Name: Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer de voorbereiding van nucleosoomcomplexen met DNA-reparatiefactoren voor cryo-EM structurele analyse. Dit protocol optimaliseert monstervoorbereiding met standaard laboratoriumapparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Mario Borgnia van de cryo-EM-kern van het National Institute of Environmental Health Sciences en Dr. Joshua Strauss van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill voor hun mentorschap en training in de cryo-EM-netwerkvoorbereiding. We danken ook Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende voor de technische assistentie in de beginfase van dit project. We waarderen de belangrijke bijdrage en steun van wijlen Dr. Samuel H. Wilson en zijn laboratoriumleden, in het bijzonder Dr. Rajendra Prasad en Dr. Joonas Jamsen voor de zuivering van het genetisch gefuseerde APE1-Polβ-complex. Onderzoek is ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [subsidienummers Z01ES050158, Z01ES050159 en K99ES031662-01].

1. Assembleer nucleosoomkerndeeltjes via zout-gariëntdialyse
OPMERKING: De bereiding van nucleosoomkerndeeltjes met behulp van recombinante histoneiwitten voor structurele studies is uitgebreid in detail beschreven door anderen14,15,16. Volg de zuivering van recombinant X. laevis histonen en histon octameer assemblage beschreven door anderen14,15, en monteer het nucleosomale substraat zoals hieronder beschreven.
<ol><li>Koop drie oligonucleotiden (vermeld in tabel 1) op de aangegeven schaal: UND-197mer, 161mer, 35mer.<ol><li>PAGE zuivert ultrameren (197mer en 161mer) zoals beschreven17.<ol><li>Anneale equimolaire hoeveelheden oligonucleotiden in 1x gloeibuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Meng bijvoorbeeld 40 μL van 161-mer [166,7 μM]; 8 μL van 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL van 197-mer comp streng [408,2 μM]; 10 μL 10x gloeibuffer en 10,9 μL dH2O. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de gloeireactie met een temperatuurgradiënt te regelen. Zie tabel 2 voor de details over het temperatuurverloop.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Voer kleinschalige reconstituties uit (schaal met een factor 1/57 van het onderstaande voorbeeld voor een eindvolume van 50 μL) om de verhouding tussen DNA en histonoctameer te bepalen (typische beginverhoudingen van DNA:octameer zijn als volgt: 1:0,9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; weergegeven in figuur 2A); Het is van cruciaal belang om deze verhouding empirisch te bepalen met kleinschalige reconstituties.<ol><li>Nadat deze verhouding is bepaald, bereidt u een grootschalige reconstitutie voor. Meng bijvoorbeeld 32,9 μL DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μL van 5 M NaCl en 62,3 μL WT histon octameer [2,56 μM].</li>
	</ol></li>
	<li>Dialysebuffers maken: RBlaag en RBhoog zoals beschreven in respectievelijk tabel 3 en tabel 4; Stel de reconstituties in zoals eerder beschreven14.<ol><li>Breng de dialysebuis over in het bekerglas met RBhoog en laat de dialyse onder zacht roeren gedurende 16 uur doorgaan of totdat 2 L RBlaag in het afvalbeker is overgebracht.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de dialysebuis over in een bekerglas van 1 L met RB50mM-buffer (tabel 5) en laat het monster gedurende ten minste 3 uur of een nacht dialyseren.<ol><li>Evalueer de reconstitutie-efficiëntie op een 6% polyacrylamide niet-denaturerende gel, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er minder dan 10% vrij DNA en een enkele NCP-band is; bewaar NCP's bij 4 °C. Zie figuur 2A (baan 5) en figuur 2B voor representatieve optimale reconstitutieresultaten.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bereid NCP-DNA reparatiefactor complex (NCP-DRF) voor
<ol><li>Zuivering door preparatieve gel-elektroforese OPMERKING: Deze methode is de meest arbeidsintensieve (van de twee beschreven), en hoewel het effectief is in het verwijderen van soorten met een hoog moleculair gewicht (HMW) (Figuur 6A) vanwege de hoge verdunningsfactor kan dit leiden tot enige demontage zoals weergegeven in Figuur 7A (NCP prep cell out lane), waarbij DNA vrijkomt. Tot 25% vrij DNA is echter nog steeds compatibel met cryo-EM-studies. Vanwege de hoge verdunning, gebruik deze methode om alleen het NCP te zuiveren, in plaats van het hele complex.<ol><li>Bereid 70 ml 6% niet-denaturerende polyacrylamide-geloplossing in 0,2x TBE, met polyacrylamide-geloplossing 37,5:1, acrylamide:bisacrylamide. Giet een cilindrische gel met een buitenradius van 28 mm en polymeriseer 's nachts.</li>
		<li>Monteer het preparatieve gelloopapparaat met behulp van een dialysemembraan met een 6-8 kDa MW-afsnijding. Gebruik 0,25x TBE als loopbuffer en 1x elutiebuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Laat de cilindrische gel gedurende 1 uur op een constante 12 W lopen en verzamel fracties die de peristaltische pomp laten draaien met een stroomsnelheid van ongeveer 1 ml / min. OPMERKING: Als er geen UV-detector beschikbaar is om fracties met DNA te identificeren, kan een screeningsexperiment met 32P-NCP worden uitgevoerd om de fracties van belang te identificeren. Door alle omstandigheden hetzelfde te houden, kunnen ongelabelde NCP's vervolgens worden gezuiverd zonder een UV-detector.</li>
		<li>Concentreer de 2,8 ml NCP tot 250 μL met behulp van een centrifugaalfilter (MW-afsnijding 30 kDa) en laad gedurende in totaal 6 uur op de preparatieve gel en elektroforese. Na 2 uur, wanneer de xyleencyanol de gel op heeft, begint u met het verzamelen van fracties van 1,5 ml. OPMERKING: Na 2,5 uur zijn fracties vrij van xyleencyanol; het DNA (197mer) elueert op ongeveer 3-3,5 h, en het NCP zal naar verwachting elueren bij 4,5-5 h mark.</li>
		<li>Analyseer fracties van belang op een 6% niet-denaturerende polyacrylamidegel. Poolfracties die de NCP bevatten en concentreer onmiddellijk met een centrifugaalfilter (MW-afsnijding 30 kDa) tot 1 mg / ml. Evalueer de volgende dag de kwaliteit van de NCP op een 6% polyacrylamide niet-denaturerende gel voordat u complexeert met de DNA-reparatiefactor (DRF) van belang.</li>
		<li>Incubeer het NCP en de DRF van belang op ijs gedurende 15 minuten met behulp van een optimale buffer voor het specifieke complex. Meng bijvoorbeeld 1.000 μL NCP [1,2 μM]; 260 μL 5x bindingsbuffer (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl en 18 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM]. OPMERKING: De temperatuur en ionische sterkte waarbij het complex is gemaakt, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende complexen.</li>
		<li>Voeg glutaaraldehyde (vers geopend; EM-graad) tot een eindconcentratie van 0,005%. Voeg daarom aan deze reactie 26,8 μL 0,25% glutaaraldehyde toe met 13,2 μL dH2O. Meng goed en incubeer gedurende 13 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Blus met 1 M Tris-Cl, pH 7,5, tot een eindconcentratie van 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Concentraat tot ~50 μL en vervang de buffer met 1x vriesbuffer: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 met behulp van een ontzoutingskolom. LET OP: Glutaaraldehyde kan ernstige brandwonden en oogbeschadiging veroorzaken; Het is schadelijk als het wordt ingeslikt en het is giftig als het wordt ingeademd. Draag een laboratoriumjas, bril, handschoenen en hanteer glutaaraldehyde in een zuurkast en draag een masker. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de crosslinkingreactie in een groot volume uit te voeren met de NCP bij deze lagere concentratie. Eerdere pogingen tot crosslinking, zelfs bij deze concentratie van glutaaraldehyde, maar bij een 10x hogere geconcentreerde NCP leidden tot aggregatie van het monster en over-crosslinking zoals aangegeven door SDS PAGE en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze roosters hadden geen waarneembare deeltjes met alleen klonten (figuur 5D,E).</li>
		<li>Bepaal de absorpties bij OD 280 en OD 260 en concentreer indien nodig verder om 1,3-3 mg / ml te bereiken, op basis van OD 280 (typische verhouding van OD260 / OD 280 = 1,7-2 levert goede deeltjes op). Voor dit kleine volume van 50 μL is de beste methode om monsterverlies te verminderen het maken van een dialyseknop met een deksel van een buis van 1,7 ml bedekt met een dialysemembraan (6-8 kDa MW afsnijding), het snijden van de onderkant van de buis en het gebruik van de rand van de buis om het membraan bovenop het deksel af te dichten.</li>
		<li>Plaats de dialyseknop met het monster bovenop een polyethyleenglycolbed, met het membraan naar beneden gericht (controleer de voortgang elke 2 minuten). Deze methode heeft de voorkeur wanneer de benodigde concentratie kleiner is dan of gelijk is aan 2,5-voudig om te voorkomen dat het monster in de concentrator wordt verdund of verloren. Het is van cruciaal belang om na deze stap onmiddellijk cryo-EM-roosters van het complex voor te bereiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Zuivering door grootte-uitsluitingschromatografie<ol><li>De dag voor het invriezen, was en balanceer een grootte uitsluitingskolom met 60 ml dH2O, gevolgd door 80 ml vriesbuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) 's nachts met een snelheid van 0,4 ml / min. Gebruik NCP's direct na reconstitutie en bereid hetzelfde complex met 2,5x grotere hoeveelheden als volgt: meng 2.500 μL NCP [1,2 μM]; 650 μL 5x bindingsbuffer; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] en 55 μL 3M KCl.</li>
		<li>Incubeer het mengsel op ijs zonder crosslinker gedurende 15 min. Voeg vervolgens glutaaraldehyde toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,005% zoals beschreven in de preparatieve gelmethode. Concentreer het complex in dit geval echter in een vooraf gebalanceerd (met vriesbuffer) centrifugaalfilter tot ongeveer 120 μL.</li>
		<li>Analyseer onmiddellijk de piekfracties en concentreer die fracties die de histonen en MBP-Pol β-APE1 bevatten, zoals eerder aangegeven. Zie figuur 5A,B,C voor succesvolle resultaten met behulp van de grootte-uitsluitingsmethode en figuur 7 met beide methoden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bevries nucleosomaal complex
<ol><li>Nadat u de diepvries hebt ingeschakeld en de luchtbevochtiger hebt gevuld met 50 ml dH2O, stelt u de kamertemperatuur in op 22 °C en HR (vochtigheid) op 98%. Plaats de ethaanbeker en de beker met vloeibare stikstof (met een gelabelde rasterdoos) in hun respectievelijke ruimtehouders.</li>
	<li>Bedek de ethaanbeker met de ethaandekseldispenser en giet er voorzichtig vloeibare stikstof (LN2) overheen, terwijl u ook de LN 2-beker vult met LN2. Wanneer het LN2-niveau is gestabiliseerd en 100% en een temperatuur van -180 °C bereikt, opent u voorzichtig de ethaanklep en vult u de ethaanbeker totdat deze een bel vormt op het heldere deksel. Verwijder de ethaandispenser.</li>
	<li>Plaats twee filterpapieren op de opberginrichting en zet ze vast met een metalen ring. Ga naar de set-up en gebruik de volgende parameters voor blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; selecteer A-plunge en klik op OK.</li>
	<li>Klik in het hoofdscherm op Load Forceps en laad ze met een raster met de koolstof- / applicatiezijde naar links gericht (voorbereid zoals voorheen). Kalibreer de tang en stel de Z-as in om een stevige vlek te garanderen. Klik op de Tweede Kamer en breng 3 μL van het complex aan (1,3-3 mg / ml; OD280). Klik op Blot/A-plunge. Dit zal het rooster draaien om van de voorkant te vegen en zal het bevriezen.</li>
	<li>Breng het raster over en bewaar het in de rasterdoos in de LN2-kamer . Wanneer alle vier de roosters zijn bevroren en in de roosterdoos zijn geplaatst, draait u het deksel naar de neutrale positie, waar alle roosters door het deksel worden bedekt, en draait u de schroef vast. Rasters kunnen worden opgeslagen in LN2 totdat de screening wordt gestart.</li>
</ol>4. Schermrasters
<ol><li>Voordat u de monsters in de microscoop laadt, plaatst u de verglaasde roosters op een ring en zet u ze vast met een C-clip. Voer dit knipproces onder LN2 uit in een ruimte met een vochtige omgeving, om ijsverontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Plaats bij het laden van de microscoop de roosters in een cassette met 12 sleuven. Breng de cassette in een nanocab-capsule en laad deze in de autoloader. Het robotmechanisme van de autoloader initieert het proces.</li>
	<li>Breng het rooster over van de cassette naar het microscoopstadium. Pas het podium aan op eucentrische hoogte door het podium 10° te wiebelen en tegelijkertijd de Z-hoogte te bewegen totdat er een minimale vlakke verschuiving in de beelden wordt waargenomen.</li>
	<li>Zodra de eucentrische hoogte is bereikt, begint u met beeldvorming. Verkrijg eerst de atlas door een 3 x 3 montageafbeelding van het raster te maken, waarin elke montage wordt genomen met een vergroting van 62x. Kies drie vierkanten van verschillende grootte; Neem de eucentrische hoogte en maak vervolgens een afbeelding met een vergroting van 210x.</li>
	<li>Zodra een vierkant is afgebeeld, kiest u elk een gat van de rand, het midden en daartussen binnen de vierkanten. Beeld elk gat af bij een vergroting van 2600x.</li>
	<li>Voordat deze hoge vergrotingsfoto wordt gemaakt, vindt de autofocus plaats op een offset van het beeldgebied. Neem het hoge vergrotingsbeeld vanuit het midden van het gat bij een vergroting van 36.000x en bij een belichtingstijd van 7,1 s, 60 frames, een grootte van 1,18 pixels en een onscherpte van 3 μm. Zie representatieve beelden van screening in figuur 5, figuur 6 en figuur 7.</li>
</ol>

<ol><li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+dynamics+at+DNA+replication%2C+transcription+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li>
<li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li>
<li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li>
<li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li>
<li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+DNA+damage+in+chromatin%3A+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li>
<li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li>
<li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li>
<li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li>
<li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li>
<li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li>
<li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li>
<li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme%2Fnucleosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li>
<li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurgess%2C+RRD+%22Guide+to+Protein+Purification%22">Guide to Protein Purification</a>. 463, Academic Press. (2009).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909(2016).</li>
<li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+%28Legobodies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationall+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).</li>
<li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).</li>
<li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255(2018).</li>
<li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Een specifiek protocol voor het zuiveren van de DNA-reparatiefactor zal afhankelijk zijn van het enzym van belang. Er zijn echter enkele algemene aanbevelingen, waaronder het gebruik van recombinante methoden voor eiwitexpressie en -zuivering18; als het eiwit van belang te klein is (<50 kDa), was structuurbepaling door cryo-EM tot voor kort bijna onmogelijk door het gebruik van fusiesystemen19, nanobody-bindende steigers20 en het optimaliseren van be...

Eukaryote DNA wordt georganiseerd en verdicht door histoneiwitten, die chromatine vormen. Het nucleosoomkerndeeltje (NCP) vormt de fundamentele herhalende eenheid van chromatine die de toegankelijkheid tot DNA-bindende eiwitten reguleert voor DNA-reparatie, transcriptie en replicatie1. Hoewel de eerste röntgenkristalstructuur van het NCP meer dan twee decennia geleden voor het eerst werd opgelost2 en er sinds 3,4,5,6 nog veel meer structuren van het NCP zijn gepubliceerd, zijn DNA-reparatiemechanismen in nucleosomale substraten nog niet afgebakend. Het blootleggen van de moleculaire details die ten grondslag liggen aan DNA-reparatie in chromatine vereist structurele karakterisering van de deelnemende componenten om te begrijpen hoe lokale structurele kenmerken van het NCP DNA-reparatieactiviteiten reguleren. Dit is met name belangrijk in de context van base-excisieherstel (BER), aangezien biochemische studies met BER-enzymen unieke DNA-reparatiemechanismen in nucleosomen suggereren die afhankelijk zijn van enzymspecifieke structurele vereisten voor katalyse en de structurele positie van de DNA-laesie binnen het nucleosoom 7,8,9,10,11,12,13 . Aangezien BER een essentieel DNA-reparatieproces is, is er veel belangstelling om deze lacunes op te vullen en tegelijkertijd een startpunt vast te stellen van waaruit andere technisch haalbare structurele studies met relevante nucleosomale complexen kunnen worden uitgevoerd.
Cryo-EM wordt snel de voorkeursmethode voor het oplossen van de driedimensionale (3D) structuur van complexen waarvan de grootschalige voorbereiding van homogene monsters een uitdaging is. Hoewel het ontwerp en de zuivering van NCP's gecomplexeerd met een DNA-reparatiefactor (NCP-DRF) waarschijnlijk op maat gemaakte optimalisatie vereist, biedt de hier gepresenteerde procedure om een stabiel NCP-DRF-complex te genereren en te bevriezen details over hoe het monster en de cryo-EM-netwerkvoorbereiding kunnen worden geoptimaliseerd. Twee workflows (die elkaar niet uitsluiten) in figuur 1 en de specifieke details in het protocol identificeren kritieke stappen en bieden strategieën voor het optimaliseren van deze stappen. Dit werk zal het chromatine- en DNA-reparatieveld voortstuwen in een richting waarin het aanvullen van biochemische met structurele studies technisch haalbaar wordt om de moleculaire mechanismen van nucleosomaal DNA-herstel beter te begrijpen.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES; pH 7.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Bio-rad</td><td>1610733</td><td></td></tr><tr><td>25% glutaraldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>043398.K2</td><td></td></tr><tr><td>491 prep cell</td><td>Bio-rad</td><td>1702926</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z717185</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>AutoGrid Tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>47000-600</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Plunge Freezer</td><td>Leica</td><td>Leica EM GP</td><td></td></tr><tr><td>C-1000 touch thermocycler</td><td>Bio-rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>C-clips and rings</td><td>Thermo Fisher</td><td>6640--6640</td><td></td></tr><tr><td>Clipping station</td><td>SubAngostrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis Membrane (MW cutoff 6-8 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15370752</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Tweezers</td><td>Techni-Pro</td><td>758TW0010</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA</td><td>Integrated DNA technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FEI Titan Krios</td><td>Thermo Fisher</td><td>KRIOSG4TEM</td><td></td></tr><tr><td>FPLC purification system</td><td>AKTA Pure</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector Model 2110</td><td>Bio-rad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>Glow Discharge Cleaning System</td><td>Ted Pella</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>Grid Boxes</td><td>SubAngostrom</td><td>PB-E</td><td></td></tr><tr><td>Grid Storage Accessory Pack</td><td>SubAngostrom</td><td>GSAX</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Ethane</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 peristaltic two-head pump</td><td>Gilson</td><td>F155008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6695BOX</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (VWR) Low Retention</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gel solution (37.5:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>polyethylene glycol (PEG)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4338-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td><td>Millipore Sigma</td><td>PURX35050</td><td></td></tr><tr><td>Purified recombinant DNA repair factor</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant histone octamer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spring clipping tools</td><td>SubAngostrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 column 10/300</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>Thermo Fisher</td><td>Talos Arctica 200 kV</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mark IV System</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter paper (55 mM)</td><td>Cytiva</td><td>1005-055</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>440700500</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 &micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89877</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met dna-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

DNA-reparatie in de context van chromatine is slecht begrepen. Biochemische studies met nucleosoomkerndeeltjes, de fundamentele herhalende eenheid van chromatine, tonen aan dat de meeste DNA-reparatie-enzymen DNA-schade verwijderen met verminderde snelheden in vergelijking met vrij DNA. De moleculaire details over hoe base excision repair (BER) enzymen DNA-schade in nucleosomen herkennen en verwijderen, zijn niet opgehelderd. Biochemische BER-gegevens van nucleosomale substraten suggereren echter dat het nucleosoom verschillende structurele barrières vertoont, afhankelijk van de locatie van de DNA-laesie en het enzym. Dit geeft aan dat de mechanismen die door deze enzymen worden gebruikt om DNA-schade in vrij DNA te verwijderen, anders kunnen zijn dan die welke in nucleosomen worden gebruikt. Aangezien het grootste deel van het genomische DNA is geassembleerd tot nucleosomen, is structurele informatie van deze complexen nodig. Tot op heden ontbreekt het de wetenschappelijke gemeenschap aan gedetailleerde protocollen om technisch haalbare structurele studies van deze complexen uit te voeren. Hier bieden we twee methoden om een complex van twee genetisch gefuseerde BER-enzymen (Polymerase β en AP Endonuclease1) te bereiden die gebonden zijn aan een single-nucleotide-gap nabij de entry-exit van het nucleosoom voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structurele bepaling. Beide methoden voor monstervoorbereiding zijn compatibel voor het vitrificeren van kwaliteitsroosters via ondervriezen. Dit protocol kan worden gebruikt als uitgangspunt om andere nucleosomale complexen te bereiden met verschillende BER-factoren, pioniertranscriptiefactoren en chromatine-modificerende enzymen.

Goed geassembleerde NCP's (figuur 2) werden gebruikt om een complex te maken met een recombinant fusie-eiwit van MBP-Polβ-APE1 (figuur 3). Om de verhouding van NCP tot MBP-Polβ-APE1 te bepalen om een stabiel complex te vormen, voerden we elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests (EMSA) uit (figuur 4), die een afzonderlijk verschoven band van de NCP toonden met 5-voudige molaire overmaat van MBP-Polβ-APE1. Tijdens de optimalisa...

Dit protocol schetst in detail de voorbereiding van nucleosomale complexen met behulp van twee methoden voor monstervoorbereiding voor het bevriezen van TEM-roosters.

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Structurele informatie over hoe base-excisieherstelenzymen DNA-laesies verwijderen in de context van chromatine is schaars. Dit vormt een belangrijke leemte in ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij de etiologie van menselijke ziekten. Het grote voordeel van ons protocol is dat we de monstervoorbereiding hebben geoptimaliseerd met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.Dit zal andere biochemici in het veld in staat stellen om hun biochemische werk aan te vullen met technisch haalbare cryo-EM-studies. Ons protocol kan bovendien worden gebruikt om te onderzoeken hoe andere factoren, waaronder pioniertranscriptiefactoren, het nucleosoom beïnvloeden. Dit is een gebied waar de structurele informatie ook beperkt is geweest.Het optimaliseren van de monstervoorbereiding voordat we naar de vriesomstandigheden gingen, was de sleutel tot vooruitgang in ons project, en dit kan het beste worden gedaan met standaard biochemische testen in substraatontwerp, binding en cross-linking omstandigheden. Om te beginnen, incuber de NCP en de DNA-reparatiefactor van belang op ijs gedurende 15 minuten met behulp van een optimale buffer voor het specifieke complex. Voeg vervolgens glutaaraldehyde toe tot een eindconcentratie van 0,005%Na het goed mengen, incubeer gedurende 13 minuten bij kamertemperatuur.Blus met één kies Tris-CL tot een eindconcentratie van 20 millimolaire Tris-CL met pH 7,5. Concentreer je vervolgens tot ongeveer 50 microliter en vervang de buffer met vriesbuffer met behulp van een ontzoutingskolom. Bepaal vervolgens de absorpties bij optische dichtheid 280 en 260 nanometer en concentreer verder indien nodig om 1,3 tot 3 milligram per milliliter te bereiken op basis van optische dichtheid 280 nanometer.Nadat u de dialyseknop hebt voorbereid, plaatst u de knop met het monster op een polyethyleenglycolbed met het membraan naar beneden gericht. Om de zuivering door grootte-uitsluitingschromatografie uit te voeren, wast en balanceert u een grootte-uitsluitingskolom met 60 milliliter gedestilleerd water, gevolgd door 80 milliliter vriesbuffer 's nachts met een snelheid van 0,4 milliliter per minuut. Analyseer vervolgens onmiddellijk de piekfracties en concentreer die fracties die het infusie-eiwit MBP-PolBeta-APE1 van de histon bevatten.Elizabeth Viverette, een post-baccalaureaatsstagiair uit de cryo-EM-kern hier in NIH, demonstreert de volgende procedures. Nadat u de dompelvriezer hebt ingeschakeld en de luchtbevochtiger hebt gevuld met 50 milliliter gedestilleerd water, stelt u de kamertemperatuur in op 22 graden Celsius en de luchtvochtigheid op 98% Plaats vervolgens de ethaanbeker en de beker met vloeibare stikstof in de respectieve ruimtehouders. Bedek daarna de ethaanbeker met de ethaandekseldispenser en giet er voorzichtig vloeibare stikstof overheen terwijl u ook de stikstofbeker vult met vloeibare stikstof.Wanneer het vloeibare stikstofgehalte is gestabiliseerd en 100% bereikt en de temperatuur min 180 graden Celsius bereikt, opent u voorzichtig de ethaanklep en vult u de ethaanbeker totdat deze een bel vormt op het heldere deksel. Verwijder vervolgens de ethaandispenser. Plaats twee filterpapieren op de opberginrichting en zet ze vast met een metalen ring.Ga naar de setup en stel de blottingparameters in zoals beschreven in het manuscript, selecteer vervolgens A-Plunge en klik op OK. Klik in het hoofdscherm op Load Forceps en laad ze met een raster met de koolstoftoepassingszijde naar links gericht. Kalibreer de tang en pas de Z-as aan om een stevige vlek te garanderen. Klik op Tweede Kamer en breng drie microliter van het complex aan.Klik vervolgens op Blot A-Plunge, die het rooster zal draaien om van voren te vegen en het zal bevriezen. Bewaar het rooster na het overbrengen in de roosterdoos in de vloeibare stikstofkamer. Wanneer alle vier de roosters zijn bevroren en in de roosterdoos zijn geplaatst, draait u het deksel naar de neutrale positie waar alle roosters door het deksel worden bedekt en draait u de schroef vast.Voordat u de monsters in de microscoop laadt, plaatst u de verglaasde roosters op een ring en zet u deze vast met een C-clip onder vloeibare stikstof in een vochtige ruimte om ijsverontreiniging te voorkomen. Plaats bij het laden van de microscoop de roosters in een cassette met 12 sleuven. Schud de cassette in een nanocab-capsule en laad deze in de autoloader.Breng vervolgens het raster over van de cassette naar het microscoopstadium. Stel het podium in op eucentrische hoogte door het podium 10 graden te wiebelen en tegelijkertijd de Z-hoogte te verplaatsen totdat minimale planaire verschuiving in de afbeeldingen wordt waargenomen. Zodra de eucentrische hoogte is bereikt, begint u met het maken van een montageafbeelding van 3 bij 3 van het raster waarin elke montage wordt genomen met een vergroting van 62x om de atlas te verkrijgen.Na het kiezen van drie vierkanten van verschillende grootte en het nemen van de eucentrische hoogte, beeld met 210x vergroting. Zodra een vierkant is afgebeeld, kiest u elk een gat van de rand, het midden en daartussen binnen de vierkanten. Stel vervolgens elk gat voor met een vergroting van 2.600x.Neem het beeld met hoge vergroting vanuit het midden van het gat bij een vergroting van 36.000x en bij een belichtingstijd van 7,1 seconden, 60 frames, een pixelgrootte van 1,18 pixels en onscherpte van drie micrometer. Zie representatieve beelden van de screening. Om de verhouding van NCP tot MBP-PolBeta-APE1 te bepalen om een stabiel complex te vormen, werden elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests uitgevoerd, die een afzonderlijk verschoven band van de NCP toonden met vijfvoudige molaire overmaat van MBP-PolBeta-APE1.In een kleiner volume toonde de assemblage van het complex van NCP-PolBeta-APE1 aan dat het monster te verknoopt was en resulteerde in aggregaten zonder waarneembare individuele complexen. Tienvoudige verdunning in NCP's resulteerde echter in aanzienlijk verminderde aggregatie en verbeterde deeltjesstabiliteit. De preparatieve gel- en grootte-uitsluitingsmethoden kunnen worden gecombineerd waarbij preparatieve gel de kwaliteit van de NCP's verbetert wanneer ze een aanzienlijke hoeveelheid aggregaten met een hoog molecuulgewicht bevatten, gevolgd door de zuivering van het complex via grootte-uitsluiting.De resultaten laten zien dat beide methoden onafhankelijk van elkaar kunnen worden gebruikt om stabiele complexen te genereren. Verder tonen de gegevens die van beide rasters zijn verzameld bijna identieke tweedimensionale klassen en driedimensionale kaarten met een resolutie van ongeveer 3,2 angstrom. Eerst moet een optimale verhouding tussen NCP en DNA-reparatiefactor worden bepaald, waarna het complex met glutaaraldehyde moet worden verbroken bij ten minste 10 keer meer verdund dan de concentratie die nodig is voor bevriezing.Na het verkrijgen van een cryo-EM 3D-kaart van het complex, zal verdere structurele verfijning nodig zijn om te bepalen hoe de DNA-reparatiefactor wordt gevonden en te identificeren welke regio's belangrijk zijn voor deze interacties.

preparation-nucleosome-core-particles-complexed-with-dna-repair

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een methode wordt gepresenteerd voor de reconstructie van model nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde nucleosoom positionering DNA. We beschrijven ook hoe sedimentatiesnelheid experimenten analytische ultracentrifuge en atomic force microscopie (AFM) worden gebruikt voor het monitoren van de mate van nucleosomale matrix verzadiging na reconstitutie.

Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. Synchrone teelt, toezicht door fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie worden gebruikt. Een protocol voor deze methodologieën wordt gepresenteerd, en toekomstige toepassingen en ontwikkelingen worden besproken.

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Dit artikel presenteert een gedetailleerde experimentele procedure voor het reconstrueren van nucleosoombevattende DNA-kettingen voor correlatieve kracht en fluorescentiemicroscopie van één molecuul. Het beschrijft verder verschillende stroomafwaartse experimenten die kunnen worden uitgevoerd om het bindingsgedrag van chromatine-interagerende eiwitten te visualiseren en veranderingen in de fysische eigenschappen van nucleosomen te analyseren.

In situ nucleosoomassemblage voor correlatieve kracht van één molecuul en fluorescentiemicroscopie

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Leer de voorbereiding van nucleosoomcomplexen met DNA-reparatiefactoren voor cryo-EM structurele analyse. Dit protocol optimaliseert monstervoorbereiding met standaard laboratoriumapparatuur.

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

Meer video's verkennen