17,18,19,20,21,22. Deze cellen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van polycomb complex protein 1 oncogen (Bmi1), muis telomerase reverse transcriptase gen (mTert), Hop homeobox (Hopx), en leucine-rijke repeat protein 1 gen (Lrig1). Bovendien is aangetoond dat niet-stamcellen in staat zijn om darmcrypten aan te vullen bij letsel 23,24,25,26,27,28,29,30,31. In het bijzonder is aangetoond dat voorlopers van secretoire cellen en enterocyten dedifferentiatie ondergaan bij letsel, terugkeren naar stamachtige cellen en de regeneratie van het darmepitheel ondersteunen. Recente studies hebben cellen geïdentificeerd die meerdere markers tot expressie brengen die de capaciteit bezitten om stamachtige kenmerken te verwerven bij letsel (zoals DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 +) 32,33,34,35,36. Verrassend genoeg toonden Yu et al. aan dat zelfs volwassen Paneth-cellen (LYZ +) kunnen bijdragen aan darmregeneratie37. Bovendien, naast het veroorzaken van apoptose van intestinale epitheelcellen en het verstoren van de epitheelbarrièrefunctie, resulteert bestraling in dysbiose van de darmflora, immuuncelactivering en het initiëren van een pro-inflammatoire reactie, en de activering van mesenchymale en stromale cellen38,39.
Gammastraling is een waardevol therapeutisch hulpmiddel bij de behandeling van kanker, vooral voor colorectale tumoren40. Bestraling beïnvloedt echter de intestinale homeostase aanzienlijk door schade aan de cellen te veroorzaken, wat leidt tot apoptose. Blootstelling aan straling veroorzaakt meerdere verstoringen die het herstel van een patiënt vertragen en wordt gekenmerkt door slijmvliesletsel en ontsteking in de acute fase en diarree, incontinentie, bloedingen en buikpijn op lange termijn. Dit arsenaal aan manifestaties wordt gastro-intestinale stralingstoxiciteit genoemd. Bovendien kan door straling geïnduceerde progressie van transmurale fibrose en/of vasculaire sclerose zich pas jaren na de behandeling manifesteren38,41. Gelijktijdig met het letsel zelf induceert straling een herstelreactie in darmcellen die signaalroutes activeert die verantwoordelijk zijn voor het initiëren en orkestreren van regeneratie42. Door straling geïnduceerde dunne darmziekte kan afkomstig zijn van bekken- of abdominale radiotherapie die wordt toegediend aan andere organen (zoals baarmoederhals, prostaat, pancreas, rectum)41,43,44,45,46. Intestinale bestralingsschade is dus een belangrijk klinisch probleem en een beter begrip van de resulterende pathofysiologie zal waarschijnlijk de ontwikkeling van interventies bevorderen om de gastro-intestinale complicaties geassocieerd met radiotherapie te verlichten. Er zijn andere technieken die het mogelijk maken om het regeneratieve doel van het darmepitheel te onderzoeken, afgezien van straling. Transgene en chemische muizenmodellen om ontstekingen en de regeneratie daarna te bestuderen zijnontwikkeld 47. Dextran natriumsulfaat (DSS) induceert ontsteking in de darm en leidt tot de ontwikkeling van kenmerken die vergelijkbaar zijn met die van inflammatoire darmziekte48. Een combinatie van DSS-behandeling met de pro-carcinogene verbinding azoxymethaan (AOM) kan leiden tot de ontwikkeling van colitis-geassocieerde kanker48,49. Ischemie reperfusie-geïnduceerde schade is een andere methode die wordt gebruikt om het regeneratieve potentieel van het darmepitheel te bestuderen. Deze techniek vereist ervaring en chirurgische kennis50. Bovendien veroorzaken de bovengenoemde technieken andere soorten letsel dan straling en kunnen ze leiden tot de betrokkenheid van verschillende regeneratiemechanismen. Bovendien zijn deze modellen tijdrovend, terwijl de stralingstechniek vrij kort is. Onlangs zijn in vitro methoden met behulp van enteroïden en colonoïden gegenereerd uit de darm en dikke darm gebruikt in combinatie met stralingsletsel om de mechanismen van darmregeneratie te bestuderen51,52. Deze technieken geven echter niet volledig de balans weer van het orgel dat ze modelleren53,54.
Het gepresenteerde protocol omvat de beschrijving van een muizenmodel van gammastralingsschade in combinatie met een genetisch model dat, na behandeling met tamoxifen, het traceren van afstammingslijnen afkomstig van de reservestamcelpopulatie (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Dit model maakt gebruik van een 12 Gy totale lichaamsbestraling, die voldoende darmletsel veroorzaakt om reservestamcellen te activeren, terwijl het daaropvolgende onderzoek naar het regeneratieve vermogen van de darm binnen 7 dagen na letsel mogelijk is55.

<table><tbody><tr><td>1 mL spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td>-</td></tr><tr><td>16G Herbruikbare voedingsnaalden voor kleine dieren: recht</td><td>VWR</td><td>20068-630</td><td>-</td></tr><tr><td>27G x 1/2" naald</td><td>BD</td><td>305109</td><td>-</td></tr><tr><td>28G x 1/2" Monoject 1mL insulinespuit</td><td>Covidien</td><td>1188128012</td><td>-</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc284628A</td><td>10 mg/mL in steriele DMSO:water (1:4 v/v), aliquoteer en bewaar in -20°C</td></tr><tr><td>Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213</td><td>-</td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #:006148</td><td></td></tr><tr><td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #:010531</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine Fractie V, heat shock</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Kip anti-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 beeldvormingskit, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10638</td><td>-</td></tr><tr><td>Kikkerolie</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267</td><td>-</td></tr><tr><td>Decloaking Chamber</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012</td><td>-</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td>lichtgevoelig</td></tr><tr><td>DNase-vrije proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>C10618H</td><td>25x verdund in DPBS</td></tr><tr><td>Ezel anti-kip AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td>-</td></tr><tr><td>Eosine</td><td>Fisher Scientific</td><td>S176</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop Nikon Eclipse 90i Helder en fluorescent licht, met objectieven: 10X, 20X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aqueous Montage Medium</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Cell 40 Exactor</td><td>Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0,759 Gy min-1</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline Oplossing, Gill No. 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Rotary Microtome van Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-900-668</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydraat (bis-Benzimide)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3569</td><td>verdunning 1:1000</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide Oplossing, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-603-252</td><td>-</td></tr><tr><td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Carbonaat (Poeder/Gecertificeerd ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>L119-500</td><td>0,5g/1L dH2O</td></tr><tr><td>Luer-Lok Spuit steriele, eenmalig gebruik, 10 mL</td><td>VWR</td><td>89215-218</td><td>-</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1675398</td><td>-</td></tr><tr><td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Azijnzuur ACS Grade</td><td>Capitol Scientific</td><td>AAP-281000ACSCSLT</td><td>-</td></tr><tr><td>Konijn anti-Ki67</td><td>BioCare Medical</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Montage Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Industries Incubator-Genie voor het bakken van slides op 65 graden</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat Dihydraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen Dissectieset</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus micro slides [maat: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>&nbsp;48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>30 mg/mL in steriele kikkerolie, bij voorkeur vers of kortdurende opslag in -20°C, lichtgevoelig</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 24-Slide Houders met Afneembare Handgreep</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Handmatige Slide Kleuring Set</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Kleuring Schaal, Groen met Deksel</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Kleuring Schaal, Wit met Deksel</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Unisette Verwerking Cassettes</td><td>VWR</td><td>87002-292</td><td>-</td></tr><tr><td>VWR Micro Dekglazen</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Het darmepitheel bestaat uit een enkele laag cellen, maar bevat meerdere soorten terminaal gedifferentieerde cellen, die worden gegenereerd door de actieve proliferatie van darmstamcellen op de bodem van darmcrypten. Tijdens gebeurtenissen van acuut darmletsel ondergaan deze actieve darmstamcellen echter celdood. Gammabestraling is een veel gebruikte colorectale kankerbehandeling, die, hoewel therapeutisch effectief, de bijwerking heeft van het uitputten van de actieve stamcelpool. Inderdaad, patiënten ervaren vaak gastro-intestinaal stralingssyndroom tijdens het ondergaan van radiotherapie, deels als gevolg van actieve stamceluitputting. Het verlies van actieve intestinale stamcellen in darmcrypten activeert een pool van typisch rustige reserve darmstamcellen en induceert dedifferentiatie van secretoire en enterocytvoorlopercellen. Zonder deze cellen zou het darmepitheel niet in staat zijn om te herstellen van radiotherapie en andere dergelijke belangrijke weefselbeledigingen. Nieuwe ontwikkelingen in lineage-tracing-technologieën maken het mogelijk om de activering, differentiatie en migratie van cellen tijdens regeneratie te volgen en zijn met succes gebruikt om dit in de darm te bestuderen. Deze studie heeft tot doel een methode weer te geven voor de analyse van cellen in het darmepitheel van de muis na stralingsletsel.

Het gebruik van 12 Gy total-body bestraling (TBI) in combinatie met murine genetische afstamming tracing maakt een grondige analyse van de gevolgen van stralingsletsel in de darm mogelijk. Om te beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizen kregen een enkele tamoxifeninjectie, die een verbeterde gele fluorescerende eiwit (EYFP) expressie induceert binnen een Bmi1 + reservestamcelpopulatie. Twee dagen na de tamoxifeninjectie ondergingen de muizen bestraling of schijnbestraling. Drie uur...

Het maagdarmkanaal is een van de meest gevoelige organen voor letsel bij radiotherapeutische kankerbehandelingen. Het is tegelijkertijd een orgaansysteem met een van de hoogste regeneratieve capaciteiten na dergelijke beledigingen. Het gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om het regeneratieve vermogen van het darmepitheel te bestuderen.

Intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Gammabestraling is een veel gebruikte behandeling voor darmkanker. En hoewel het therapeutisch effectief is, heeft het negatieve effecten op het maagdarmkanaal. Het gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om de activering, differentiatie en migratie van cellen tijdens regeneratie na stralingsletsel te bestuderen.Dit protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar stralingsschademodel. Belangrijk is dat dit model het mogelijk maakt om het lot van darmcellen na letsel te volgen en zo een beter begrip biedt van de regeneratieve capaciteit van specifieke celsubpopulatie. Deze techniek kan verschillende afstammingsmodellen gebruiken om het realtime gedrag en de interactie van verschillende subpopulaties van cellen na verwonding te bestuderen.Kleine wijzigingen in dit protocol moeten het mogelijk maken om de relaties tussen microbiota en verschillende epitheel-, stromale en immuuncelpopulaties bij stralingsschade te onderzoeken. Om te beginnen, resuspendeerde tamoxifen poeder in steriele maïsolie in een concentratie van 30 microgram per microliter. Soniceer gedurende drie minuten in 30 seconden aan-uitcycli met 60% amplitude.Meng door rotatie in het donker gedurende een uur op kamertemperatuur. Bereid vervolgens EdU voor door steriele DMSO toe te voegen aan EdU-poeder. Voeg 1/5 van het totale volume toe en voeg langzaam het resterende volume steriel ultrapuur water toe.Wanneer volledig opgelost, aliquot en bewaren bij 20 graden Celsius. Bereid reagentia voor weefselverzameling en fixatie, zoals 70% ethanol in water, DPBS gekoeld tot vier graden Celsius, Bouin's fixatieve buffer en 10% gebufferde formaline. Bereid vervolgens de benodigde apparatuur voor, zoals een muizendissectiekit, petrischalen, een 16-gauge maagnaald bevestigd aan een spuit van 10 milliliter en histologische cassettes.Twee dagen voor blootstelling aan gammastraling bereiden de proefdieren voor op tamoxifeninjectie. Weeg elk dier en bereken de vereiste dosering. Desinfecteer de buikstreek met 70% ethanol.Dien vervolgens intraperitoneaal een enkele dosis tamoxifen toe met behulp van een naald van 27 gauge die is bevestigd aan een spuit van één milliliter om cre-gemedieerde recombinatie te induceren. Observeer dieren gedurende de komende 48 uur om mogelijke tamoxifentoxiciteit uit te sluiten. Breng de dieren na 48 uur over naar de doorstralingsruimte.Desinfecteer de monsterkamer in de gammabestralingsinstallatie met 70% ethanoloplossing. Plaats de absorberende mat en de dieren in de monsterkamer. Plaats het deksel en sluit de kamer.Programmeer de gammabestraling om dieren bloot te stellen aan 12 grijze totale lichaamsbestralingen. Draai vervolgens de toets naar de startpositie en druk op start om de belichting te starten. Verlaat de kamer voor actieve belichtingstijd.Nadat de vooraf ingestelde tijd is verstreken, stopt het apparaat automatisch en begint het te piepen. Schakel het apparaat uit door de sleutel in de stopstand te draaien. Open de monsterkamer en verwijder het deksel.Breng de dieren over in de kooi en desinfecteer de monsterkamer met 70% ethanol. Breng de dieren terug naar de conventionele huisvestingsruimte en observeer hun toestand na de behandeling. Controleer elke dag het gewicht van de dieren.Drie uur voor de geplande euthanasie, desinfecteer de buikstreek en injecteer de muizen intraperitoneaal met 100 microliter EdU-stamoplossing met behulp van een 28-gauge insulinespuit. Na het euthanaseren van het dier, verzamelt u de proximale darmen op verschillende tijdstippen na de bestraling. Ontleed het proximale deel van de dunne darm en verwijder aangehechte weefsels.Spoel het weefsel met koude DPBS met behulp van een 16-gauge rechte voedingsnaald bevestigd aan een 10-milliliter spuit en fixeer het weefsel met de fixatieve buffer van Bouin. Snijd de darmen in de lengterichting open en rol de proximale darmen met behulp van de Swiss-roll-techniek. Plaats de weefsels in een histologische cassette in een container met 10% gebufferde formaline en incubeer het gedurende 24 tot 48 uur bij kamertemperatuur.Breng na incubatie de histologische cassettes over naar 70% ethanol en sluit het weefsel in paraffine in. Plaats de histologische cassettes na inbedding minstens een uur op ijs. Snijd vervolgens horizontale secties van vijf micron dik met behulp van een microtoom.Breng de weefselsecties over in een waterbad dat is opgewarmd tot 45 graden Celsius en plaats de secties op geladen dia's. Laat de dia's een nacht op kamertemperatuur op een rek liggen om te drogen. Hematoxyline- en eosinebeelden van dunne darmmonsters toonden een homeostatisch darmepitheel op nul uur, gevolgd door het verlies van cellen in cryptecompartimenten tijdens de apoptotische fase.Dit werd gevolgd door de regeneratieve fase waarin zeer proliferatieve cellen de crypten bevolkten, wat leidde tot de normalisatiefase op dag zeven. Afstammingstracering door EYFP toonde aan dat tijdens homeostase de cellen afkomstig van Bmi1-positieve reservestamcellen beperkt waren tot de plus vier tot plus zes posities in crypten. EdU- en Ki-67-kleuring toonde normale intestinale homeostase bij schijnbestraalde muizen, die zich uitstrekten van actieve stamcellen tot de transitversterkende zone.Tijdens de apoptotische fase nam het aantal EYFP-positieve cellen af, vergezeld van een verlies van proliferatieve cellen veroorzaakt door stralingsschade. In de regeneratieve fase werd activering van reservestamcellen en snelle proliferatie van Bmi1-positieve cellen waargenomen. Verdere proliferatie en migratie herstelden de integriteit van het darmepitheel.TUNEL-kleuring toonde aan dat apoptotische cellen afwezig zijn tijdens homeostase. Een toename van TUNEL-kleuring werd laat in de apoptotische fase waargenomen. Tijdens de regeneratieve fase nam de TUNEL-kleuring gestaag af in de regenererende crypten en was bijna afwezig toen de crypten normaliseerden.Deze techniek kan worden gecombineerd met RNA-sequencing, single-cell RNA-sequencing, fluorescentie-geactiveerde celsortering of proteomische analyse om meer diepgaande kennis te vergaren over de rol van specifieke cellijnen tijdens darmregeneratie na letsel. De onderzoekers kunnen de interacties tussen microbiota en epitheliale, stromale en immuuncelpopulaties in darmregeneratie onderzoeken om het begrip van het regeneratieve vermogen van het darmepitheel uit te breiden.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Acute nierschade (AKI) bij de mens is een veel voorkomend klinisch probleem wordt veroorzaakt door schade aan de epitheliale cellen die de nieren nefronen bevatten, en de AKI wordt geassocieerd met een hoge sterfte van...

Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

Een effectieve methode voor het enten van weefsel van gedefinieerde en consistente grootte tussen planaria wordt beschreven. Ook inbegrepen is een beschrijving van de immobilisatie technieken gebruikt voor transplantatie kan worden aangepast in samenhang met lood schilden de gedeeltelijke bestraling van levende dieren.

Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie

We presenteren een protocol om te onderzoeken de Overspraak tussen Caco-2 X-Vleug-bestraalde en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Het protocol start met Caco-2 bestraling en opzet van de co cultuur met PBMC; trans-epitheliale elektrische weerstand is vervolgens regelmatig gedurende 48 h en westelijke vlek uitgevoerd in zowel Caco-2 en PBMC gemeten.

Een co cultuur methode te onderzoeken de Overspraak tussen X-ray bestraald Caco-2 cellen en PBMC

Hier presenteren we een protocol voor het vaststellen van belangrijke eindpunten en proliferatieve markers van kleine intestinale letsel en compenserende hyperproliferatie met behulp van een model van chemotherapie-geïnduceerde mucositis. We demonstreren de detectie van prolifererende cellen met behulp van een celcyclus specifieke marker en met behulp van kleine intestinale gewicht, crypte diepte, en villus hoogte als eindpunten.

Belangrijke eindpunten en proliferatieve markers om kleine darm letsel en aanpassing te beoordelen met behulp van een muis model van chemotherapie-geïnduceerde Mucositis

Organoids ontwikkeld van muis borstklieren werden bestraald en gekarakteriseerd om epitheel eigenschappen en interacties met immuun cellen te beoordelen. Bestraalde organoids kan worden gebruikt om cel-cel interacties beter te evalueren die tot de rekrutering van de tumor cel in bestraald normaal weefsel kunnen leiden.

Groei en karakterisering van bestraalde Organoids van de borstklieren

Met behulp van driedimensionale organotypic culturen te visualiseren morfologie en functionele markers van speekselklieren kunnen nieuwe inzichten in de mechanismen van weefselbeschadiging na straling. Hier beschreven is een protocol bij sectie, cultuur, bestralen, vlek, en beeld 50 – 90 μm dikke speekselklier secties voorafgaand aan en na blootstelling aan ioniserende straling.

De behandeling van de straling van Organotypic culturen van submandibulaire en Parotis speekselklieren modellen sleutel in vivo kenmerken

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Hier presenteren we een methode om beelden van de darm te verkrijgen bij laser-geïnduceerde verwonding. Door de darm van de muis bloot te stellen aan een multifotonenlaser, wordt het verlies van een enkele of meerdere crypt(en) lokaal geïnduceerd. Door het beschadigde gebied gedurende maanden herhaaldelijk in beeld te brengen, wordt de real-time dynamiek van darmherstel vastgelegd.

Laserablatie en intravitale microscopie om intestinale remodellering te bestuderen

We beschrijven een protocol dat de isolatie van murine coloncrypten beschrijft voor de ontwikkeling van 3-dimensionale colonoïden. De gevestigde colonoïden kunnen vervolgens terminaal worden gedifferentieerd om de cellulaire samenstelling van het gastheerepitheel weer te geven voordat ze een ontstekingsuitdaging krijgen of worden gericht op het vaststellen van een epitheliale monolaag.

Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking in vitro op gevestigde murine colonoïden

Immunofluorescerende beeldvorming wordt beperkt door het vermogen om complexe, tijdsafhankelijke biologische processen in slechts één momentopname in de tijd waar te nemen. Deze studie schetst een live-imaging-benadering die wordt uitgevoerd op nauwkeurig gesneden plakjes submandibulaire klier van muizen. Deze aanpak maakt de real-time observatie mogelijk van cel-cel interacties tijdens homeostase en de processen van regeneratie en herstel.

Ondervraging van cel-celinteracties in de speekselklier via ex vivo beeldvorming van levende cellen

Leer intestinale epitheelregeneratie na gammabestraling bij muizen met lineage-tracing en histologische technieken. Dit model volgt celgedrag en helpt onderzoekers het herstelproces te begrijpen.

Intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling

Meer video's verkennen