Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

Structurele informatie over hoe base-excisieherstelenzymen DNA-laesies verwijderen in de context van chromatine is schaars. Dit vormt een belangrijke leemte in ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij de etiologie van menselijke ziekten. Het grote voordeel van ons protocol is dat we de monstervoorbereiding hebben geoptimaliseerd met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.

Dit zal andere biochemici in het veld in staat stellen om hun biochemische werk aan te vullen met technisch haalbare cryo-EM-studies. Ons protocol kan bovendien worden gebruikt om te onderzoeken hoe andere factoren, waaronder pioniertranscriptiefactoren, het nucleosoom beïnvloeden. Dit is een gebied waar de structurele informatie ook beperkt is geweest.

Het optimaliseren van de monstervoorbereiding voordat we naar de vriesomstandigheden gingen, was de sleutel tot vooruitgang in ons project, en dit kan het beste worden gedaan met standaard biochemische testen in substraatontwerp, binding en cross-linking omstandigheden. Om te beginnen, incuber de NCP en de DNA-reparatiefactor van belang op ijs gedurende 15 minuten met behulp van een optimale buffer voor het specifieke complex. Voeg vervolgens glutaaraldehyde toe tot een eindconcentratie van 0,005%Na het goed mengen, incubeer gedurende 13 minuten bij kamertemperatuur.

Blus met één kies Tris-CL tot een eindconcentratie van 20 millimolaire Tris-CL met pH 7,5. Concentreer je vervolgens tot ongeveer 50 microliter en vervang de buffer met vriesbuffer met behulp van een ontzoutingskolom. Bepaal vervolgens de absorpties bij optische dichtheid 280 en 260 nanometer en concentreer verder indien nodig om 1,3 tot 3 milligram per milliliter te bereiken op basis van optische dichtheid 280 nanometer.

Nadat u de dialyseknop hebt voorbereid, plaatst u de knop met het monster op een polyethyleenglycolbed met het membraan naar beneden gericht. Om de zuivering door grootte-uitsluitingschromatografie uit te voeren, wast en balanceert u een grootte-uitsluitingskolom met 60 milliliter gedestilleerd water, gevolgd door 80 milliliter vriesbuffer 's nachts met een snelheid van 0,4 milliliter per minuut. Analyseer vervolgens onmiddellijk de piekfracties en concentreer die fracties die het infusie-eiwit MBP-PolBeta-APE1 van de histon bevatten.

Elizabeth Viverette, een post-baccalaureaatsstagiair uit de cryo-EM-kern hier in NIH, demonstreert de volgende procedures. Nadat u de dompelvriezer hebt ingeschakeld en de luchtbevochtiger hebt gevuld met 50 milliliter gedestilleerd water, stelt u de kamertemperatuur in op 22 graden Celsius en de luchtvochtigheid op 98% Plaats vervolgens de ethaanbeker en de beker met vloeibare stikstof in de respectieve ruimtehouders. Bedek daarna de ethaanbeker met de ethaandekseldispenser en giet er voorzichtig vloeibare stikstof overheen terwijl u ook de stikstofbeker vult met vloeibare stikstof.

Wanneer het vloeibare stikstofgehalte is gestabiliseerd en 100% bereikt en de temperatuur min 180 graden Celsius bereikt, opent u voorzichtig de ethaanklep en vult u de ethaanbeker totdat deze een bel vormt op het heldere deksel. Verwijder vervolgens de ethaandispenser. Plaats twee filterpapieren op de opberginrichting en zet ze vast met een metalen ring.

Ga naar de setup en stel de blottingparameters in zoals beschreven in het manuscript, selecteer vervolgens A-Plunge en klik op OK. Klik in het hoofdscherm op Load Forceps en laad ze met een raster met de koolstoftoepassingszijde naar links gericht. Kalibreer de tang en pas de Z-as aan om een stevige vlek te garanderen. Klik op Tweede Kamer en breng drie microliter van het complex aan.

Klik vervolgens op Blot A-Plunge, die het rooster zal draaien om van voren te vegen en het zal bevriezen. Bewaar het rooster na het overbrengen in de roosterdoos in de vloeibare stikstofkamer. Wanneer alle vier de roosters zijn bevroren en in de roosterdoos zijn geplaatst, draait u het deksel naar de neutrale positie waar alle roosters door het deksel worden bedekt en draait u de schroef vast.

Voordat u de monsters in de microscoop laadt, plaatst u de verglaasde roosters op een ring en zet u deze vast met een C-clip onder vloeibare stikstof in een vochtige ruimte om ijsverontreiniging te voorkomen. Plaats bij het laden van de microscoop de roosters in een cassette met 12 sleuven. Schud de cassette in een nanocab-capsule en laad deze in de autoloader.

Breng vervolgens het raster over van de cassette naar het microscoopstadium. Stel het podium in op eucentrische hoogte door het podium 10 graden te wiebelen en tegelijkertijd de Z-hoogte te verplaatsen totdat minimale planaire verschuiving in de afbeeldingen wordt waargenomen. Zodra de eucentrische hoogte is bereikt, begint u met het maken van een montageafbeelding van 3 bij 3 van het raster waarin elke montage wordt genomen met een vergroting van 62x om de atlas te verkrijgen.

Na het kiezen van drie vierkanten van verschillende grootte en het nemen van de eucentrische hoogte, beeld met 210x vergroting. Zodra een vierkant is afgebeeld, kiest u elk een gat van de rand, het midden en daartussen binnen de vierkanten. Stel vervolgens elk gat voor met een vergroting van 2.600x.

Neem het beeld met hoge vergroting vanuit het midden van het gat bij een vergroting van 36.000x en bij een belichtingstijd van 7,1 seconden, 60 frames, een pixelgrootte van 1,18 pixels en onscherpte van drie micrometer. Zie representatieve beelden van de screening. Om de verhouding van NCP tot MBP-PolBeta-APE1 te bepalen om een stabiel complex te vormen, werden elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests uitgevoerd, die een afzonderlijk verschoven band van de NCP toonden met vijfvoudige molaire overmaat van MBP-PolBeta-APE1.

In een kleiner volume toonde de assemblage van het complex van NCP-PolBeta-APE1 aan dat het monster te verknoopt was en resulteerde in aggregaten zonder waarneembare individuele complexen. Tienvoudige verdunning in NCP's resulteerde echter in aanzienlijk verminderde aggregatie en verbeterde deeltjesstabiliteit. De preparatieve gel- en grootte-uitsluitingsmethoden kunnen worden gecombineerd waarbij preparatieve gel de kwaliteit van de NCP's verbetert wanneer ze een aanzienlijke hoeveelheid aggregaten met een hoog molecuulgewicht bevatten, gevolgd door de zuivering van het complex via grootte-uitsluiting.

De resultaten laten zien dat beide methoden onafhankelijk van elkaar kunnen worden gebruikt om stabiele complexen te genereren. Verder tonen de gegevens die van beide rasters zijn verzameld bijna identieke tweedimensionale klassen en driedimensionale kaarten met een resolutie van ongeveer 3,2 angstrom. Eerst moet een optimale verhouding tussen NCP en DNA-reparatiefactor worden bepaald, waarna het complex met glutaaraldehyde moet worden verbroken bij ten minste 10 keer meer verdund dan de concentratie die nodig is voor bevriezing.

Na het verkrijgen van een cryo-EM 3D-kaart van het complex, zal verdere structurele verfijning nodig zijn om te bepalen hoe de DNA-reparatiefactor wordt gevonden en te identificeren welke regio's belangrijk zijn voor deze interacties.