Embryo Rescue Protocol voor interspecifieke hybridisatie in squash

Het embryoreddingsprotocol is verplicht voor regeneratie van onrijpe embryo's afkomstig van interspecifieke kruisingen tussen verschillende Cucurbita-soorten. Het wordt meestal gebruikt voor kruisingen tussen Cucurbita moschata en Cucurbita pepo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud.

Het protocol gebruikt alleen MS-media met antibiotica. Daarom kan het gemakkelijk worden gerepliceerd door elk laboratorium. Het zou mogelijk zijn om deze techniek aan te passen om verschillende barrières voor interspecifieke of intergenerische hybridisatie te onderzoeken.

Aandacht besteden aan de details tijdens elke stap zal nuttig zijn voor een succesvol resultaat. Begin met het planten van de Cucurbita-planten door 50-celstartplaten van 25 bij 50 centimeter te vullen met behulp van een potmedium aangevuld met volledige stikstof-, fosfor- en kaliummeststof, met elk 1,38 gram per kilogram stikstof, fosfor en kalium. Zaai vervolgens de zaden tot een diepte gelijk aan hun lengte en bedek ze met het potmedium.

Geef de flats water zonder stilstaand water te creëren en houd de media vochtig door ze eenmaal per dag water te geven. Aan het einde van de tweede echte bladfase transplanteer je de zaailingen in potten met een diameter van 30 centimeter, aangevuld met drie eetlepels complete meststof per pot. Bemest na elke zeven dagen elke pot met 500 milliliter vloeibare meststof met 20, 20, 20 stikstof, fosfor en kalium in één gram toegevoegd aan een liter water.

Onderhoud planten in de kas bij temperaturen tussen 22 en 28 graden Celsius onder het natuurlijke lichtregime. Voor vining genotypen, zorg voor een ondersteunend traliewerk in de kas. Voer de gecontroleerde hybridisatie of bestuiving uit zodra de planten beginnen te bloeien op zes tot acht weken na het zaaien.

Controleer de ongeopende bloemen met een gele tint op de bloemblaadjes en identificeer mannelijke bloemen en vrouwelijke bloemen van Cucurbita pepo en Cucurbita moschata cultivars. Om onbedoelde bestuiving door insecten te voorkomen, plakt u de gesloten bloem aan de bovenkant voorzichtig vast met afplaktape. Voer de volgende ochtend de bestuiving uit vóór 10:00 uur door voorzichtig het afgeplakte bovenste gedeelte van de mannelijke en vrouwelijke bloem te verwijderen.

Het scheiden van de bloemblaadjes van de mannelijke bloem en het overbrengen van de pollen door de helmknop zachtjes op het vrouwelijke bloemstigma te wrijven. Sluit na bestuiving onmiddellijk de bestoven vrouwelijke bloem met afplaktape en gebruik een tag om de datum van bestuiving vast te leggen en om de vaderlijke en maternale ouders aan te geven die in het kruis zijn gebruikt. Een succesvolle kruising aangegeven door een uitgebreide eierstok zal binnen een week een kleine vrucht vormen.

Oogst het fruit na 45 tot 55 dagen bestuiving. Bereid een cefotaxime voorraad. Filtreer het door een steriel spuitfilter van 0,22 micron.

En maak 0,5 milliliter aliquot van 250 milligram per milliliter cefotaxime voordat je ze bewaart bij min 20 graden Celsius. Bereid op dezelfde manier ampicillinevoorraad voor. Filter het door een steriel spuitfilter van 0,22 micron en bereid een milliliter aliquot van 100 milligram per milliliter ampicilline voordat je ze bewaart bij min 20 graden Celsius.

Bereid Murashige en Skoog, of MS-medium door 2,45 gram van het medium op te lossen in 500 milliliter gedestilleerd water in een fles van één liter. Voeg 1,5 gram gellangom toe aan het MS-medium en autoclaaf het gedurende 20 minuten op 121 graden Celsius. Koel het medium af door de fles in een waterbad op 50 graden Celsius te plaatsen.

Ontdooi de antibioticavoorraden in de laminaire stromingskast. Breng de medium fles over naar de laminaire stromingskap en voeg 0,6 milliliter cefotaximebouillon en 0,25 milliliter ampicillinebouillon toe aan het medium met de juiste menging. Giet ongeveer zeven milliliter van het medium in een steriele petrischaal van 60 bij 15 millimeter.

Laat het medium ongeveer 15 tot 20 minuten stollen in de petrischalen. Sluit de petrischaaltjes met afdichtingsfolie en plaats ze in een opbergdoos op kamertemperatuur tot verder gebruik. Oogst het pompoenfruit door het van de hoofdrank af te snijden en desinfecteer het fruit door het oppervlak in de laboratoriumgootsteen te wassen met een vloeibaar wasmiddel zoals 0,3% chloroxylenol.

Spoel het fruit af met voldoende kraanwater en droog het af met schone papieren handdoeken voordat u het fruit overbrengt naar de laminaatluchtstroomkast. Steriliseer het fruitoppervlak in de kast door 70% ethanol te spuiten. Bisect de vrucht met een steriel mes en haal de zaden eruit.

Gebruik een steriele tang of handen met steriele handschoenen om de zaadlaag aseptisch te openen en de onrijpe embryo's bloot te stellen voordat u ze in een petrischaal met met antibiotica aangevulde MS Medium plaatst. Sluit de petriplaten af met wikkelfolie en plaats ze in een groeikamer met een temperatuur van 25 graden Celsius, een fotoperiode van 16 uur en een relatieve vochtigheid van 70%. In geval van besmetting, subcultureer de niet-verontreinigde embryo's onmiddellijk in een nieuwe plaat met hetzelfde medium.

Zodra de wortels na 10 tot 14 dagen zijn ontwikkeld en de zaadlobben na 15 tot 21 dagen zijn ontwikkeld, verwijdert u de planten uit de petrischalen en wast u voorzichtig de aanwezige media rond de wortels af met kraanwater. Leg schoongemaakte planten in een plastic bakje van 14 bij 9 bij 4 centimeter en bedek de wortels met natte papieren handdoekjes. Dek de container af en bevochtig de papieren handdoeken opnieuw indien nodig.

Houd de plastic containers op 25 tot 28 graden Celsius en in een fotoperiode van 16 uur om de planten te acclimatiseren met behoud van de vochtige conditie van papieren handdoeken. Na 7 tot 10 dagen acclimatisatie, breng de drie tot vier centimeter lange zaailingen over in 50 celflats met commerciële potgrond aangepast met kunstmest en verplaats ze naar de kas. Vermijd overbewatering om rotting te voorkomen en voeg indien nodig ongeveer 10 tot 20 milliliter water per cel toe.

In het tweede tot het derde echte bladstadium transplanteer je de zaailingen in potten met een diameter van 25 centimeter gevuld met potmedium dat is aangepast met kunstmest en voer je gecontroleerde hybridisatie uit wanneer de planten beginnen te bloeien. Houd de planten in de kas op 22 tot 28 graden Celsius onder het natuurlijke lichtregime. En evalueer de planten op fruit- en zaadkenmerken.

Vier Cucurbita pepo en 11 Cucurbita moschata werden gekozen voor interspecifieke hybridisatie. Van de 24 interspecifieke kruisingscombinaties die werden geprobeerd, werd een vruchtzetting verkregen voor 22 kruisingen die meer dan 92% succes in de vruchtzetting vertegenwoordigen. De kruisingen tussen Cucurbita moschata en Cucurbita pepo met genotypen O en M, en genotypen E en J, leverden geen rijpe vruchten op.

Terwijl de kruising tussen Cucurbita moschata en Cucurbita pepo met genotypen F en J zes vruchten opleverde. Het aantal bestoven bloemen voor verschillende kruiscombinaties varieerde van 1 tot 11. En het slagingspercentage van bestuiving varieerde van 0% tot 100% Van de 44 vruchten geproduceerd uit alle kruiscombinaties, produceerde slechts één vrucht uit een kruising tussen Cucurbita moschata en Cucurbita pepo, genotypen C en J onrijpe embryo's die konden worden gered.

Voor de ontwikkeling van deze slecht ontwikkelde embryo's werden ze gekweekt met behulp van de embryoreddingsmedia, wat resulteerde in een slagingspercentage van 80% voor embryoredding. De twee belangrijkste procedures zijn het identificeren van compatibele kruisingen tussen twee soorten, namelijk Cucurbita moschata en Cucurbita pepo, en succesvolle embryoregeneratie. Omdat de embryoreddingstechniek eenvoudig en gemakkelijk repliceerbaar is, kunnen squashkwekers wereldwijd deze techniek gebruiken voor het redden van onrijpe embryo's die zijn afgeleid van interspecifieke kruisingen tussen verschillende Cucurbita-soorten.