Een semi-geautomatiseerde en reproduceerbare biologische methode om calciumdepositie in vitro te kwantificeren

Onze methode maakt het mogelijk om de verkalkingsneiging van patiëntmonsters te meten met behulp van menselijke vasculaire gladde spiercellen. Dit zal helpen bij het stimuleren van onderzoek naar vasculaire verkalkingsstoornissen, wat helpt bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Deze techniek maakt gebruik van een fluorescerende detectie, die de gevoeligheid verhoogt en het mogelijk maakt om monsters in de loop van de tijd te meten, waardoor de behoefte aan replicaties wordt verminderd en de robuustheid wordt verhoogd.

Om te beginnen kweek menselijke vasculaire gladde spiercellen op ongecoate celkweekkolven bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Splits de cellen bij het bereiken van 70 tot 90% confluency. Om te splitsen, wast u de HVSMC's twee keer met PBS.

Voeg trypsine toe en incubeer gedurende 2 tot 5 minuten bij 37 graden Celsius. Rem de trypsinereactie door een serum met medium toe te voegen. Centrifugeer de cellen gedurende 4 minuten bij 350 RCF en resuspenseer de pellet in een onderhoudsmedium.

Nadat de cellen zijn voorbereid op een splitsing zoals aangetoond, telt en zaait u de cellen in een 48-well plaat om het verkalkingsexperiment te starten. Na nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide, wast u de cellen voorzichtig twee keer met PBS en zuigt u zorgvuldig alle resterende PBS op na de tweede wasbeurt. Voeg voorzichtig het verkalkingsmedium toe en incubeer verder bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Controleer dagelijks met een lichtmicroscoop totdat verkalking optreedt. Als u verkalking via imaging wilt detecteren, opent u de software en selecteert u Protocollen en Nieuw maken. Selecteer Procedure en klik op Temperatuur instellen.

Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius en het verloop op 1 graad Celsius in het pop-upvenster en klik op OK. Selecteer het type plaat naar keuze in het vervolgkeuzemenu. Voeg de afbeeldingsstap toe door op Afbeelding te klikken. Selecteer de omgekeerde imager en klik op OK. Voeg drie beeldkanalen toe en stel ze in op DAPI, RFP en Bright Field.

Vink het vakje Montage aan en stel het gewenste aantal en de gewenste locatie van de afbeeldingen in. Wijzig de overlap om een betere dekking van elke put weer te geven. Selecteer welke putten moeten worden afgebeeld.

Er wordt een nieuw venster geopend waarin de bronnen van belang kunnen worden geselecteerd. Klik op Focusopties om de focusmodus in te stellen. Er wordt een nieuw venster geopend.

Stel elk kanaal afzonderlijk in. Gewoonlijk zijn putten automatisch gericht op het DAPI-kanaal. Stel alle andere kanalen in op Vaste brandpuntshoogte vanaf het eerste kanaal en stel in door op OK te klikken. Sluit het venster.

Start de stappen voor het vooraf instellen van gegevensreductie door op Gegevensreductie te klikken en Afbeeldingsvoorbewerking te selecteren. Accepteer de standaardinstellingen door OK te selecteren. Stel een stap in om de cellen te tellen door Cellulaire analyse te selecteren. Selecteer TsF DAPI-afbeeldingen in het vervolgkeuzemenu kanaal.

Stel verdere details in nadat de beeldvorming is uitgevoerd. Bereid de analyse van het RFP-signaal voor door Statistieken te selecteren in het pop-upvenster Labelstap en selecteer TsF RFP als invoerkanaal. Vink de selectievakjes Bovenwaarde en Onderwaarde aan.

Vink het vakje voor Totale oppervlakte in de onderste lijst aan. Selecteer Geen in de kolom Kleureffect. Klik in het pop-upvenster op Aangepast en vink het vakje Achtergrond aan.

Druk op OK. Voor een eerlijke uitlezing normaliseert u het RFP-signaal per cel door op Ratio aan de linkerkant te drukken. Selecteer in het pop-upvenster RFP Quantification Total Area. Voor Gegevensinvoer 1 in het vervolgkeuzemenu en selecteert u Celgetal als gegevensinvoer 2.

Selecteer ten slotte een nieuwe gegevenssetnaam en druk tweemaal op OK. Selecteer Kleureffect zoals eerder gedemonstreerd en klik OK.In de linkerbovenhoek, selecteer Bestand en sla het bestand op als een Protocol-bestandstype. Noteer waarnemingen voor elk tijdstip nadat het eerste geval van verkalking optreedt.

Druk op Nu lezen in de opstartsoftware en klik op Bestaand protocol. Selecteer het protocol dat in de vorige stap is gemaakt. Het programma zal vragen om het experiment op te slaan.

Dit kan in dit stadium of later handmatig worden gedaan door linksboven op de knop Opslaan te klikken. Een pop-upvenster vraagt om te wachten tot het systeem is verwarmd. Schakel de kooldioxidegasregelaar in en stel deze in op 5% Zodra het systeem de ingestelde temperatuur heeft bereikt, verschijnt er een prompt om een plaat in te brengen en te lezen.

Druk op Annuleren. Transporteer de plaat van de incubator naar de imager in een kluis om breuk en morsen te voorkomen en is in overeenstemming met de lokale bioveiligheidsvoorschriften voor het transport van levende cellen in geval van een ongeval. Plaats de plaat in de plaatlezer.

Klik op Procedure. Selecteer in het pop-upvenster Vooraf ingestelde beeldbewerkingsstap. Pas eerst de focus en belichting op het DAPI-kanaal aan.

Verwijder het vinkje uit het vak Automatische belichting op alle kanalen en klik vervolgens op het microscooppictogram naast het DAPI-kanaal. Er wordt een nieuw venster geopend. Selecteer het putje om de focus te richten.

Als een signaal al zichtbaar is, klikt u eerst op Autofocus en vervolgens op Automatische belichting. Zo niet, verhoog dan eerst de belichting en herhaal autofocus en automatische belichting. De belichting kan handmatig worden aangepast door het vervolgkeuzemenu Belichting te selecteren.

Controleer de instellingen op meerdere putten en sla de instellingen op. Pas de belichting op dezelfde manier aan voor alle kanalen. Zorg er voor het RFP-kanaal voor dat u begint met een put met gemiddelde tot hoge verkalking.

Sluit het procedurevenster en selecteer de groene knop Nu lezen in de bovenste taakbalk. Sla het experiment op zoals aangegeven door de software. Herhaal dit proces voor elk tijdstip.

Terwijl het systeem de plaat leest, worden alle afbeeldingen automatisch op de achtergrond verwerkt. Pas de instellingen voor het aantal cellen aan door TsF DAPI-afbeeldingen te selecteren om weer te geven. Selecteer het putje naar keuze door te dubbelklikken.

Er verschijnt een nieuw venster. Selecteer een van de afbeeldingen. Selecteer het tabblad Analyse in het pop-upvenster.

Selecteer Celaantal mobiele analyse en klik op OK. Hef de selectie van de RFP- en Bright Field-kanalen op. Schakel het selectievakje Objecten markeren in. Klik op Opties om het menu te openen.

Pas de grootte- en intensiteitsdrempel aan om alle kernen op te nemen, maar sluit vuil uit en klik vervolgens op OK. Klik linksonder op Wijzigingen toepassen om de instellingen op alle afbeeldingen toe te passen. Selecteer op dezelfde manier een well-end afbeelding met een gemiddelde tot hoge hoeveelheid verkalking. Als u de signaal-ruisverhouding het beste wilt aanpassen, klikt u op het tabblad Analyse in het menu Taak.

Selecteer Afbeeldingsstatistieken. Hef de selectie van het DAPI- en Bright Field-kanaal op. Klik op Opties om het menu te openen.

Vink het vakje Drempeluitschieters aan. Als u de niet-subjectieve drempelwaarde voor het signaal boven de achtergrond wilt instellen, selecteert u het gereedschap Lijn op de taakbalk. Er verschijnt een venster.

Teken een lijn door een signaalpatch terwijl u een gebied van de achtergrond opneemt. Pas de bovenste en onderste drempels aan. Tel alleen het signaal boven de achtergrond en sluit uit als er puin of artefacten zijn.

Klik op OK en pas wijzigingen toe om de instellingen over te zetten naar alle andere bronnen. Controleer of de drempel nauwkeurig is geselecteerd in de andere putten. Zodra het aantal cellen en de RFP-drempels zijn ingesteld, exporteert u de gegevens.

Klik op de Excel-knop naast het vervolgkeuzemenu om de gegevens rechtstreeks naar een spreadsheet te exporteren. Verschillende verkalkingsfasen, variërend van laag tot hoog, werden gedetecteerd en geanalyseerd. Verkalking werd gespot als zwarte spikkels met behulp van lichtmicroscopie, die nuttig waren voor primaire beoordeling en het bepalen wanneer met beeldvorming moest worden begonnen.

Voor een verbeterde signaal-ruisverhouding werden de verwerkte RFP-beelden geanalyseerd om verkalking te kwantificeren. De gegevens werden verkregen door twee of meer omstandigheden op hetzelfde tijdstip te vergelijken. Gegevens werden genormaliseerd naar celtelling als verkalkingsgebied per cel.

De gegevens werden ook weergegeven als een tijdreeks die dezelfde toestand op verschillende tijdstippen liet zien. Het is belangrijk dat de resultaten na datareductie en -analyse nog steeds weerspiegelen wat men kan zien vóór de beeldtransformatie en drempel.