Name: Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Leer hoe je skeletspiergroei in levende zebravissen meet met hoge ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid. Deze methode biedt inzicht in spiergroei-regulatie en mogelijke therapeutische strategieën voor spierafbraak.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zijn diep schatplichtig aan de inspanningen van Hughes-lableden Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin en Vladimir Snetkov voor de ontwikkeling van de beschreven protocollen, en aan Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau en Peter Currie voor het delen van plasmiden of zebravislijnen. SMH is een Medical Research Council (MRC) Scientist met Programme Grant G1001029, MR/N021231/1 en MR/W001381/1support. MA hield een MRC Doctoral Training Programme PhD Studentship van King's College London. Dit werk profiteerde van de goniometrische inbreng van David M. Robinson, geleerde, mentor en vriend.

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Hier rapporteren we een methode voor een nauwkeurige en efficiënte schatting van het spiervolume van levende zebravislarven in stadia of in genetische varianten waarin pigmentatie geen grote belemmering vormt voor beeldvorming en wanneer voorbijgaande anesthesie en / of immobilisatie goed wordt verdragen. Terwijl we laserscanning confocale microscopie hebben gebruikt, zijn de beschreven benaderingen van toepassing op draaiende schijf confocale of lichtbladmicroscopie en op elke andere methode die stapels afbeeldingen op ...

Gereguleerde weefselgroei, bestaande uit toename van het aantal cellen (hyperplasie) en /of celgrootte (hypertrofie), is een cruciale factor in ontwikkeling, regeneratie en ecologische en evolutionaire aanpassing. Ondanks de enorme vooruitgang in moleculair genetisch begrip van zowel cel- als ontwikkelingsbiologie in de afgelopen decennia, staat het mechanistische begrip van de regulatie van weefsel en orgaangrootte nog in de kinderschoenen. Een reden voor deze lacune in kennis is de moeilijkheid om weefselgroei in levende organismen te kwantificeren met de nodige ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid.
Verschillende aspecten van de groei van hele organismen kunnen herhaaldelijk in de loop van de tijd worden gemeten, waarbij groeicurven voor elk individu 1,2,3,4,5 worden onthuld. Steeds geavanceerdere scanmethoden, zoals dubbele röntgenabsorptie (DXA), computertomografie (CT) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), maken het mogelijk de groei van hele organen en andere lichaamsregio's (bijvoorbeeld individueel geïdentificeerde skeletspieren) bij afzonderlijke individuen, zowel menselijke als in modelorganismen, te volgen 6,7,8,9,10 . Deze methoden hebben echter nog niet de resolutie om individuele cellen te onthullen en dus zijn de verbanden tussen cellulair gedrag en groei op weefselniveau moeilijk te onderscheiden. Om dergelijke verbanden te leggen, hebben traditionele studies vaak vertrouwd op cohorten van vergelijkbare individuele dieren, waarvan er een paar op opeenvolgende tijdstippen worden geofferd en vervolgens in cytologisch detail worden geanalyseerd. Dergelijke benaderingen vereisen het gemiddelde van de waargenomen veranderingen over groepen van (bij voorkeur vergelijkbare, maar niettemin variabele) individuen en lijden dus aan een gebrek aan temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het moeilijk is om gecorreleerde gebeurtenissen op cellulair niveau te vinden die wijzen op oorzaak en gevolg.
Studies op ongewervelde modelorganismen, aanvankelijk in C. elegans en D. melanogaster, hebben deze problemen omzeild door optische microscopie te ontwikkelen om cellulaire resolutie te bereiken en nauwkeurig de groei in de loop van de tijd te meten bij individuele individuen. Dergelijke studies hebben opvallend invariant cellijngedrag onthuld in de groei van deze kleine modelorganismen 11,12,13,14,15,16,17. Veel dieren, waaronder alle gewervelde dieren, hebben echter onbepaalde cellijnlijnen en beheersen weefselgroei door mysterieuze feedbackprocessen die dienen om het genetisch gecodeerde groeiprogramma om te zetten in een functioneel driedimensionaal organisme met al zijn samenstellende weefsels en organen die qua grootte op de juiste manier zijn afgestemd. Om deze complexe groeiprocessen te begrijpen, is het wenselijk om hele weefsels of organen in de loop van de tijd in afzonderlijke individuen in beeld te brengen die experimenteel kunnen worden gemanipuleerd door genetische, farmacologische of andere interventies op een tijdstip naar keuze en het effect vervolgens geanalyseerd.
Elke gewervelde skeletspier heeft een gedefinieerde grootte, vorm en functie, en goed gekarakteriseerde interacties met aangrenzende weefsels, zoals bot, pees en zenuwen. Sommige spieren zijn klein, liggen net onder de huid en zijn daarom goede kandidaten voor hoge resolutie beeldvormingsstudies. Net als de meeste organen groeit elke spier gedurende het embryonale, postnatale en juveniele leven, voordat het een stabiele volwassen grootte bereikt. Spieren hebben echter ook een uniek vermogen om van grootte te veranderen tijdens het volwassen leven, afhankelijk van gebruik en voeding18, en deze eigenschap heeft een grote invloed op de conditie van het organisme, sportprestaties en onafhankelijk leven. Verlies van spiermassa en functie op oudere leeftijd, sarcopenie, is een kwestie van toenemende zorg voor samenlevingen die worden geconfronteerd met een vergrijzende bevolkingvan 19,20,21.
Wij en anderen hebben ons gericht op de groei van gedefinieerde blokken skeletspierweefsel in het segmentaal herhalende lichaam van zebravislarven, als een schijnbaar gesloten systeem met enkele honderden cellen waarin weefselgroei, onderhoud en reparatie kunnen worden waargenomen en gemanipuleerd 22,23,24,25,26. Hoewel enig kwantitatief werk eerder is gemeld 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, is er geen gedetailleerde en gevalideerde methode beschikbaar voor het meten van spiergroei in cellulair detail in individuele gewervelde organismen in de loop van de tijd. Hier wordt een efficiënt protocol beschreven voor het uitvoeren van dergelijke herhaalde metingen, samen met validatie, en een voorbeeld van het gebruik ervan om veranderingen in zowel hypertrofische als hyperplastische groei te analyseren als reactie op veranderde elektrische activiteit wordt gegeven.

```html
<table><tbody><tr><td>Adhesive, Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Aerosol vacuum&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>-</td></tr><tr><td>Agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Nadat het is gesmolten, houden op 37oC in een blokverwarming om in vloeibare vorm te blijven voor herhaald gebruik.</td></tr><tr><td>Blokverwarming</td><td>Cole-Parmer</td><td>SBH130</td><td>-</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5-ceramide</td><td>Thermo Scientific</td><td>D3521</td><td>Te verdunnen in viswater en te gebruiken bij 5 &micro;M voor overnachtingsbebroeiing.</td></tr><tr><td>Krokodillenklemmen en draden</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Fiji/imageJ</td><td>National Institutes of Health, NIH</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Vismedium, Viswater</td><td>-</td><td>-</td><td>Circulerend systeemwater verzameld vanuit het viscentrum.</td></tr><tr><td>Vismedium, E3 medium</td><td>-</td><td>-</td><td>E3 wordt beschreven in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, en 0,33 mM MgSO4 in gedistilleerd water).</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16F</td><td>Fluorescentiemicroscopen van andere soort worden ook verwacht om geschikt te zijn.</td></tr><tr><td>Glasnaald</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100-6</td><td>Te vuurpolijsten om schade aan de embryo's tijdens manipulatie te voorkomen.</td></tr><tr><td>Gras stimulator</td><td>Grass Instruments</td><td>S88</td><td>Stimulators van andere soort worden ook verwacht om geschikt te zijn.</td></tr><tr><td>Kimwipes, Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>13258179</td><td>-</td></tr><tr><td>Laser scanning microscoop (LSM)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880</td><td>LSM van andere soort worden ook verwacht om geschikt te zijn.</td></tr><tr><td>Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>-</td></tr><tr><td>Objectief, 20&times;/1.0W water-immersie</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette, Gegradueerd 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-0100</td><td>-</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-1100</td><td>-</td></tr><tr><td>Petrischaal, 60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td>-</td></tr><tr><td>Plasmid, CMV-Cerulean</td><td>Christina L. Hammond (University of Bristol)</td><td></td><td>pCS2+_cerulean_kanR plasmid geïnjecteerd bij 25-75 pg bij één-cel stadium.&nbsp; Citatie: Bussman J, en Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.</td></tr><tr><td>Plasmid, pCS-mCherry-CAAX</td><td>Henry Roehl (University of Sheffield)</td><td>-</td><td>Voor in vitro transcriptie met behulp van de SP6 promotor (plasmiden met andere membraanlabelingmarkers kunnen worden gebruikt); gesynthetiseerd gekapte mRNA om te worden geïnjecteerd bij 100-200 pg bij één-cel stadium.</td></tr><tr><td>Pulse Controller&nbsp;</td><td>Hoefer Scientific Instruments</td><td>PC750</td><td>-</td></tr><tr><td>Solderbout</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat/ MS-222; op te lossen in viswater en te gebruiken bij 0,6 mM.</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Uurwerkerstangen, No. 5</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Draad, Platina</td><td>Goodfellow</td><td>PT005142/12</td><td>0,40 mm in diameter; een dure alternatief van zilver.</td></tr><tr><td>Draad, Zilver</td><td>Acros Organics</td><td>317730010</td><td>0,25 mm in diameter (een reeks diameters, dwz. 0,25-0,5 mm, werd getest, wat vergelijkbare resultaten opleverde).</td></tr><tr><td>Zebravis, myog:H2B-mRFP</td><td>David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)</td><td>-</td><td>ZFIN officiële naam: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2&nbsp; Citatie: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.</td></tr><tr><td>Zebravis, &alpha;-actin:mCherry-CAAX</td><td>Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)</td><td>-</td><td>ZFIN officiële naam: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citatie: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, en Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant tr&auml;ge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.</td></tr><tr><td>Zebravis, &beta;-actin:HRAS-EGFP</td><td>-</td><td>-</td><td>ZFIN officiële naam: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2&nbsp; Citatie: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, en Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.</td></tr><tr><td>ZEN software</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>
```

real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

Een aantal methoden kan worden gebruikt om individuele cellen in het hele lichaam van levende embryonale, larvale of juveniele zebravissen te visualiseren. We laten zien dat levende vissen met fluorescerend gemarkeerde plasmamembranen kunnen worden gescand in een confocale laserscanmicroscoop om het volume spierweefsel en het aantal aanwezige spiervezels te bepalen. Efficiënte benaderingen voor het meten van het aantal en de grootte van cellen bij levende dieren in de loop van de tijd worden beschreven en gevalideerd tegen moeilijkere segmentatiemethoden. Er worden methoden beschreven die de controle van spierele elektrische en dus contractiele activiteit mogelijk maken. Verlies van skeletspiercontractiele activiteit verminderde de spiergroei sterk. Bij larven wordt een protocol beschreven dat herintroductie van patroongevoede elektrisch opgewekte contractiele activiteit mogelijk maakt. De beschreven methoden minimaliseren het effect van interindividuele variabiliteit en maken analyse mogelijk van het effect van elektrische, genetische, medicamenteuze of omgevingsstimuli op een verscheidenheid aan cellulaire en fysiologische groeiparameters in de context van het levende organisme. Langdurige follow-up van de gemeten effecten van een gedefinieerde interventie in het vroege leven op individuen kan vervolgens worden uitgevoerd.

Een snelle en nauwkeurige meting van het somietvolume Een methode voor monstervoorbereiding, gegevensverzameling en volumetrische analyse die de snelle meting van spiergroei in zebravislarven mogelijk maakt, wordt beschreven. Spiergrootte kan worden gemeten bij levende dieren met behulp van vissen die op hun plasmamembranen zijn gelabeld met een membraangerichte GFP (β-actine: HRAS-EGFP) of mCherry (α-actine: mCherry-CAAX). Larven werden tijdelijk verdoofd met behulp van tricaïne, ge...

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Ons protocol stelt ons in staat om te bestuderen hoe weefsels, zoals skeletspieren, hun grootte reguleren, wat een belangrijke vraag blijft in de cel- en ontwikkelingsbiologie met belangrijke fysiologische en medische implicaties. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat cellulaire groei kan worden waargenomen en gemeten in levende dieren in vivo met een hoge mate van ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid. Vooruitgang in het basisbegrip van vroege spiergroei kan de ontwikkelingsoorsprong van vroege spierproblemen benadrukken en leiden tot de ontdekking van Novo Therapeutics om te beschermen tegen spierverlies bij ouderen en patiënten met spierverspillende aandoeningen.Bereid 1% LMA in een buis van 1,5 milliliter en bewaar het in een hitteblok van 37 graden Celsius voor herhaald gebruik. Selecteer vissen die moeten worden gemonteerd en verdoof elke vis tijdelijk. Om hitteschok te voorkomen, verwijdert u de LMA-aliquot uit het warmteblok en laat u deze afkoelen tot net boven de instelling.Neem een petrischaaltje van 60 milliliter dat is bedekt met een laag van 1% LMA en plaats deze op het podium van een ontleedmicroscoop. Breng de larve met een plastic Pasteur-pipet van

real-time-repeated-measurement-skeletal-muscle-growth-individual-live

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates the recording of electrical signals from the afferent neurons in a paralyzed zebrafish larva by positioning a micropipette near the lateral line ganglion and forming a loose seal for signal capture. The extracellular solution maintains neuronal viability during this process.

Monitoring Electrical Signals from the Afferent Neurons in an Immobilized Zebrafish Larva

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een...

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

Krachtmetingen kunnen worden om veranderingen in spierfunctie gevolg van ontwikkeling, verwonding, ziekte, behandeling of chemische toxiciteit tonen. In deze video, tonen we een methode om kracht te meten tijdens een maximale contractie van de zebravis larven romp spieren.

Force Measurement Tijdens Inkrimping naar Muscle Function beoordelen in zebravis Larven

De zebravis is nu een gevestigde en krachtige tool voor het modelleren van musculaire dystrofieën, aangeboren myopathieën en gerelateerde neuromusculaire ziekten. Tweekleurigheid en door aanraking veroorzaakt ontsnappingsgedrag zijn twee veelvoorkomende niet-invasieve tests die worden gebruikt om de mate van musculaire desorganisatie en bewegingsbeperking van zebravisembryo's tijdens de vroege ontwikkeling te bepalen.

Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays

Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten opnamen en manipulatie van neurale activiteit in een intact dier mogelijk maken.

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Zebravissen zijn een uitstekend model om spierfunctie en ziekte te bestuderen. Tijdens de vroege embryogenese beginnen zebravissen met regelmatige spiercontracties die een ritmisch zwemgedrag produceren, dat verandert wanneer de spier wordt verstoord. Hier beschrijven we een door aanraking veroorzaakte reactie en een locatiemeting om zwemprestaties te onderzoeken als maatstaf voor spierfunctie.

Met behulp van Touch-opgeroepen Response en Locomotion Testen om Muscle Prestaties en functie in zebravis Assess

De hier beschreven protocollen maken de studie van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen mogelijk in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden door het gebruik van zebravis-embryo's in een in vivo systeem, samen met een op fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicator (GEVI) die selectief wordt tot expressie gebracht in het celtype van belang.

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

De neuromusculaire overgang van de zebravislarve is een aantrekkelijk model voor het bestuderen van synaptische fysiologie. Het is vatbaar voor vele experimentele technieken, waaronder elektrofysiologie en optische beeldvorming. Hier beschrijven we een protocol voor het in beeld brengen van synaptische transmissie met behulp van een op pHluorin gebaseerde sonde onder een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop.

Live beeldvorming van het recyclen van synaptische blaasjes in de neuromusculaire overgang van ontlede larvale zebravissen

Leer hoe je skeletspiergroei in levende zebravissen meet met hoge ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid. Deze methode biedt inzicht in spiergroei-regulatie en mogelijke therapeutische strategieën voor spierafbraak.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit (Video) | JoVE Journal

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Meer video's verkennen