Name: Microfluïdische synthese van microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteiger (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Leer microfluïdische synthese van monodisperse microgel-bouwstenen voor microporeuze steigers. Deze methode biedt verbeterde controle over porositeit en weefselintegratie voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Joe de Rutte en het Di Carlo Lab aan de Universiteit van Californië, Los Angeles, bedanken voor hun hulp bij het oorspronkelijke microfluïdische apparaatontwerp waaruit het gerapporteerde apparaat is ontwikkeld, evenals hun vroege begeleiding bij de fabricage en probleemoplossing van PDMS-apparaten. Figuurschema's zijn gemaakt met Biorender.com.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dit protocol beschrijft methoden voor het synthetiseren en karakteriseren van microgels, die dienen als de bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) scaffolds. Dit protocol maakt gebruik van een microfluïdische benadering met hoge doorvoer om grote hoeveelheden uniforme microgels te genereren, wat niet kan worden bereikt met andere methoden zoals flow-focusing microfluidics 1,4,7,9 (hoge monodisperisty, lage opbrengst), batch-emulsie 6,10 en elektrospraying 5,12 (lage monodispersiteit, hoge opbrengst). Met de hierin beschreven methoden kunnen monodisperse microgels worden gemaakt voor gebruik in MAP-steigers die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan regeneratieve geneeskundetoepassingen (bijv. Celafgifte, wondgenezing).
Een cruciale stap van dit protocol is het maken van de PDMS microfluïdische apparaten. Als de apparaten niet correct zijn gemaakt, kan dit negatieve stroomafwaartse effecten hebben op de vorming van microgel en monodispersiteit. Het is belangrijk om de introductie van artefacten (d.w.z. bellen, stof) in het PDMS te voorkomen voordat het uithardt, omdat dit de kanalen kan verstoppen en de vorming van microgel aanzienlijk kan beïnvloeden. Om dit zoveel mogelijk te beperken, moet men tape gebruiken om stof te verwijderen, de apparaten in een stofvrije container op te slaan en indien mogelijk in een stofvrije kap te werken. Het wordt ook aanbevolen om de apparaten op 60 °C te bewaren voor het beste resultaat met de oppervlaktebehandeling.
Bij het gieten van de PDMS-apparaten is het belangrijk om een uniforme dikte te behouden die ongeveer gelijk is aan of kleiner is dan de lengte van de biopsiepons. Als het apparaat te dik is, kan de biopsiepunch niet helemaal doordringen. Het is ook cruciaal om de in- en uitlaat van het PDMS-apparaat niet te scheuren tijdens het ponsen met de biopsiepunch en / of het inbrengen van slangen. Een scheur in het PDMS-apparaat veroorzaakt lekkage uit de in- / uitlaat, wat verlies van de gelprecursoroplossing kan veroorzaken. Als er lekken zijn in een PDMS-apparaat, is de beste oplossing om het zo snel mogelijk te vervangen door een nieuw apparaat.
Bij plasmabehandeling van het apparaat heeft het gebruik van zuivere zuurstof en plasmabehandeling gedurende 30 s de beste resultaten opgeleverd voor het hechten van PDMS aan de glasplaat. Als het apparaat niet correct hecht (d.w.z. het PDMS kan na plasmabehandeling nog steeds van de glasschuif worden getild), moet men dubbel controleren of de plasmabehandelaar correct werkt en of het apparaat en de dia's grondig zijn gereinigd. Het is ook belangrijk om de juiste silaan oppervlaktebehandeling te gebruiken en voor de beste resultaten moeten de PDMS-apparaten direct voor gebruik aan het oppervlak worden behandeld. Andere methoden van oppervlaktebehandeling, zoals chemische dampafzetting, kunnen ook worden gebruikt.
Een andere cruciale stap is het correct gebruik van de PDMS-microfluïdische apparaten voor microgelvorming. Het wordt aanbevolen om een debietverhouding van ten minste 2: 1 te gebruiken (dit protocol gebruikt een oliedebiet van 6 ml / h en een waterig debiet van 3 ml / h), maar dit kan worden afgestemd om de gewenste microgelgrootte te bereiken. De pH van de microgel precursor oplossing is ook een belangrijke metriek om te optimaliseren om verstopping van het apparaat te voorkomen. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) versnelt thiolaatvorming in michael-type additiechemie, en de PBS-concentraties die in dit protocol worden gebruikt, leveren de beste resultaten op voor microgelgelation in de microfluïdische apparaten. Zodra de spuitpompen zijn gestart, kunnen er enkele bubbels in de microfluïdische kanalen zijn, maar dit zou na een paar minuten in evenwicht moeten zijn. Het wordt aanbevolen om de vorming van microgel met een microscoop te controleren. Als de stroming er niet hetzelfde uitziet als in deze video en/of als er een paar kanalen zijn die grote deeltjes produceren, is dit waarschijnlijk te wijten aan problemen met de oppervlaktebehandelingsstap. De beste oplossing is om het apparaat te vervangen door een apparaat dat vers aan het oppervlak is behandeld.
Als de microgels lijken samen te smelten, kan dit te wijten zijn aan een onvoldoende concentratie FluoroSurfactant. De aanbevolen oplossing is om de wt% van de oppervlakteactieve stof in de oliefase te verhogen. Een beperking op het gebruik van hoge concentraties oppervlakteactieve stof is echter dat het moeilijker kan zijn om het tijdens de zuiveringsstap te verwijderen. Het wordt aanbevolen om microfluïdische apparaten slechts eenmaal te gebruiken, maar de apparaten kunnen opnieuw worden gebruikt als ze onmiddellijk na gebruik met Novec-olie worden gespoeld om waterige oplossing te verwijderen die in het apparaat kan gelen en de kanalen kan verstoppen. Terwijl één microfluïdisch apparaat een volume microgels met hoge doorvoer (ml / h) kan produceren, kan deze productiesnelheid worden geschaald door meerdere microfluïdische apparaten parallel te gebruiken.
De gloeistap van MAP-steigerassemblage is afhankelijk van het gebruik van een lichtgeactiveerde foto-initiator van radicale polymerisatie en de foto-initiator kan worden geselecteerd op basis van de gewenste toepassing. LAP-foto-initiator heeft bijvoorbeeld snelle gloeitijden (<30 s) bij gebruik van langgolvig UV-licht, wat een minimale impact heeft op de levensvatbaarheid van cellen in vitro14. Deze golflengte wordt echter sterk geabsorbeerd door weefsel16 en heeft in vivo mogelijk niet zo'n hoge gloeieffectiviteit als in vitro.
Eosine Y is een andere foto-initiator geactiveerd door zichtbare golflengten (505 nm) en heeft een diepere penetratie in weefsel, wat het vermogen van de MAP-steiger om onder weefsel te worden gegloeid verbetert. De lange blootstellingstijden voor licht die nodig zijn voor eosine Y-gloeien kunnen echter de blootstelling van cellen aan vrije radicalen verlengen en de levensvatbaarheid van de botscellen in vitro14 verlengen. Het gebruik van deze methoden voor high-throughput generatie van zeer uniforme microgel-bouwstenen zal map steigergericht onderzoek versnellen en kennis bevorderen op het gebied van injecteerbare poreuze materialen voor regeneratieve geneeskunde.

Het MAP-steigerplatform is een injecteerbaar biomateriaal dat volledig bestaat uit hydrogelmicrodeeltjes (microgels) die microporositeit op celschaal bieden wanneer ze aan elkaar worden gekoppeld, wat afbraakonafhankelijke celmigratie en bulkweefselintegratie mogelijk maakt1. Vanwege het vermogen om snel te integreren met gastheerweefsel en de inherent lage immunogeniciteit, heeft het MAP-steigerplatform preklinische toepasbaarheid aangetoond voor een breed scala aan regeneratieve geneeskundetherapieën 2,3,4,5,6,7,8,9,10, inclusief het versnellen van dermale wondgenezing 1,3 ,11, revasculariseren van herseninfarctholte7, het leveren van mesenchymale stamcellen2 en het verstrekken van weefselophoping om glottische insufficiëntie te behandelen6. Van MAP is ook aangetoond dat het ontstekingsremmende effecten overbrengt op gastheerweefsel door de rekrutering van M2-macrofagen3 en kan zelfs worden afgestemd om een Th2 "weefselherstel" immuunrespons te bevorderen8. Deze gunstige eigenschappen van het MAP-steigerplatform maken het mogelijk om het uit te breiden naar een breed scala aan klinische toepassingen.
Eerder gepubliceerde methoden voor het genereren van microgels voor MAP-steigervorming omvatten flow-focusing droplet-microfluidics 1,4,7,9, electrospraying 5,12 en overhead spinning met batch-emulsie 6,10. De druppelmicrofluïdische methode kan deeltjes met een hoge monodispersiteit produceren, maar maakt gebruik van zeer langzame stroomsnelheden die lage opbrengsten van deeltjes (μL / h) produceren. Als alternatief kunnen de elektrospraying- en batch-emulsiemethoden een hoog volume deeltjes produceren, maar met een hoge deeltjespolydispersiteit. Dit protocol maakt gebruik van een high-throughput microfluïdische methode om microgels te produceren met een monodisperse populatie, gebaseerd op werk van de Rutte et al13. Deze methode maakt gebruik van zachte lithografietechnieken om een polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdisch apparaat te maken van een fotomasker, dat vervolgens wordt gebonden aan een glazen dia. Het ontwerp van het apparaat is gebaseerd op stapemulgering om een groot volume microgeldeeltjes (ml / h) te genereren. De monodispersiteit die met deze methode kan worden bereikt, biedt een superieure controle van porositeit in vergelijking met andere technieken, omdat monodisperse microgels steigers kunnen vormen met meer uniforme poriegroottes2.
De methoden voor het synthetiseren en karakteriseren van de individuele microgels die kunnen fungeren als bouwstenen voor MAP-steigers worden in dit manuscript geschetst, met name in termen van het maken van microgels die bestaan uit een PEG-ruggengraat met een maleimide (MAL) -groep, die gemakkelijk deelneemt aan efficiënte Michael-type toevoeging met thiol-gefunctionaliseerde crosslinkers voor microgelgelation. Om microgelgelation los te koppelen van MAP scaffold annealing, beschrijft dit manuscript ook hoe een gepubliceerd14 aangepast gloeiend macromeer, MethMAL, kan worden gesynthetiseerd, een heterofunctioneel methacrylamide / maleimide 4-arm PEG-macromeer. De functionele groepen van methacrylamide nemen gemakkelijk deel aan fotopolymerisatie van vrije radicalen (voor microgelgloeien), terwijl ze relatief inert blijven voor de omstandigheden die Michael-type toevoeging voor de MAL-functionele groepen bevorderen.
Bovendien schetst dit manuscript de protocollen voor het maken van PDMS-microfluïdische apparaten, het bepalen van microgelgelation kinetica en het karakteriseren van microgelgrootte. Het laatste deel van het manuscript beschrijft map steigergloeien, dat is wanneer de microgels in situ worden overgezet in een bulksteiger door middel van een secundaire, foto-geïnitieerde crosslinking-stap die de oppervlakken van de microgels covalent aan elkaar bindt. Het is belangrijk op te merken dat er andere gloeimethoden zijn die kunnen worden geïmplementeerd in MAP-steigersystemen die niet afhankelijk zijn van op licht gebaseerde chemicaliën, zoals enzymgemedieerd gloeien, zoals eerder beschreven1. Over het algemeen kunnen deze methoden direct worden gebruikt of worden gebruikt met verschillende hydrogelformuleringschemie (bijvoorbeeld op basis van hyaluronzuur) om MAP-steigers voor elke toepassing te genereren.

<table><tbody><tr><td>2-aminoethanethiol hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>AC153770250</td><td>Voor MethMal Synthese MW: 113.61 Da</td></tr><tr><td>35 mm plate rotor</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>Geometrie voor HAAKE viscometer</td></tr><tr><td>4-arm PEG-Maleimide (10 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td><td>Voor microgel precursor oplossing</td></tr><tr><td>4-arm PEG-Maleimide (20 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-200MA</td><td>Voor MethMal Synthese Moleculair gewicht specifiek voor elke batch</td></tr><tr><td>BD Syringe met Luer-Lok Tips</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Kikkers kunststof spuiten</td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Mitex</td><td>MLTX33-31A-P/25</td><td>1,5 mm diameter</td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC209561000</td><td>Voor MethMal Synthese</td></tr><tr><td>Collimated LED Lichtbron</td><td>ThorLabs</td><td>M365LP1-C1</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>Kweekschaal (15 cm)</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholiniumchloride)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>151882</td><td>Voor MethMal Synthese MW: 276,72 Da</td></tr><tr><td>Fluorosurfactant</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>5 gewichtspercentage van 008-Flurosurfactant in HFE7500</td></tr><tr><td>FreeZone Triad Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7400000 Series</td><td>Voor MethMal Synthese Lyofilisator</td></tr><tr><td>Glazen slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Eenvoudige glazen slides, ongecoat</td></tr><tr><td>HAAKE Rheowin viscometer</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>versie 1.8.0_172</td></tr><tr><td>KDS Legato 210 Dual Prong Spuitpomp</td><td>Kd Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>Lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td>Foto-initiator</td></tr><tr><td>Methacrylic Zuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>155721</td><td>Voor MethMal Synthese MW: 86,09 Da Dichtheid: 1,015 g/mL</td></tr><tr><td>Microfluïdische apparaat SU8-Si master wafer</td><td>FlowJem</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt, met silanization</td></tr><tr><td>MMP-2 afbreekbare crosslinker</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Volgorde: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2</td></tr><tr><td>Naalden (25 G, beveeld)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Lengte: 15,88 mm Gauge: 0,5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td>7100025016</td><td>Gefluorineerde olie</td></tr><tr><td>Zuurstof</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>Gecomprimeerd</td></tr><tr><td>Peek buis</td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>1/32" Buitendiameter; 0,02" Binnendiameter; 10' Lengte</td></tr><tr><td>PFOCTS (trichloo(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Voor oppervlaktebehandeling</td></tr><tr><td>Fosfaat Gebufferde Saline</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Verdund tot 1x in ultrapure water, pH = 7,4</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>Vleesmesje</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD cel adhesie peptide</td><td>WatsonBio Sciences</td><td></td><td>Volgorde: Ac-RGDSPGGC-NH2</td></tr><tr><td>Rheowin software</td><td>HAAKE&nbsp;</td><td></td><td>Software compatibel met HAAKE viscometer</td></tr><tr><td>Scalpel mes</td><td>Bard-Parker</td><td>371210</td><td>Grootte: #10</td></tr><tr><td>Scalpel handvat</td><td>Bard-Parker</td><td>371030</td><td>Grootte: #3</td></tr><tr><td>Natrium Chloride</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>Voor MethMal Synthese MW: 58,44 Da</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomeer kit</td><td>DOW Chemical</td><td>2065622</td><td>Basis en uithardingsmiddel</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4884-100</td><td>Voor MethMal Synthese MW: 101,19 Da Dichtheid: 0,73 g/mL</td></tr><tr><td>Tygon buis</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>AAD04103</td><td>ID: 0,51 mm OD: 1,52 mm</td></tr><tr><td>Varian Inova 500 Spectrometer</td><td>Varian</td><td></td><td>NMR Gelegen in de UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility</td></tr></tbody></table>

microfluïdische synthese van microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteiger

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

Het microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigerplatform is een subklasse van granulaire hydrogels. Het bestaat uit een injecteerbare slurry van microgels die een structureel stabiele steiger kan vormen met porositeit op celschaal in situ na een secundaire op licht gebaseerde chemische crosslinking-stap (d.w.z. gloeien). MAP scaffold heeft succes getoond in een verscheidenheid aan toepassingen voor regeneratieve geneeskunde, waaronder dermale wondgenezing, stemplooivergroting en stamcelafgifte. Dit artikel beschrijft de methoden voor synthese en karakterisering van poly(ethyleenglycol) (PEG) microgels als de bouwstenen om een MAP-steiger te vormen. Deze methoden omvatten de synthese van een aangepast gloeiend macromeer (MethMAL), bepaling van microgel precursor gelation kinetica, microfluïdische apparaat fabricage, microfluïdische generatie van microgels, microgel zuivering en basis scaffold karakterisering, inclusief microgel sizing en scaffold annealing. In het bijzonder kunnen de microfluïdische methoden met hoge doorvoer die hierin worden beschreven, grote hoeveelheden microgels produceren die kunnen worden gebruikt om MAP-steigers te genereren voor elke gewenste toepassing, vooral op het gebied van regeneratieve geneeskunde.

Het doel van dit protocol is om alle stappen te schetsen die nodig zijn voor het synthetiseren van microgel-bouwstenen voor gebruik in een MAP-steiger. Het MethMAL gloeimacromeer is zeer selectief en efficiënt en compatibel met meerdere polymeerbackbones14. Het is belangrijk dat ten minste 67%-75% van de 20 kDa PEG-maleimide wordt gemodificeerd met methacrylamide functionele groepen om een hoge gloeiefficiëntie te garanderen. Procentuele modificatie kan het gemakkelijkst worden bepaald door 1H-NMR-spectrapieken te analyseren, zoals weergegeven in figuur 1. De gelation kinetica, bepaald door een viscometer, is een belangrijke maatstaf om te overwegen voor elke gelformulering. Dit protocol maakt gebruik van een gelprecursoroplossing bestaande uit een PEG-backbone met een MAL-groep, die efficiënt reageert met thiol-gefunctionaliseerde crosslinkers voor microgelgelation. Veel hydrogelchemie kan echter worden gebruikt om microgels te fabriceren via de microfluïdische methode met hoge doorvoer die hierin wordt beschreven. De tijd tot het begin van de gelation zal inzicht geven in de duur van microfluïdische microgelgeneratie. Het wordt aanbevolen om een gelvoorloper pH te kiezen die de gelatatie tussen 30 minuten (figuur 2) en 2 uur kan initiëren.
Als de gelatatietijd te snel is, zal de gelprecursoroplossing beginnen te polymeriseren in het microfluïdische apparaat en de kanalen verstoppen. Daarnaast is het belangrijk op te merken dat het veranderen van thiolated ligandconcentraties (bijv. RGD) gevolgen kan hebben voor de netwerkvorming tijdens gelation en mogelijk moet worden verantwoord door de formulering aan te passen. De fabricagestappen van het microfluïdische apparaat kunnen vervelend zijn, maar representatieve resultaten van een succesvol gebonden apparaat worden weergegeven in figuur 3. Dit protocol maakt gebruik van een high-throughput, geparallelliseerd, stap-emulgering microfluïdisch apparaat dat is aangepast naar een ontwerp van de Rutte et al.13, en de fabricage van siliciumwafers werd uitbesteed aan een microfluïdisch technologiebedrijf. De stappen die in dit protocol worden beschreven, kunnen echter worden gebruikt met elk apparaatontwerp dat is geëtst op een SU-8 silicium waferfotomasker. Het is belangrijk op te merken dat de stapgrootte van de kanalen op het fotomasker moet worden geoptimaliseerd tijdens de fabricage van het apparaat, omdat dit de grootte van de microgeldeeltjes zal beïnvloeden.
De stroomsnelheden voor de microfluïdische generatie van microgels moeten worden geoptimaliseerd voor elke gelformulering op basis van factoren zoals gelatatietijd, gewenste deeltjesgrootte en microfluïdisch apparaatontwerp. Als u het apparaat met hoge doorvoer gebruikt, kunnen de stroomsnelheden voor de waterige fase oplopen tot 5 ml / h. Figuur 4B toont de instelling voor apparaten met een hoge doorvoer die in dit protocol worden gebruikt. Als het apparaat correct werkt, moet de microgelformatie er hetzelfde uitzien als in figuur 4D. Vóór de zuivering zullen de microgels ondoorzichtig zijn. Na het voltooien van de verschillende olie-, PBS- en hexaanwassingen, moet de gel er helder uitzien als de representatieve afbeelding in figuur 5. Als een fluorofoor in de microgels wordt opgenomen, kan het gezuiverde product een licht gekleurde tint hebben, maar moet het nog steeds dicht bij doorschijnend zijn. Na zuivering en zwelling moeten de microgels zeer uniform van grootte zijn en een PDI hebben tussen 1,00 en 1,05, zoals weergegeven in figuur 6. Verschillende foto-initiators kunnen worden gebruikt voor het fotograferen van MAP-steigers. Bij gebruik van een alternatief voor LAP, zoals hierin beschreven, moet men de gloeikinetiek bepalen zoals eerder beschreven14. Daarnaast kunnen verschillende lichtbronnen worden gebruikt voor photoannealing, zolang de lichtbron overeenkomt met de foto-initiator. Men moet ervoor zorgen dat de lichtbron wordt gekalibreerd en scherpgesteld. De gloeitijd en lichtintensiteit moeten mogelijk worden geoptimaliseerd op basis van gelformulering en foto-initiatorconcentratie. De gloeimethode die in dit protocol wordt beschreven, kan worden gebruikt voor in vitro en in vivo studies. Na het gloeien vormen de microgels een poreuze steiger die kan worden gevisualiseerd met tweefotonenmicroscopie (figuur 7B-C).

Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het synthetiseren van de microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteigers, die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan regeneratieve geneeskundetoepassingen.

Microfluïdische synthese van microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteiger

The microporous annealed particle (MAP) scaffold platform is a subclass of granular hydrogels. It is composed of an injectable slurry of microgels that ...

De high throughput fabricage van monodispersed microgel bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteigers zorgt voor een verbeterde controle van de porositeit van steigers. Dit kan van invloed zijn op de poriegrootte en de daaropvolgende resultaten van weefselintegratie. Dit protocol maakt gebruik van een microfluïdische benadering met hoge doorvoer om grote hoeveelheden monodispersed microgels te genereren die niet kunnen worden bereikt met andere methoden zoals flowfocusmicrofluïdica, batch-emulsie en elektrospraying.De gegenereerde microgels kunnen worden gevormd tot microporeuze gegloeide deeltjessteigers die voordelig zijn voor regeneratieve geneeskundetoepassingen vanwege de porositeit van de celschaal die snel weefsel en groei mogelijk maakt. Begin met het voorbereiden van één glazen dia per PDMS-microfluïdisch apparaat. Gebruik tape, gefilterde lucht of isopropylalcoholwassingen om stof van de dia te verwijderen.Plaats een glazen schuif in een PDMS-apparaatontwerpschuif naast elkaar op een 96-wells plaatdeksel en plaats deze in een plasmareiniger. Sluit de deur en de luchtstroomklep en zet de vacuümpomp aan. Laat het minstens 30 seconden lopen en schakel het vervolgens uit.Sluit de gasbuis van de zuurstoftank aan op de luchtstroomklep. Laat de plasmakamer zich gedurende 30 seconden vullen met zuurstof, schakel vervolgens de zuurstof uit en sluit de luchtstroomklep. Zet de vacuümpomp aan en stel het radiofrequentieniveau in op hoog.Wacht tot de kamer een violetroze kleur krijgt en laat 30 seconden verstrijken. Wanneer de timer afgaat, schakelt u het plasma uit en vacuümt u vervolgens langzaam de luchtstroomklep om het vacuüm vrij te maken. Verwijder de lade uit de plasmareiniger.Draai het PDMS-apparaat voorzichtig op de glazen schuif om ze te verbinden. Let bij het verlijmen van het kleine verschil in de transparantie van het PDMS. Voor het beste resultaat bewaar je de verlijmde apparaten bij 60 graden Celsius tot vlak voor gebruik.Bereid de oppervlaktebehandeling voor door PFOCTS- en Novec-olie te verdunnen en gebruik één milliliter voor drie tot vier apparaten. Breng het volume over op een spuit van één milliliter en bevestig een naald van 25 gauge. Snijd een stuk Tygon-buis van 10 tot 12 centimeter per apparaat.Snijd een stuk PEEK-buis van ongeveer een centimeter lang. Steek een paar millimeter van de PEEK-buis in het uiteinde van de Tygon-buis om te voorkomen dat de naald de Tygon-buisinlaten doorboort. Haal de apparaten uit de verwarmde kamer en steek het niet-PEEK-uiteinde van de Tygon-buis in het waterige inlaatgat.Steek de naald van de oppervlaktebehandelingsspuit in de PEEK-slang en bedek het uitlaatgat van de oliekamer. Injecteer de behandeling langzaam en zorg ervoor dat het apparaat zonder bubbels wordt gevuld. Wacht tot eerst de waterige kamers zijn gevuld, gevolgd door de kleinere kanalen en vervolgens de oliekamer.Verwijder de Tygon-buis van het apparaat. Zodra het apparaat is gevuld, laat u het 10 minuten rusten op kamertemperatuur. Vul een spuit van vijf milliliter alleen met olie en bevestig een naald van 25 gauge.Haal de oppervlaktebehandeling uit het apparaat via de in- en uitlaat. Steek de Tygon-buis in de waterige inlaat. Steek de spuit met olie in de PEEK-slang en spoel elk apparaat met olie.Haal de olie uit het apparaat. Herhaal de oliespoeling tweemaal en verwijder de Tygon-slang. Steek het niet-PEEK-uiteinde van de Tygon-buis in de inlaten van de microfluïdische apparaten.Steek het resterende stuk Tygon-buis zonder PEEK-buis aan het uiteinde in de uitgang van het microfluïdische apparaat. Voeg ten minste drie milliliter olie toe aan een plastic spuit van vijf milliliter en bevestig deze aan een naald van 25 gauge. Steek de naald voorzichtig in de PEEK-buis op een van de Tygon-inlaten.Spoel de slang en het apparaat voorzichtig door met olie. Verzamel de olie uit de uitlaat in een conische buis. Herhaal de oliespoeling op de andere Tygon-inlaat.Stel de spuitpompen in op de gewenste stroomsnelheden. Sluit de spuit met de oppervlakteactieve stof aan op de olie-inlaat via een naald van 25 gauge en doseer voorzichtig voldoende olie om de slang en het oliekanaal van het microfluïdische apparaat te primen. Zodra het apparaat en de olie-inlaten zijn ingesteld, voegt u 0,5 milliliter olie toe aan een nieuwe spuit van vijf milliliter die de gelvoorloper zal bevatten.Gebruik deze kleine hoeveelheid olie om de voorloperoplossing door het microfluïdische apparaat te spoelen. Combineer in een conische buis 1,5 milliliter van de PEG-backbone-oplossing en 1,5 milliliter van de cross-linkeroplossing. Vortex gedurende 30 seconden en breng de gecombineerde gelprecursoroplossing snel over naar de spuit van vijf milliliter.Verbind de spuit met de gelprecursoroplossing met de waterige inlaat via een naald van 25 gauge. Doseer voorzichtig voldoende oplossing om de slang en het waterige kanaal te primen. Klem de spuiten op de spuitpompen en druk op run.Zoek naar deeltjes van uniforme grootte uit de kanalen. Verzamel de microgels uit de uitlaat in een conische buis. Zodra de gelation is voltooid, gebruikt u een pipet om de oliefase voorzichtig van de onderkant van de buis te verwijderen.Deponeer dit in een geschikte afvalcontainer voor gefluoreerd afval. Voeg meer olie toe aan de microgel opvangbuis. Meng door de opvangbuis voorzichtig om te keren.Laat de opvangbuis vijf minuten bezinken om de fasen te laten scheiden. Zoek naar de oliefase aan de onderkant en de waterige microgelfase aan de bovenkant. Herhaal de oliewasbeurten nog minstens twee keer.Voeg meer olie toe met de gel zoals eerder gedemonstreerd en voeg vervolgens PBS toe aan de gel. Keer om om meerdere keren te mixen. Om de lagen te scheiden, centrifugeert u de buis op 2.000 RCF gedurende ongeveer 30 seconden.Zoek naar de oliefase aan de onderkant van de tube, gel in het midden en PBS aan de bovenkant. Verwijder de oliefase met een pipet en gooi deze weg in een afvalcontainer. Herhaal olie en PBS wasbeurten twee keer.Zoek naar de gel om over te gaan van ondoorzichtig naar helder door de laatste wasbeurt. Verwijder alle olie. Verwijder PBS niet uit de conische buis.Gebruik in een chemische zuurkast een glazen pipet om hexanen aan de buis toe te voegen op een gelijk volume als de PBS. Vortex de conische buis gedurende 30 seconden of totdat deze grondig wordt gemengd. Centrifugeer bij 4, 696 RCF gedurende vijf minuten.Zoek na scheiding naar hexanen in de bovenste laag, PBS in het midden en gel aan de onderkant. Verwijder de hexaanlaag en gooi deze weg in een container voor organisch afval. Aspirateer de PBS.Herhaal hexaan in PBS wast minstens twee keer of totdat de gel bijna doorschijnend lijkt. Was de gel nogmaals met PBS om eventuele resterende hexaanresten te verwijderen. Centrifugeer op 4, 696 RCF gedurende vijf minuten en zuig de PBS-laag aan.Ongeveer 67-75% van de 20 kilodalton PEG-maleimide werd gemodificeerd met methacrylamide functionele groepen om een hoge gloeiefficiëntie te garanderen. Procentuele modificatie werd bepaald door 1H NMR spectra pieken te analyseren. Het begin van de gelatatie gaf inzicht in de duur van de microfluïdische microgelgeneratie.Het wordt aanbevolen om gelvoorloper pH te kiezen die gelation tussen 30 minuten en twee uur kan initiëren. Na zuivering en zwelling hadden de microgels een uniforme grootte en polydispersiteitsindex tussen 1,00 en 1,02, gedefinieerd als een monodispersed populatie. Na het gloeien vormden de microgels een poreuze steiger gevisualiseerd met twee-fotonenmicroscopie.Het correct verlijmen van het PDMS-apparaat aan de glazen schuif en het correct behandelen van het apparaat is cruciaal voor de beste microfluïdische apparaatprestaties. Deze techniek maakt een snelle productie van uniforme microgel-bouwstenen mogelijk om kaartsteigers te vormen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan in vivo regeneratieve toepassingen, waaronder wondgenezing.

microfluidic-synthesis-microgel-building-blocks-for-microporous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren een protocol om Janus microhydrogels te synthetiseren die volledig zijn samengesteld uit hetzelfde basismateriaal, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), met een duidelijk gecompartimenteerde structuur op basis van de fasescheiding van een oververzadigde NIPAAm monomeeroplossing. De gesynthetiseerde Janus microhydrogels vertonen unieke eigenschappen zoals anisotrope thermoresponsiviteit en organofiel/hydrofiel laadvermogen.

Synthese van poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels voor Anisotropisch Thermo-responsiviteit en Organofiele / Hydrofiel Loading Capability

We stellen een eenvoudige zelfassemblerende techniek voor van silica colloïdale nanodeeltjes om een nanofluïdische kruising te creëren tussen twee microkanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS). Met behulp van deze techniek werd een nanoporeuze parelmembraan met een poriegrootte tot ~45 nm gebouwd binnen een microkanaal en toegepast op elektrokinetische preconcentratie van DNA-monsters.

Het creëren van Sub-50 Nm nanofluidic Knooppunten in PDMS microfluïdische chip via Self-assemblageproces van colloïdale deeltjes

Hier beschrijven we de fabricage en werking van een dubbellaags microfluïdisch systeem gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS). We tonen het potentieel van dit apparaat aan voor het vangen, richten van de coördinatieroute van een kristallijn moleculair materiaal en het controleren van chemische reacties op in chip gevangen structuren.

Microfluïdische Pneumatische Cages: een nieuwe benadering voor de In-chip Crystal Trapping, manipulatie en gecontroleerde chemische behandeling

Protocollen zijn beschreven voor de fabrikatie van afbreekbaar thermoresponsive hydrogels op basis van het hydrazon cross-linking van polymere oligomeren op de schaal van de bulk, microscale, en nanoscale, de laatste voorbereiding van zowel de nanofibers als de gel nanodeeltjes.

Fabriceren van afbreekbaar Thermoresponsive Hydrogels op meerdere lengte schalen via reactieve extrusie, Microfluidics, zelf-assemblage en Electrospinning

Een additief productie-strategie voor de verwerking van UV-crosslinkable hydrogels heeft ontwikkeld. Deze strategie voorziet in de vergadering van de laag-voor-laag van de microfabricated hydrogel structuren, alsook de vergadering van onafhankelijke onderdelen, levert geïntegreerde apparaten met bewegende onderdelen die inspelen op de magnetische aandrijving.

Additief fabricage techniek voor de Facile en snelle fabricage van Hydrogel gebaseerde Micromachines met magnetisch responsieve onderdelen

Water-in-olie druppels testen zijn nuttig voor analytische chemie, enzymevolutie en eencellige analyse, maar vereisen meestal microfluïdica om de druppels te vormen. Hier beschrijven we deeltjessjabloonemulgering, een microfluïdische benadering om druppeltests uit te voeren.

Deeltjessjabloonemulgering maakt microfluïdische druppeltests mogelijk

Dit werk beschrijft eenvoudige, aanpasbare en goedkope methoden om microgels met extrusiefragmentatie te fabriceren, de microgels te verwerken tot injecteerbare granulaire hydrogels en de granulaire hydrogels toe te passen als extrusiedrukinkten voor biomedische toepassingen.

Fragmenteren van bulkhydrogels en verwerking tot granulaire hydrogels voor biomedische toepassingen

Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.

Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Het minimaliseren van de variabiliteit in de deeltjesfractie binnen korrelige steigers vergemakkelijkt reproduceerbare experimenten. Dit werk beschrijft methoden voor het genereren van granulaire steigers met gecontroleerde deeltjesfracties voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen.

Deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3D-celcultuur

Het huidige protocol beschrijft een microfluïdisch platform om de ontwikkeling van biofilms in quasi-2D poreuze media te bestuderen door microscopiebeeldvorming met hoge resolutie te combineren met gelijktijdige drukverschilmetingen. Het platform kwantificeert de invloed van poriegrootte en vloeistofstroomsnelheden in poreuze media op bioclogging.

Een microfluïdisch platform om bioclogging in poreuze media te bestuderen

Dit artikel beschrijft protocollen voor high-throughput gelatine methacryloyl microgel fabricage met behulp van microfluïdische apparaten, het omzetten van microgels in resususpensable poeder (micro-aerogels), de chemische assemblage van microgels om granulaire hydrogel scaffolds te vormen, en het ontwikkelen van granulaire hydrogel bioinks met behoud van microporositeit voor 3D bioprinting.

Gelatine Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, en 3D Bioprinting

Leer microfluïdische synthese van monodisperse microgel-bouwstenen voor microporeuze steigers. Deze methode biedt verbeterde controle over porositeit en weefselintegratie voor regeneratieve geneeskunde.

Microfluïdische synthese van microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteiger

Meer video's verkennen