Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen
July 5th, 2022
Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.
Bij deze methode wordt de kracht direct op de kern uitgeoefend. Dit ontkoppelt het krachtoverdrachtseffect van het celplasmamembraan en cytoskelet en onthult de moleculaire mechanismen van nucleaire mechanosensing. De kracht wordt op een niet-invasieve manier uitgeoefend in de levende cellen.
In vergelijking met optische pincetten hebben het magnetisch veld en de magnetische kracht geen invloed op de celfuncties en hebben ze een hogere doorvoer. Begin met het kweken van de cellen met magnetische microbeads door 0,2 gram carbonylijzermicroeads met een gemiddelde diameter van zeven micrometer te wegen. Hang de microbeads in één milliliter RPMI 1640 kweekmedium met behulp van een pipet.
Neem vervolgens de petrischaal met B2B-cellen mee naar de bioveiligheidskast en voeg snel 200 microliter van het medium met microbeads toe aan de petrischaal. Plaats de petrischaal in een incubator totdat microbeads door de cellen zijn geïnternaliseerd. Open de omgekeerde microscoop en bepaal met behulp van confocale fluorescentiebeeldvorming elke zes uur de optimale tijd voor de internalisatie van de cellijnen door de microbead-, nucleaire en celgrens te visualiseren.
De geïnternaliseerde microbeads zullen aanwezig zijn binnen de celgrens. Voor toepassing met een kleine kracht en live-cell imaging opent u de softwaretoepassing Elements. Als u de magnetische configuratiezoeker wilt definiëren, klikt u op de knop één over twee om de scansnelheid in te stellen op één frame per twee seconden.
Stel de grootte van het gaatje in op 1,2 Luchtige eenheid. Controleer alleen het FITC-kanaal en stel PMT HV in op 70, offset als nul, laserintensiteit op 10. Als u de magnetische YAP-kern van de configuratie wilt definiëren, stelt u de scansnelheid in op één frame per vier seconden door op de knop één over vier te klikken.
Klik vervolgens op de knop 1.2 Airy unit om de grootte van het gaatje in te stellen op 1.2 Airy unit en controleer het FITC-kanaal. Stel PMT HV in op 70, offset als nul, laserintensiteit op 10. Voor het in beeld brengen van de kerngrens en de intensiteit van de kernvlek, controleert u het cyanine 5-kanaal.
Klik niet op de knop 1.2 Airy unit en stel PMT HV in op 70, offset op nul en laserintensiteit op 10. De pinhole-grootte zal worden geoptimaliseerd voor driedimensionale YES-geassocieerde eiwitbeeldvorming. Schakel vervolgens de DIA in via Elements.
Open de spinweergave, gebruik een brightfield en pas de focus van het object aan om een duidelijk scherp beeld van cellen te krijgen. Gebruik een 10X-objectief om geschikte meerdere afzonderlijke cellen te vinden in drie omstandigheden, zoals een cel met een enkele microbead erin, met meerdere microbeads erin en zonder microbead erin. Schakel vervolgens over naar 40X-objectief en geef deze positie een naam met het juiste positienummer.
Open Elements, klik op magnetisch zoeken, verwijder interlock, scantabs en selecteer vervolgens de bovenste en onderste knoppen om de Z-positie van het brandpuntsvlak aan te passen voor het instellen van de onder- en bovengrens voor de Z-stapel van de geselecteerde cellen. Stop het scannen door nogmaals op scannen te klikken. Schakel over naar magnetische YAP-kernconfiguratie en stel de bestandsnaam in als before_small_force.nd2.
Klik op de knop Uitvoeren met de opgenomen Z-stack. Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open de draaiweergave en klik op de opnameknop.
Verplaats de magneet tot 46 millimeter boven de bodem van de petrischaal door aan de knop van het magneetbewegende apparaat te draaien. Sla de video op en controleer deze om de verplaatsing van microbeads veroorzaakt door magnetische kracht te bevestigen. Herhaal de scanprocedure door de bestandsnaam in te stellen op after_small_force.nd2.
Schakel vervolgens over naar het juiste lichtpad, schakel DIA in en open de spinweergave voordat u op de opnameknop klikt. Draai de magneetbewegingsknop tot 120 millimeter boven de bodem van de petrischaal en sla een brightfield-beeldreeks of video op. Herhaal de stappen voor het scannen door de bestandsnaam in te stellen op before_large_force.nd2.
De microbeads kunnen geen fluorescentie uitzenden onder laserexcitatie in het FITC- of cyanine 5-kanaal. De geïnternaliseerde microbeads werden dus geïdentificeerd door de donkere holte in de confocale beeldvorming van fluorescentie van YES-geassocieerd eiwit en kern. Nucleaire circulariteit toonde geen significant verschil tussen controlecellen en cellen met microbead-internalisatie.
De YES-geassocieerde eiwitcelkern-cytoplasmaverhouding van controlecellen die samen met microbead maar zonder internalisatie werden gekweekt en cellen met microbead-internalisatie vertoonden ook geen significant verschil. De kernvervorming en depolymerisatie van actine werden veroorzaakt door de compressiekracht die door de microbeads in cytoskeletbevattende cellen werd uitgeoefend. De kalibratiecurve van de kwantitatieve beeldvormingsanalyse die wordt geleverd door de kwantitatieve AFM-krachtverplaatsingsrelatie.
Op basis van deze relatie werd de toegepaste kracht van de kralen geschat. De kernvervorming en YES-geassocieerde eiwittranslocatie werden waargenomen bij toepassing of het vrijkomen van de magnetische kracht. De intensiteitsveranderingen in YES-geassocieerd eiwit in het groene kanaal en geen verandering in de kernkleuring in het rode kanaal bevestigden dat de magnetische kracht-geïnduceerde nucleaire vervorming veroorzaakt door de YES-geassocieerde eiwittranslocatie.
De kwantificering van de nettoverandering van de YES-geassocieerde eiwitkern-cytoplasmaverhouding binnen twee groepen bevestigde dat de magnetische kracht toegepast op de microbeads in het cytoplasma de YES-geassocieerde eiwittranslocatie veroorzaakte en de YES-geassocieerde eiwitkern-tot-cytoplasmaverhouding veranderde. Voordat u kracht en beeldvorming toepast, moet u ervoor zorgen dat de cellen de magnetische microbeads hebben geïnternaliseerd en dat de kralen zich binnen de celgrens bevinden.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt een nieuw protocol voor het toepassen van mechanische kracht rechtstreeks op de celkern met behulp van magnetische microbeads in levende cellen, terwijl het live-cel fluorescente beeldvorming mogelijk maakt. Deze techniek biedt inzichten in nucleaire mechanosensing-mechanismen, functionerend zonder celprocessen te verstoren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Mechanobiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Begrip van nucleaire mechanosensing is cruciaal voor celfunctie.
- Bestaande technieken zoals optische pincetten zijn invasief en minder efficiënt.
- Magnetische microbeads bieden een niet-invasieve methode om deze mechanismen te bestuderen.
Gebruikte methoden
- Toepassing van mechanische kracht met behulp van magnetische microbeads.
- Live-cel beeldvorming met confocale fluorescentiemicroscopie.
- Kwantitatieve beeldanalyse om kracht-geïnduceerde nucleaire vervorming te meten.
Belangrijkste resultaten
- Krachttoepassing van microbeads leidde tot nucleaire vervorming en YES-geassocieerde eiwittranslocatie.
- Geen significante verschillen in nucleaire circulariteit tussen controlecellen en cellen met microbead internalisatie.
- De studie bevestigt dat magnetische kracht nucleaire mechanotransductie-routes beïnvloedt.
Conclusies
- Dit protocol vergroot het begrip van nucleaire mechanosensing.
- Het biedt een niet-invasieve aanpak voor het onderzoeken van cellulaire mechanica en signaalroutes.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct mechanical interrogation of the cell nucleus using 3D magnetic force actuators and live-cell fluorescence imaging enables precise, non-invasive analysis of nuclear mechanotransduction. This approach addresses a critical gap in understanding how nuclear mechanics influence cellular signaling, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. The method's quantitative outputs and real-time readouts position it as a strategic asset for mechanistic de-risking and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of nuclear mechanosensing hypotheses independent of membrane and cytoskeletal confounders.
- Supports functional validation of mechanotransduction pathways by quantifying YES-associated protein (YAP) dynamics in response to controlled nuclear deformation.
- Provides mechanistic de-risking by isolating nuclear contributions to cellular signaling, informing target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, live-cell systems for downstream mechanobiology assays.
- Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for YAP translocation and nuclear deformation metrics.
- Enables standardization of force application and imaging parameters, supporting assay scalability and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanobiology by modeling nuclear responses to mechanical stress in engineered cell lines.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing quantitative biomarkers of nuclear mechanotransduction.
- Reduces translational risk by clarifying the role of nuclear mechanics in cell function and pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct, quantitative assessment of nuclear mechanotransduction, supporting both hypothesis-driven research and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nuclear mechanosensing and pathway clarification by decoupling nuclear and cytoplasmic effects.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of mechanosensitive responses.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of nuclear deformation and YAP translocation for robust statistical analysis.
- Translational Research: Offers mechanistic insights relevant to disease models where nuclear mechanics are implicated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanobiology studies across diverse cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating nuclear mechanotransduction mechanisms.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanobiology assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through quantitative, real-time readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanosensitive targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, magnetic force application, and quantitative image analysis.
- Needs access to confocal fluorescence microscopy and magnetic actuator instrumentation.
- Demands cross-team standardization of force calibration and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or mechanosensitive pathways.
- Throughput and force range are limited by microbead internalization efficiency and imaging speed.
