Microfluïdische synthese van microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteiger

De high throughput fabricage van monodispersed microgel bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteigers zorgt voor een verbeterde controle van de porositeit van steigers. Dit kan van invloed zijn op de poriegrootte en de daaropvolgende resultaten van weefselintegratie. Dit protocol maakt gebruik van een microfluïdische benadering met hoge doorvoer om grote hoeveelheden monodispersed microgels te genereren die niet kunnen worden bereikt met andere methoden zoals flowfocusmicrofluïdica, batch-emulsie en elektrospraying.

De gegenereerde microgels kunnen worden gevormd tot microporeuze gegloeide deeltjessteigers die voordelig zijn voor regeneratieve geneeskundetoepassingen vanwege de porositeit van de celschaal die snel weefsel en groei mogelijk maakt. Begin met het voorbereiden van één glazen dia per PDMS-microfluïdisch apparaat. Gebruik tape, gefilterde lucht of isopropylalcoholwassingen om stof van de dia te verwijderen.

Plaats een glazen schuif in een PDMS-apparaatontwerpschuif naast elkaar op een 96-wells plaatdeksel en plaats deze in een plasmareiniger. Sluit de deur en de luchtstroomklep en zet de vacuümpomp aan. Laat het minstens 30 seconden lopen en schakel het vervolgens uit.

Sluit de gasbuis van de zuurstoftank aan op de luchtstroomklep. Laat de plasmakamer zich gedurende 30 seconden vullen met zuurstof, schakel vervolgens de zuurstof uit en sluit de luchtstroomklep. Zet de vacuümpomp aan en stel het radiofrequentieniveau in op hoog.

Wacht tot de kamer een violetroze kleur krijgt en laat 30 seconden verstrijken. Wanneer de timer afgaat, schakelt u het plasma uit en vacuümt u vervolgens langzaam de luchtstroomklep om het vacuüm vrij te maken. Verwijder de lade uit de plasmareiniger.

Draai het PDMS-apparaat voorzichtig op de glazen schuif om ze te verbinden. Let bij het verlijmen van het kleine verschil in de transparantie van het PDMS. Voor het beste resultaat bewaar je de verlijmde apparaten bij 60 graden Celsius tot vlak voor gebruik.

Bereid de oppervlaktebehandeling voor door PFOCTS- en Novec-olie te verdunnen en gebruik één milliliter voor drie tot vier apparaten. Breng het volume over op een spuit van één milliliter en bevestig een naald van 25 gauge. Snijd een stuk Tygon-buis van 10 tot 12 centimeter per apparaat.

Snijd een stuk PEEK-buis van ongeveer een centimeter lang. Steek een paar millimeter van de PEEK-buis in het uiteinde van de Tygon-buis om te voorkomen dat de naald de Tygon-buisinlaten doorboort. Haal de apparaten uit de verwarmde kamer en steek het niet-PEEK-uiteinde van de Tygon-buis in het waterige inlaatgat.

Steek de naald van de oppervlaktebehandelingsspuit in de PEEK-slang en bedek het uitlaatgat van de oliekamer. Injecteer de behandeling langzaam en zorg ervoor dat het apparaat zonder bubbels wordt gevuld. Wacht tot eerst de waterige kamers zijn gevuld, gevolgd door de kleinere kanalen en vervolgens de oliekamer.

Verwijder de Tygon-buis van het apparaat. Zodra het apparaat is gevuld, laat u het 10 minuten rusten op kamertemperatuur. Vul een spuit van vijf milliliter alleen met olie en bevestig een naald van 25 gauge.

Haal de oppervlaktebehandeling uit het apparaat via de in- en uitlaat. Steek de Tygon-buis in de waterige inlaat. Steek de spuit met olie in de PEEK-slang en spoel elk apparaat met olie.

Haal de olie uit het apparaat. Herhaal de oliespoeling tweemaal en verwijder de Tygon-slang. Steek het niet-PEEK-uiteinde van de Tygon-buis in de inlaten van de microfluïdische apparaten.

Steek het resterende stuk Tygon-buis zonder PEEK-buis aan het uiteinde in de uitgang van het microfluïdische apparaat. Voeg ten minste drie milliliter olie toe aan een plastic spuit van vijf milliliter en bevestig deze aan een naald van 25 gauge. Steek de naald voorzichtig in de PEEK-buis op een van de Tygon-inlaten.

Spoel de slang en het apparaat voorzichtig door met olie. Verzamel de olie uit de uitlaat in een conische buis. Herhaal de oliespoeling op de andere Tygon-inlaat.

Stel de spuitpompen in op de gewenste stroomsnelheden. Sluit de spuit met de oppervlakteactieve stof aan op de olie-inlaat via een naald van 25 gauge en doseer voorzichtig voldoende olie om de slang en het oliekanaal van het microfluïdische apparaat te primen. Zodra het apparaat en de olie-inlaten zijn ingesteld, voegt u 0,5 milliliter olie toe aan een nieuwe spuit van vijf milliliter die de gelvoorloper zal bevatten.

Gebruik deze kleine hoeveelheid olie om de voorloperoplossing door het microfluïdische apparaat te spoelen. Combineer in een conische buis 1,5 milliliter van de PEG-backbone-oplossing en 1,5 milliliter van de cross-linkeroplossing. Vortex gedurende 30 seconden en breng de gecombineerde gelprecursoroplossing snel over naar de spuit van vijf milliliter.

Verbind de spuit met de gelprecursoroplossing met de waterige inlaat via een naald van 25 gauge. Doseer voorzichtig voldoende oplossing om de slang en het waterige kanaal te primen. Klem de spuiten op de spuitpompen en druk op run.

Zoek naar deeltjes van uniforme grootte uit de kanalen. Verzamel de microgels uit de uitlaat in een conische buis. Zodra de gelation is voltooid, gebruikt u een pipet om de oliefase voorzichtig van de onderkant van de buis te verwijderen.

Deponeer dit in een geschikte afvalcontainer voor gefluoreerd afval. Voeg meer olie toe aan de microgel opvangbuis. Meng door de opvangbuis voorzichtig om te keren.

Laat de opvangbuis vijf minuten bezinken om de fasen te laten scheiden. Zoek naar de oliefase aan de onderkant en de waterige microgelfase aan de bovenkant. Herhaal de oliewasbeurten nog minstens twee keer.

Voeg meer olie toe met de gel zoals eerder gedemonstreerd en voeg vervolgens PBS toe aan de gel. Keer om om meerdere keren te mixen. Om de lagen te scheiden, centrifugeert u de buis op 2.000 RCF gedurende ongeveer 30 seconden.

Zoek naar de oliefase aan de onderkant van de tube, gel in het midden en PBS aan de bovenkant. Verwijder de oliefase met een pipet en gooi deze weg in een afvalcontainer. Herhaal olie en PBS wasbeurten twee keer.

Zoek naar de gel om over te gaan van ondoorzichtig naar helder door de laatste wasbeurt. Verwijder alle olie. Verwijder PBS niet uit de conische buis.

Gebruik in een chemische zuurkast een glazen pipet om hexanen aan de buis toe te voegen op een gelijk volume als de PBS. Vortex de conische buis gedurende 30 seconden of totdat deze grondig wordt gemengd. Centrifugeer bij 4, 696 RCF gedurende vijf minuten.

Zoek na scheiding naar hexanen in de bovenste laag, PBS in het midden en gel aan de onderkant. Verwijder de hexaanlaag en gooi deze weg in een container voor organisch afval. Aspirateer de PBS.

Herhaal hexaan in PBS wast minstens twee keer of totdat de gel bijna doorschijnend lijkt. Was de gel nogmaals met PBS om eventuele resterende hexaanresten te verwijderen. Centrifugeer op 4, 696 RCF gedurende vijf minuten en zuig de PBS-laag aan.

Ongeveer 67-75% van de 20 kilodalton PEG-maleimide werd gemodificeerd met methacrylamide functionele groepen om een hoge gloeiefficiëntie te garanderen. Procentuele modificatie werd bepaald door 1H NMR spectra pieken te analyseren. Het begin van de gelatatie gaf inzicht in de duur van de microfluïdische microgelgeneratie.

Het wordt aanbevolen om gelvoorloper pH te kiezen die gelation tussen 30 minuten en twee uur kan initiëren. Na zuivering en zwelling hadden de microgels een uniforme grootte en polydispersiteitsindex tussen 1,00 en 1,02, gedefinieerd als een monodispersed populatie. Na het gloeien vormden de microgels een poreuze steiger gevisualiseerd met twee-fotonenmicroscopie.

Het correct verlijmen van het PDMS-apparaat aan de glazen schuif en het correct behandelen van het apparaat is cruciaal voor de beste microfluïdische apparaatprestaties. Deze techniek maakt een snelle productie van uniforme microgel-bouwstenen mogelijk om kaartsteigers te vormen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan in vivo regeneratieve toepassingen, waaronder wondgenezing.