Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Bij deze methode wordt de kracht direct op de kern uitgeoefend. Dit ontkoppelt het krachtoverdrachtseffect van het celplasmamembraan en cytoskelet en onthult de moleculaire mechanismen van nucleaire mechanosensing. De kracht wordt op een niet-invasieve manier uitgeoefend in de levende cellen.

In vergelijking met optische pincetten hebben het magnetisch veld en de magnetische kracht geen invloed op de celfuncties en hebben ze een hogere doorvoer. Begin met het kweken van de cellen met magnetische microbeads door 0,2 gram carbonylijzermicroeads met een gemiddelde diameter van zeven micrometer te wegen. Hang de microbeads in één milliliter RPMI 1640 kweekmedium met behulp van een pipet.

Neem vervolgens de petrischaal met B2B-cellen mee naar de bioveiligheidskast en voeg snel 200 microliter van het medium met microbeads toe aan de petrischaal. Plaats de petrischaal in een incubator totdat microbeads door de cellen zijn geïnternaliseerd. Open de omgekeerde microscoop en bepaal met behulp van confocale fluorescentiebeeldvorming elke zes uur de optimale tijd voor de internalisatie van de cellijnen door de microbead-, nucleaire en celgrens te visualiseren.

De geïnternaliseerde microbeads zullen aanwezig zijn binnen de celgrens. Voor toepassing met een kleine kracht en live-cell imaging opent u de softwaretoepassing Elements. Als u de magnetische configuratiezoeker wilt definiëren, klikt u op de knop één over twee om de scansnelheid in te stellen op één frame per twee seconden.

Stel de grootte van het gaatje in op 1,2 Luchtige eenheid. Controleer alleen het FITC-kanaal en stel PMT HV in op 70, offset als nul, laserintensiteit op 10. Als u de magnetische YAP-kern van de configuratie wilt definiëren, stelt u de scansnelheid in op één frame per vier seconden door op de knop één over vier te klikken.

Klik vervolgens op de knop 1.2 Airy unit om de grootte van het gaatje in te stellen op 1.2 Airy unit en controleer het FITC-kanaal. Stel PMT HV in op 70, offset als nul, laserintensiteit op 10. Voor het in beeld brengen van de kerngrens en de intensiteit van de kernvlek, controleert u het cyanine 5-kanaal.

Klik niet op de knop 1.2 Airy unit en stel PMT HV in op 70, offset op nul en laserintensiteit op 10. De pinhole-grootte zal worden geoptimaliseerd voor driedimensionale YES-geassocieerde eiwitbeeldvorming. Schakel vervolgens de DIA in via Elements.

Open de spinweergave, gebruik een brightfield en pas de focus van het object aan om een duidelijk scherp beeld van cellen te krijgen. Gebruik een 10X-objectief om geschikte meerdere afzonderlijke cellen te vinden in drie omstandigheden, zoals een cel met een enkele microbead erin, met meerdere microbeads erin en zonder microbead erin. Schakel vervolgens over naar 40X-objectief en geef deze positie een naam met het juiste positienummer.

Open Elements, klik op magnetisch zoeken, verwijder interlock, scantabs en selecteer vervolgens de bovenste en onderste knoppen om de Z-positie van het brandpuntsvlak aan te passen voor het instellen van de onder- en bovengrens voor de Z-stapel van de geselecteerde cellen. Stop het scannen door nogmaals op scannen te klikken. Schakel over naar magnetische YAP-kernconfiguratie en stel de bestandsnaam in als before_small_force.nd2.

Klik op de knop Uitvoeren met de opgenomen Z-stack. Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open de draaiweergave en klik op de opnameknop.

Verplaats de magneet tot 46 millimeter boven de bodem van de petrischaal door aan de knop van het magneetbewegende apparaat te draaien. Sla de video op en controleer deze om de verplaatsing van microbeads veroorzaakt door magnetische kracht te bevestigen. Herhaal de scanprocedure door de bestandsnaam in te stellen op after_small_force.nd2.

Schakel vervolgens over naar het juiste lichtpad, schakel DIA in en open de spinweergave voordat u op de opnameknop klikt. Draai de magneetbewegingsknop tot 120 millimeter boven de bodem van de petrischaal en sla een brightfield-beeldreeks of video op. Herhaal de stappen voor het scannen door de bestandsnaam in te stellen op before_large_force.nd2.

De microbeads kunnen geen fluorescentie uitzenden onder laserexcitatie in het FITC- of cyanine 5-kanaal. De geïnternaliseerde microbeads werden dus geïdentificeerd door de donkere holte in de confocale beeldvorming van fluorescentie van YES-geassocieerd eiwit en kern. Nucleaire circulariteit toonde geen significant verschil tussen controlecellen en cellen met microbead-internalisatie.

De YES-geassocieerde eiwitcelkern-cytoplasmaverhouding van controlecellen die samen met microbead maar zonder internalisatie werden gekweekt en cellen met microbead-internalisatie vertoonden ook geen significant verschil. De kernvervorming en depolymerisatie van actine werden veroorzaakt door de compressiekracht die door de microbeads in cytoskeletbevattende cellen werd uitgeoefend. De kalibratiecurve van de kwantitatieve beeldvormingsanalyse die wordt geleverd door de kwantitatieve AFM-krachtverplaatsingsrelatie.

Op basis van deze relatie werd de toegepaste kracht van de kralen geschat. De kernvervorming en YES-geassocieerde eiwittranslocatie werden waargenomen bij toepassing of het vrijkomen van de magnetische kracht. De intensiteitsveranderingen in YES-geassocieerd eiwit in het groene kanaal en geen verandering in de kernkleuring in het rode kanaal bevestigden dat de magnetische kracht-geïnduceerde nucleaire vervorming veroorzaakt door de YES-geassocieerde eiwittranslocatie.

De kwantificering van de nettoverandering van de YES-geassocieerde eiwitkern-cytoplasmaverhouding binnen twee groepen bevestigde dat de magnetische kracht toegepast op de microbeads in het cytoplasma de YES-geassocieerde eiwittranslocatie veroorzaakte en de YES-geassocieerde eiwitkern-tot-cytoplasmaverhouding veranderde. Voordat u kracht en beeldvorming toepast, moet u ervoor zorgen dat de cellen de magnetische microbeads hebben geïnternaliseerd en dat de kralen zich binnen de celgrens bevinden.