Name: Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Leer een niet-invasieve methode voor nucleaire mechanobiologie met magnetische microdeeltjes en confocale fluorescentiebeeldvorming in levende cellen. Deze techniek onthult mechanosensormechanismen en YES-geassocieerde eiwittranslocatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project wordt gefinancierd door UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), de UFHCC Pilot Award (X. T. en Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) en UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). We waarderen oprecht de intellectuele discussies met en de technische ondersteuning van Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE &ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgie), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (Universiteit van Arizona), en ondersteuningsteam van Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon en Jon Ekman). We zijn zeer dankbaar voor de effectieve steun van alle leden van Tang's, Yamaguchi's, Sharma's, Au's, Siemann's en Guan's onderzoekslaboratoria en alle medewerkers van de UF MAE-afdeling.

1. Onderhoud van CRISPR/Cas9-engineered B2B cellen
<ol><li>Kweek B2B-cellen in een T25-kolf met RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Bewaar de B2B-cellen in een bevochtigde incubator op 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Subcultuur de B2B-cellen wanneer de samenvloeiing 70% tot 80% bereikt.</li>
	<li>Bewaar de B2B cellijn in RPMI-1640 kweekmedium met 10% (v/v) DMSO in een -80 °C vriezer.</li>
	<li>Gebruik de B2B-cellen met een passagegetal van minder dan 10 in de experimenten.</li>
</ol>2. Celkweek
<ol><li>Zaai de cellen op een petrischaaltje met glazen bodem.<ol><li>Verplaats de kolf met B2B-cellen naar binnen van de incubator naar de bioveiligheidskast.</li>
		<li>Verwijder het kweekmedium in de kolf met behulp van een aanzuigende pipet met een aangesloten vacuümpomp.</li>
		<li>Was de kolf met 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
		<li>Verwijder PBS met de aanzuigende pipet.</li>
		<li>Voeg 0,5 ml 0,05% Trypsine-oplossing toe om cellen los te maken van de bodem van het kolfsubstraat.</li>
		<li>Zet de kolf 5 min in de couveuse.</li>
		<li>Verplaats de kolf naar de bioveiligheidskast. Voeg 5 ml nieuw kweekmedium toe aan de kolf en pipetteer de oplossing op en neer.</li>
		<li>Deponeer 50 μL van het medium met cellen (300 cellen/μL) op de petrischaal met glazen bodem. Voeg 2 ml kweekmedium toe aan de petrischaal.</li>
		<li>Plaats de petrischaal in de couveuse. Wacht 12 uur totdat de cellen zich hechten.</li>
	</ol></li>
	<li>Kweek de cellen met magnetische microbeads.<ol><li>Weeg 0,2 g van 7 μm gemiddelde diameter carbonyl ijzer microbeads (hierna 7 μm microbeads genoemd, zie de tabel met materialen).</li>
		<li>Gebruik een pipet om de microbeads op te hangen in 1 ml RPMI-1640 kweekmedium.</li>
		<li>Neem de petrischaal met B2B-cellen mee naar de bioveiligheidskast.</li>
		<li>Voeg 200 μL van het medium met microbeads toe aan de petrischaal. OPMERKING: Voeg het medium snel toe om neerslag van de microbeads te voorkomen.</li>
		<li>Plaats de petrischaal terug in de incubator totdat microbeads door de cellen zijn geïnternaliseerd. Controleer de internalisatie elke 6 uur om de optimale tijd voor internalisatie voor verschillende cellijnen te bepalen.</li>
		<li>Om de internalisatie te controleren, voert u confocale fluorescentiebeeldvorming uit om de microbead-, nucleaire en celgrens te visualiseren. Als de microbead door de cel wordt geïnternaliseerd, bevindt deze zich binnen de celgrens.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualisatie van de kern
<ol><li>Verwarm 1,5 ml van het kweekmedium in de incubator gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Doe het licht van de bioveiligheidskast uit. Neem de petrischaal met de cel, het verwarmde kweekmedium, de kernvlek en de Verapamil HCl in de bioveiligheidskast. OPMERKING: Nucleaire kleuringscomponenten zijn gevoelig voor licht. Vermijd blootstelling aan licht tijdens het gebruik.</li>
	<li>Verdun 1000x kernvlek door DMSO tot 100x.</li>
	<li>Verdun 100 mM Verapamil HCl door DMSO tot 10 mM.</li>
	<li>Voeg 15 μL 100x kernvlek en 15 μL 10 mM Verapamil HCl toe aan 1,5 ml kweekmedium. Meng goed door op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Haal het kweekmedium uit de petrischaal. Voeg het kweekmedium met nucleaire kleuring toe aan de petrischaal.</li>
	<li>Zet de cellen terug in de incubator gedurende meer dan 2 uur.</li>
</ol>4. Voorbereiding van de hardware voor magnetische krachttoepassing
<ol><li>3D-print alle onderdelen met acrylonitrilbutadieen styreen (ABS) en monteer ze volgens het CAD-ontwerp (figuur 1A). Het CAD-ontwerp is opgenomen in de materiaaltabel.</li>
	<li>Gebruik dubbelzijdige tape om de magneet aan het magneetbewegende apparaat te bevestigen (figuur 1A).</li>
	<li>Plaats het magneetbewegende apparaat naast de microscoopfase. Gebruik de drie knoppen om de ruimtelijke locatie van de magneet aan te passen totdat deze tussen 13 mm en 120 mm boven de petrischaal kan bewegen. OPMERKING: Zorg ervoor dat de bovengrens van de afstand tussen de magneet en de petrischaal zo groot mogelijk is om ongewenste krachttoediening op de magnetische microbeads te voorkomen. 120 mm is de maximale waarde in deze experimentele opstelling. Zorg ervoor dat de magneet niet interfereert met microscooponderdelen, inclusief doelstellingen en gemotoriseerde stadia.</li>
	<li>Zet de magneet op de hoogste z-stand (op 120 mm).</li>
</ol>5. Force applicatie en live-cell imaging
<ol><li>Opstelling van de omgevingskamer voor beeldvorming op lange termijn<ol><li>Breng 75% ethanoloplossing aan om de omgevingskamer grondig te steriliseren en te reinigen.</li>
		<li>Plaats de omgevingskamer op het gemotoriseerde stadium van de omgekeerde microscoop.</li>
		<li>Open de CO2-tank en stel het CO 2-indebiet in op 160 ml/ min.</li>
		<li>Stel de temperatuur van de kamer in op 44 °C (boven), 42 °C (bad) en 40 °C (stadium).</li>
		<li>Voeg 20 ml gezuiverd water toe aan het bad van de omgevingskamer om 90% luchtvochtigheid te behouden.</li>
		<li>Verwijder de petrischaal met glazen bodem die doelcellen bevat uit de weefselkweekincubator en plaats deze in de kamer.</li>
		<li>Breng de metalen klem van de omgevingskamer aan om de positie van de petrischaal te bevestigen. OPMERKING: De petrischaal moet stevig in de kamer worden geklemd, omdat de magnetische kracht de schotel kan verplaatsen als deze niet wordt vastgeklemd.</li>
		<li>Sluit het deksel van de kamer.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimalisatie van beeldvormingsparameters<ol><li>Optimaliseer de grootte van het gaatje: het gaatje blokkeert de onscherpe fotonen. Een groter gaatje levert meer onscherpe fotonen op, maar een helderder beeld. Een kleiner gaatje zorgt voor een scherper en zwakker beeld. Zorg ervoor dat u de grootte van het gaatje optimaliseert om in-focus confocale beelden te krijgen met de juiste signaal-ruisverhouding.</li>
		<li>Optimaliseer de laserintensiteit: De laserintensiteit bepaalt de intensiteit van excitatie en dus emissielicht. De lage laserintensiteit geeft een lage signaal-ruisverhouding. Een te hoge laserintensiteit veroorzaakt fotobleaching. Pas de laserintensiteit dienovereenkomstig aan.</li>
		<li>Optimaliseer de stapgrootte en stappen: Stappen en stapgrootte bepalen hoeveel afbeeldingen in een Z-stack worden gebruikt. Kleinere stapgroottes en meer stappen zullen de Z-stack resolutie verhogen, maar zullen ook de fotobleaching verhogen. In dit experiment werd een stapgrootte van 1 μm gebruikt voor de cellen met een celhoogte van ~15 μm.</li>
		<li>Optimaliseer de belichtingstijd: De belichtingstijd bepaalt hoe lang de cel wordt blootgesteld aan de excitatielaser. Een lage belichtingstijd zal de signaal-ruisverhouding verlagen. Een hoge belichtingstijd zal fotobleaching veroorzaken. In dit experiment werd een belichtingstijd van 1 frame per 4 s gebruikt.</li>
		<li>Optimalisatie van beeldparameters: wijzig een van de vier parameters iteratief en houd de andere parameters consistent. Meet elke keer de YAP N/C-verhouding van elke afbeelding en vergelijk de YAP N/C-ratioverandering om het fotobleachingsniveau te bepalen. Herhaal het optimalisatieproces totdat een balans is bereikt tussen de signaal-ruisverhouding, beeldsnelheid en fotobleaching.</li>
		<li>Definieer de beeldbewerkingsconfiguraties met behulp van de geoptimaliseerde beeldparameters voor snellere beeldinstellingen tijdens de experimenten. OPMERKING: Configuraties die in dit onderzoek worden gebruikt, worden beschreven in rubriek 5.3 van de beeldvormingsparameters. Om de beeldparameters van configuraties in paragraaf 5.3 te optimaliseren, gebruikt u dezelfde methode als in stap 5.2.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Toepassing met kleine krachten en confocale beeldvorming OPMERKING: Nikon Ti2-E microscoop werd gebruikt voor beeldvorming in deze studie, en gedetailleerde stappen voor beeldacquisitie worden hieronder gegeven.<ol><li>Open de omgekeerde microscoop. Open de softwaretoepassing Elements.</li>
		<li>Definieer configuratie magnetic_find. Controleer alleen het FITC-kanaal. Stel PMT HV in = 70, Offset = 0, Laserintensiteit = 10. Stel de scansnelheid in op 1 frame per 2 s door op de knop 1/2 te klikken. Stel de grootte van het gaatje in op 1,2 AU door op de knop 1.2 A.U. te klikken. Deze configuratie wordt gebruikt in stap 5.3.5.</li>
		<li>Definieer configuratie magnetic_YAP_Nucleus. Controleer het FITC-kanaal. Stel PMT HV in = 70, Offset = 0, Laserintensiteit = 10. Stel de scansnelheid in op 1 frame per 4 s door op de knop 1/2 te klikken. Stel de grootte van het gaatje in op 1,2 AU door op de knop 1.2 A.U. te klikken. Om de kerngrens en de intensiteit van de kernvlek in beeld te brengen, controleert u het Cy5-kanaal. Stel PMT HV in = 70, Offset = 0, Laserintensiteit = 10. De grootte van het gaatje is geoptimaliseerd voor 3D YAP-beeldvorming. Klik niet opnieuw op de 1.2 A.U.- knop nadat u het Cy5-kanaal hebt gecontroleerd. Deze configuratie wordt gebruikt in stap 5.3.7.</li>
		<li>Schakel INDIEN NODIG DIA in via Elements . Open SpinView, gebruik een helder veld en pas de focus van het object aan om een duidelijk scherpstellend beeld van cellen te krijgen. Gebruik een 10x-objectief om geschikte meerdere afzonderlijke cellen te vinden in drie omstandigheden: met een enkele microbead erin, met meerdere microbeads erin en zonder microbead erin. Schakel over naar 40x-doelstelling. Geef deze positie een naam met het juiste positienummer.</li>
		<li>Open elementen. Klik op magnetic_find. Klik op de knop Interlock verwijderen .</li>
		<li>Klik op Scannen en pas de Z-positie van het brandpuntsvlak aan. Klik op de knoppen Boven en Onder om de onder- en bovengrens in te stellen voor de Z-stack van de geselecteerde cellen. Stop het scannen door nogmaals op Scannen te klikken.</li>
		<li>Schakel over naar magnetic_YAP_Nucleus configuratie. Stel bestandsnaam in als before_small_force.nd2. Klik op de knop Uitvoeren met de opgenomen Z-stack.</li>
		<li>Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open SpinView en klik op de opnameknop. Draai ondertussen aan de knop van het magneetbewegende apparaat om de magneet tot 46 mm boven de bodem van de petrischaal te verplaatsen. Sla de reeks heldere veldafbeeldingen of video op. Bekijk de video om te bevestigen dat microbeads verplaatsingen vertonen die worden veroorzaakt door magnetische kracht.</li>
		<li>Herhaal stap 5.3.5-5.3.7; stel de bestandsnaam in op after_small_force.nd2.</li>
		<li>Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open vervolgens SpinView en klik op de opnameknop. Draai ondertussen aan de knop van het magneetbewegende apparaat om de magneet tot 120 mm boven de bodem van de petrischaal te bewegen. Sla de reeks heldere veldafbeeldingen of video op.</li>
		<li>Herhaal stap 5.3.5-5.3.7 en stel de bestandsnaam in op before_large_force.nd2.</li>
	</ol></li>
	<li>Toepassing met grote kracht en confocale beeldvorming<ol><li>Verwijder het deksel van de omgevingskamer zodat de magneet 13 mm boven de bodem van de petrischaal kan komen.</li>
		<li>Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open SpinView en klik op de opnameknop. Draai ondertussen aan de knop van het magneetbewegende apparaat om de magneet naar beneden te bewegen tot 13 mm boven de bodem van de petrischaal. Sla de reeks heldere veldafbeeldingen of video op. Bekijk de video om te bevestigen dat microbeads verplaatsingen vertonen die worden veroorzaakt door magnetische kracht.</li>
		<li>Herhaal stap 5.3.5-5.3.7 en stel de bestandsnaam in op after_large_force.nd2.</li>
		<li>Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open vervolgens SpinView en klik op de opnameknop. Draai ondertussen aan de knop van het magneetbewegende apparaat om de magneet tot 120 mm boven de bodem van de petrischaal te bewegen. Sla de reeks heldere veldafbeeldingen of video op.</li>
		<li>Herhaal stap 5.3.5-5.3.7; stel de bestandsnaam in op retract_large_force.nd2.</li>
		<li>Sluit de deksel van de omgevingskamer.</li>
	</ol></li>
	<li>Herhaal stap 5.2 en 5.3 voor meerdere gezichtsvelden om indien nodig meer gegevens te verkrijgen.</li>
</ol>6. Beeldverwerking en data-analyse
<ol><li>Kwantificering van de YAP N/C-ratio<ol><li>Open Fiji ImageJ. Open de .nd2-afbeeldingen die in stap 5 zijn gemaakt.</li>
		<li>Klik op Analyseren > Metingen instellen. Controleer gebied, geïntegreerde dichtheid, gemiddelde grijswaarde en vormbeschrijvingen.</li>
		<li>Gebruik het Cy5-kanaal om de kern te identificeren. Klik op Freehand Selections om de vrije selectietool te gebruiken om de kern te schetsen. Controleer ook de macro van het automatische nucleaire masker in ImageJ (zie de tabel met materialen).</li>
		<li>Klik op Analyseren > meten in het FITC-kanaal. De gemeten waarde van het gemiddelde is de gemiddelde nucleaire YAP-intensiteit DN.</li>
		<li>Gebruik het Cy5-kanaal om de kern te identificeren. Gebruik het FITC-kanaal om de cel te identificeren. Klik op Selecties uit de vrije hand om de vrije selectietool te gebruiken om een interessant gebied binnen het cytoplasma te selecteren en de magnetische microbead te vermijden. Deze regio van belang mag de kern niet omvatten.</li>
		<li>Klik op Analyseren > meten in het FITC-kanaal. De gemeten waarde van het gemiddelde is de gemiddelde cytoplasmatische YAP-intensiteit DC.</li>
		<li>Bereken de YAP N/C ratio = DN / DC.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificering van nucleaire vorm en genormaliseerde kernvlekintensiteit<ol><li>Open Fiji ImageJ. Open de .nd2-afbeeldingen die in stap 5 zijn gemaakt.</li>
		<li>Klik op Analyseren > Metingen instellen. Controleer gebied, geïntegreerde dichtheid, gemiddelde grijswaarde en vormbeschrijvingen.</li>
		<li>Gebruik het Cy5-kanaal om de kern te identificeren. Klik op Freehand Selections om de vrije selectietool te gebruiken om de kern te schetsen.</li>
		<li>Klik op Analyseren > Meten in Cy5 kanaal. De gemeten waarde van het gemiddelde is de intensiteit van de kernvlek. De gemeten waarde van Circ. is nucleaire circulariteit.</li>
		<li>Om de kernvlekintensiteit bij verschillende krachttoestanden te vergelijken, wordt alle kernvlekintensiteit gedeeld door de kernvlekintensiteit in "before_small_force.nd2" om de genormaliseerde kernvlekintensiteit te genereren.</li>
	</ol></li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten aan te kondigen.

Internalisatie van magnetische microbeads (sectie 2.2) is van cruciaal belang omdat extracellulaire microbeads niet rechtstreeks kracht kunnen uitoefenen op de kern. Krachttoepassing en beeldvorming (paragraaf 5.3) zijn kritieke stappen in dit experiment en de kracht die nodig is om de kern te vervormen en zinvolle biologische gevolgen te veroorzaken, kan steekproefafhankelijk zijn. De krachtmagnitude in dit experiment (0,8 nN en 1,4 nN) kan verder worden verhoogd om nucleaire mechano-detectie in minder gevoelige cellen ...

Deze studie heeft tot doel een nieuwe techniek te ontwikkelen en toe te passen om kernmechanobiologie op te helderen door de magnetische actuatoren die mechanische kracht rechtstreeks op de celkern uitoefenen te combineren met de confocale fluorescentiemicroscopie die tegelijkertijd de structurele en functionele subcellulaire veranderingen in beeld brengt. Cellen detecteren extracellulaire biofysische signalen, waaronder weefselstijfheid 1,2,3,4, interstitiële vloeistofdruk en schuifspanning 5,6,7, oppervlaktetopologie/geometrie 8,9,10,11,12 en spanning/compressiespanning 13,14, 15,16. Biofysische signalen worden omgezet in biochemische signalen en veroorzaken potentiële stroomafwaartse veranderingen van genexpressie en celgedrag - een proces dat bekend staat als mechanotransductie 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Om mechanotransductieprocessen te bestuderen, zijn talloze technieken ontwikkeld om mechanische kracht op de cellen uit te oefenen, zoals atoomkrachtmicroscopie28, celrekapparaat29, bio-MEMS (micro-elektromechanische systemen) krachtsensor 15,30,31, afschuifreologie 32 en Stereo Vision System33 . Een recente review vat de benaderingen samen om extracellulaire mechanische signalen toe te passen en te interfereren met mechanosensing34. Tot op heden oefenen de meeste van deze methoden kracht uit op het celplasmamembraan en cellen ontvangen deze extracellulaire biofysische signalen rechtstreeks via membraanreceptoren zoals integrine, cadherine, ionkanalen en G-eiwit-gekoppelde receptoren. Vervolgens geven ze het signaal door aan het intracellulaire cytoskelet en de kern. Bijvoorbeeld, met behulp van yes-associated protein (YAP) translocatie als een indicator van mechano-sensing, wordt aangetoond dat cellen de mechanische signalen van substraatstijfheid en extracellulaire spanning van het celmembraan detecteren en deze via het cytoskelet naar de kern overbrengen om YAP-cytoplasma-naar-kerntranslocatie te induceren28,35.
Recent bewijs suggereert dat de celkern zelf een onafhankelijke mechano-sensoris 8,36,37. Dit wordt bewezen door experimenten uitgevoerd op de geïsoleerde kern geoogst uit cellen, waar werd onthuld dat kernen adaptief hun stijfheid veranderen als reactie op de mechanische kracht die direct op hen wordt uitgeoefend36. Tijdens veel fysiologische omstandigheden voelen kernen in zowel tumor- als gezonde cellen extracellulaire biofysische signalen en veranderen hun mechanische eigenschappen en assemblages 38,39,40. Bijvoorbeeld, bij extravasatie neemt de nucleaire stijfheid van tumorcellen af en handhaaft de zachtheid gedurende meer dan 24 h38. Tijdens de migratie door de besloten interstitiële ruimte verliezen en herstellen de kernen van tumorcellen vaak hun structurele integriteit39. De manier waarop de kern het biofysische signaal waarneemt, is echter onbekend, hoewel verschillende nucleaire enveloppe-eiwitten en families van eiwitten betrokken zijn gebleken, zoals Lamin A / C en linker van nucleoskelet en cytoskelet (LINC) complex38,41. Vandaar dat nieuwe niet-invasieve methoden die direct kracht kunnen uitoefenen op de kern het effect van krachtoverdracht van het cel-plasmamembraan en cytoskelet zullen loskoppelen en zullen helpen de voorheen ontoegankelijke moleculaire mechanismen van nucleaire mechano-detectie op te helderen.
Onderzoek waarbij optische pincetten werden gebruikt om organellen42 te manipuleren en microbeads geïnjecteerd in cellen43 toonde het technologische vermogen aan om direct kracht uit te oefenen op de kern. De optische pincettechniek heeft echter verschillende beperkingen: (1) optische pincetten met lage doorvoer manipuleren vaak maar één cel of microbead tegelijk; en (2) potentiële fotoschade en temperatuurartefact-vervorming van kernenergie vereist tientallen pN36, en het overeenkomstige benodigde laservermogen is ongeveer 10 mW per pN 44,45. Een dergelijke laserintensiteit is voldoende om fotoschade in de cellen te veroorzaken en de functies van de perturbcel tijdens het experimentte verstoren 46.
Magnetische kracht toegepast door microbeads in levende cellen toont het potentieel om direct kracht uit te oefenen op de kern en overwint de beperkingen van optische pincetten. Zodra microbeads in het cytoplasma worden afgeleverd, kan een magnetisch veld een magnetische kracht uitoefenen op meerdere microbeads tegelijkertijd op een manier met hoge doorvoer. Het magnetisch veld beïnvloedt de celfuncties niet47, maar genereert kracht van pN naar nN, wat voldoende is om nucleaire vervorming te induceren 36,48,49. Tot op heden is manipulatie van magnetische microbeads toegepast op celplasmamembraan48, in het cytoplasma50, op F-actine51, in de kern47 en op de geïsoleerde kern36. Magnetische manipulatie van microbeads is echter nooit gebruikt om directe mechanische kracht op de nucleaire envelop toe te passen om mechanotransductie in de kern te bestuderen.
In dit artikel wordt een eenvoudige techniek ontwikkeld om niet-invasief magnetische microbeads in het cytoplasma af te leveren en deze microbeads te gebruiken om mechanische kracht op de kern uit te oefenen (figuur 1). Hier worden CRISPR / Cas9-engineered menselijke normale B2B-cellijnen gebruikt die endogeen mNeonGreen21-10 / 11-gelabelde YAP uitdrukken om de methode te valideren. YAP is een mechano-gevoelig eiwit en de translocatie van YAP wordt gereguleerd door nucleaire mechano-sensing14,28. De CRISPR/Cas9-gereguleerde knock-in benadering werd gekozen om endogene YAP te taggen met een fluorescerend eiwit (FP) mNeonGreen21-10/11. Hoewel bekend is dat CRISPR-bewerking onvolledige efficiëntie en off-target effect heeft, integreerden de protocollen in eerdere publicaties fluorescentiesortering om te selecteren op correcte open leesframe-invoeging 52,53,54. Met deze extra selectielaag werd geen off-target tagginggebeurtenis waargenomen in meer dan 20 cellijnen die eerder52,53,54,55 genereerden. Dit is een gesplitst fluorescerend eiwitconstruct, maar in principe zou elke expresseerbare fluorescerende tag bruikbaar kunnen zijn. Deze etiketteringsbenadering is superieur aan transgene- of antilichaammethoden. Ten eerste, in tegenstelling tot de transgene expressie, handhaaft het getagde eiwit single-copy gendosering en expressie in de fysiologische context van het inheemse gen regulerende netwerk, waardoor afwijkingen in eiwitconcentratie, lokalisatie en interactie worden beperkt. De taggingmethode die in deze studie wordt gebruikt, bereikt een orde van grootte hogere doorvoer en efficiëntie dan volledige FP-tagging. Het vermijdt ook uitdagingen in verband met immunofluorescentie als gevolg van fixatieartefacten en de beperkte beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen met hoge specificiteit. Ten tweede zorgt de benadering die in dit artikel wordt gebruikt voor minimale verstoring van de celfysiologie en maakt de real-time openbaring van alle endogene YAP's op authentieke wijze mogelijk. Andere gangbare transgene methoden leiden daarentegen vaak tot overexpressie van YAP. De resulterende kunstmatige distributie kan mogelijk cytotoxiciteit veroorzaken en de mechano-detectie van cellen beïnvloeden 56,57,58.
Deze studie presenteert een protocol om direct kracht uit te oefenen op de kern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren. Samenvattend laten de hier gepresenteerde protocollen zien hoe (1) magnetische microbeads in de cel kunnen worden afgeleverd terwijl ze zich buiten de kern bevinden, (2) de microbeads manipuleren om magnetische kracht op de kern uit te oefenen, (3) confocale fluorescerende beeldvorming van de cellen uitvoeren tijdens manipulatie, en (4) kwantitatief de YAP-verhouding tussen nucleair en cytoplasma (N / C) analyseren tijdens het krachttoepassingsproces. De resultaten suggereren dat (1) door endocytose magnetische microbeads niet-invasief kunnen worden afgeleverd in het cytoplasma van B2B-cellen binnen 7 uur (figuur 2 en figuur 3); en (2) gekwantificeerde magnetische kracht die rechtstreeks op de kern wordt uitgeoefend (figuur 4, figuur 5 en figuur 6) alleen kan leiden tot diverse veranderingen in de YAP N/C-verhouding in CRISPR/Cas9-gemanipuleerde B2B-cellen (figuur 7 en figuur 8).

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 flacon</td><td>Corning</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>7-&micro;m gemiddelde diameter carbonyl ijzer microbeads</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>A1R confocal systeem</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl IJzer Poeder CM</td><td>BASF</td><td>30042253</td><td>Magnetische microbead</td></tr><tr><td>Kweekmedium (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Bureaucomputer</td><td>Dell</td><td></td><td>met Windows 10 besturingssysteem</td></tr><tr><td>Omgevingskamer TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>National Institutes of Health en het Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal met glazen bodem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Magneet</td><td>K&amp;J Magnetics, Inc.</td><td>D99-N52</td><td></td></tr><tr><td>Monochrome Camera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements software platform</td><td>Nikon</td><td></td><td>software platform</td></tr><tr><td>Nucleus masker ImageJ macro</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td></tr><tr><td>NucSpot Live 650</td><td>Biotium</td><td>#40082</td><td>Nucleaire kleuring</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ti2-E omgekeerde microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYZ mover (CAD bestanden)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td></tr></tbody></table>

combinatie van 3d magnetic force actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om nucleus mechanobiology te bestuderen

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Een fundamentele vraag in de mechanobiologie is hoe levende cellen extracellulaire mechanische stimuli waarnemen in de context van celfysiologie en pathologie. De cellulaire mechano-sensatie van extracellulaire mechanische stimuli wordt verondersteld zich te bevinden via de membraanreceptoren, het bijbehorende eiwitcomplex en het cytoskelet. Recente ontwikkelingen in de mechanobiologie tonen aan dat de celkern in het cytoplasma zelf onafhankelijk mechanische stimuli tegelijkertijd kan waarnemen. Een mechanistisch begrip van hoe de celkern mechanische stimuli detecteert, transduceert en erop reageert, ontbreekt echter, voornamelijk vanwege de technische uitdagingen bij het openen en kwantificeren van de kernmechanica met conventionele hulpmiddelen. Dit artikel beschrijft het ontwerp, de fabricage en de implementatie van een nieuwe magnetische krachtactuator die nauwkeurige en niet-invasieve 3D-mechanische stimuli toepast om de celkern direct te vervormen. Met behulp van CRISPR/Cas9-engineered cellen toont deze studie aan dat deze tool, in combinatie met hoge resolutie confocale fluorescerende beeldvorming, de onthulling mogelijk maakt van de real-time dynamiek van een mechano-gevoelig yes-associated protein (YAP) in enkele cellen als functie van kernvervorming. Deze eenvoudige methode heeft het potentieel om de huidige technologische kloof in de mechanobiologiegemeenschap te overbruggen en antwoorden te bieden op de kenniskloof die bestaat in de relatie tussen nucleusmechanotransductie en celfunctie.

Ontwerp van een magneetbewegend apparaat en toepassing van magnetische kracht Om kracht uit te oefenen op de kern door de magnetische microbeads, werd een magneetbewegend apparaat ontworpen en gebouwd om de ruimtelijke positie van de magneet te regelen. Het magneetbewegende apparaat bevat een centraal frame, drie knoppen en rails om de aangesloten magneet onafhankelijk van elkaar in x-, y- en z-richting te bewegen met een ruimtelijke resolutie van 1,59 mm per cyclus (figuur 1A</st...

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

Bij deze methode wordt de kracht direct op de kern uitgeoefend. Dit ontkoppelt het krachtoverdrachtseffect van het celplasmamembraan en cytoskelet en onthult de moleculaire mechanismen van nucleaire mechanosensing. De kracht wordt op een niet-invasieve manier uitgeoefend in de levende cellen.In vergelijking met optische pincetten hebben het magnetisch veld en de magnetische kracht geen invloed op de celfuncties en hebben ze een hogere doorvoer. Begin met het kweken van de cellen met magnetische microbeads door 0,2 gram carbonylijzermicroeads met een gemiddelde diameter van zeven micrometer te wegen. Hang de microbeads in één milliliter RPMI 1640 kweekmedium met behulp van een pipet.Neem vervolgens de petrischaal met B2B-cellen mee naar de bioveiligheidskast en voeg snel 200 microliter van het medium met microbeads toe aan de petrischaal. Plaats de petrischaal in een incubator totdat microbeads door de cellen zijn geïnternaliseerd. Open de omgekeerde microscoop en bepaal met behulp van confocale fluorescentiebeeldvorming elke zes uur de optimale tijd voor de internalisatie van de cellijnen door de microbead-, nucleaire en celgrens te visualiseren.De geïnternaliseerde microbeads zullen aanwezig zijn binnen de celgrens. Voor toepassing met een kleine kracht en live-cell imaging opent u de softwaretoepassing Elements. Als u de magnetische configuratiezoeker wilt definiëren, klikt u op de knop één over twee om de scansnelheid in te stellen op één frame per twee seconden.Stel de grootte van het gaatje in op 1,2 Luchtige eenheid. Controleer alleen het FITC-kanaal en stel PMT HV in op 70, offset als nul, laserintensiteit op 10. Als u de magnetische YAP-kern van de configuratie wilt definiëren, stelt u de scansnelheid in op één frame per vier seconden door op de knop één over vier te klikken.Klik vervolgens op de knop 1.2 Airy unit om de grootte van het gaatje in te stellen op 1.2 Airy unit en controleer het FITC-kanaal. Stel PMT HV in op 70, offset als nul, laserintensiteit op 10. Voor het in beeld brengen van de kerngrens en de intensiteit van de kernvlek, controleert u het cyanine 5-kanaal.Klik niet op de knop 1.2 Airy unit en stel PMT HV in op 70, offset op nul en laserintensiteit op 10. De pinhole-grootte zal worden geoptimaliseerd voor driedimensionale YES-geassocieerde eiwitbeeldvorming. Schakel vervolgens de DIA in via Elements.Open de spinweergave, gebruik een brightfield en pas de focus van het object aan om een duidelijk scherp beeld van cellen te krijgen. Gebruik een 10X-objectief om geschikte meerdere afzonderlijke cellen te vinden in drie omstandigheden, zoals een cel met een enkele microbead erin, met meerdere microbeads erin en zonder microbead erin. Schakel vervolgens over naar 40X-objectief en geef deze positie een naam met het juiste positienummer.Open Elements, klik op magnetisch zoeken, verwijder interlock, scantabs en selecteer vervolgens de bovenste en onderste knoppen om de Z-positie van het brandpuntsvlak aan te passen voor het instellen van de onder- en bovengrens voor de Z-stapel van de geselecteerde cellen. Stop het scannen door nogmaals op scannen te klikken. Schakel over naar magnetische YAP-kernconfiguratie en stel de bestandsnaam in als before_small_force.nd2.Klik op de knop Uitvoeren met de opgenomen Z-stack. Schakel over naar het juiste lichtpad en schakel DIA in. Open de draaiweergave en klik op de opnameknop.Verplaats de magneet tot 46 millimeter boven de bodem van de petrischaal door aan de knop van het magneetbewegende apparaat te draaien. Sla de video op en controleer deze om de verplaatsing van microbeads veroorzaakt door magnetische kracht te bevestigen. Herhaal de scanprocedure door de bestandsnaam in te stellen op after_small_force.nd2.Schakel vervolgens over naar het juiste lichtpad, schakel DIA in en open de spinweergave voordat u op de opnameknop klikt. Draai de magneetbewegingsknop tot 120 millimeter boven de bodem van de petrischaal en sla een brightfield-beeldreeks of video op. Herhaal de stappen voor het scannen door de bestandsnaam in te stellen op before_large_force.nd2.De microbeads kunnen geen fluorescentie uitzenden onder laserexcitatie in het FITC- of cyanine 5-kanaal. De geïnternaliseerde microbeads werden dus geïdentificeerd door de donkere holte in de confocale beeldvorming van fluorescentie van YES-geassocieerd eiwit en kern. Nucleaire circulariteit toonde geen significant verschil tussen controlecellen en cellen met microbead-internalisatie.De YES-geassocieerde eiwitcelkern-cytoplasmaverhouding van controlecellen die samen met microbead maar zonder internalisatie werden gekweekt en cellen met microbead-internalisatie vertoonden ook geen significant verschil. De kernvervorming en depolymerisatie van actine werden veroorzaakt door de compressiekracht die door de microbeads in cytoskeletbevattende cellen werd uitgeoefend. De kalibratiecurve van de kwantitatieve beeldvormingsanalyse die wordt geleverd door de kwantitatieve AFM-krachtverplaatsingsrelatie.Op basis van deze relatie werd de toegepaste kracht van de kralen geschat. De kernvervorming en YES-geassocieerde eiwittranslocatie werden waargenomen bij toepassing of het vrijkomen van de magnetische kracht. De intensiteitsveranderingen in YES-geassocieerd eiwit in het groene kanaal en geen verandering in de kernkleuring in het rode kanaal bevestigden dat de magnetische kracht-geïnduceerde nucleaire vervorming veroorzaakt door de YES-geassocieerde eiwittranslocatie.De kwantificering van de nettoverandering van de YES-geassocieerde eiwitkern-cytoplasmaverhouding binnen twee groepen bevestigde dat de magnetische kracht toegepast op de microbeads in het cytoplasma de YES-geassocieerde eiwittranslocatie veroorzaakte en de YES-geassocieerde eiwitkern-tot-cytoplasmaverhouding veranderde. Voordat u kracht en beeldvorming toepast, moet u ervoor zorgen dat de cellen de magnetische microbeads hebben geïnternaliseerd en dat de kralen zich binnen de celgrens bevinden.

combining-3d-magnetic-force-actuator-multi-functional-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

We presenteren twee onafhankelijke, microscoop-gebaseerde tools om de veroorzaakte nucleaire en cytoskelet vervormingen in enkele, levende hechtende cellen te meten in reactie op globale of lokale stam toepassing. Deze technieken worden gebruikt om de nucleaire stijfheid (dat wil zeggen, vervormbaarheid) te bepalen en om intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet sonde.

Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Er is onlangs een aantal FRET-gebaseerde krachtbiosensoren ontwikkeld, waardoor de proteïne-specifieke resolutie van intracellulaire kracht mogelijk is. In dit protocol laten we zien hoe een van deze sensoren, ontworpen voor de linker van het nucleoskelet-cytoskelet (LINC) complex-eiwit Nesprin-2G kan worden gebruikt om actomyosinekrachten op het nucleaire LINC-complex te meten.

Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex

In dit protocol beschrijven we een micropipet-methode om een gecontroleerde kracht direct toepassen in de kern in een levende cel. Deze bepaling laat ondervraging van nucleaire mechanische eigenschappen in de cel levend, aanhangend.

Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Met behulp van een eerder ontworpen apparaat om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen, dit document beschrijft een vernieuwde substratum geometrie en een aangepaste apparaat voor hoge-resolutie single-cell beeldvorming van gespannen cellen met een 100x olie onderdompeling doelstelling.

Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Leer een niet-invasieve methode voor nucleaire mechanobiologie met magnetische microdeeltjes en confocale fluorescentiebeeldvorming in levende cellen. Deze techniek onthult mechanosensormechanismen en YES-geassocieerde eiwittranslocatie.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen (Video) | JoVE Journal

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Meer video's verkennen