Name: Bereiding van cytoplasmatische en nucleaire lange RNAs uit primaire en gekweekte cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Leer een efficiënte methode voor RNA-isolatie uit nucleaire en cytoplasmatische fracties in gekweekte cellen, gevalideerd met qPCR. Dit protocol biedt een kosteneffectief alternatief voor bestaande kits.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door subsidies van de American Society of Hematology, de Robert Wood Johnson Foundation, de Doris Duke Charitable Foundation, de Edward P. Evans Foundation en het National Cancer Institute (1K08CA230319).

K562-cellen worden gebruikt voor deze studie. Dit protocol is geoptimaliseerd om te werken voor 1 x 106-5 x 106 miljoen cellen. De procedure kan echter worden opgeschaald voor grotere celhoeveelheden door de volumes op de juiste manier te verhogen.
1. Voorbereiding van de 0,25x lysisbuffer
<ol><li>Bereid 0,25x lysisbuffer voor door de volgende componenten in tabel 1A te mengen. OPMERKING: Monsters vereisen ongeveer 300 μL van 0,25x lysisbuffer. Aanbevolen volume = aantal monsters x 300 μL.</li>
</ol>2. Scheiding van nucleaire en cytoplasmatische fracties
<ol><li>Pellet de cellen met behulp van buizen van 1,5 ml via centrifugeren gedurende 5 minuten bij 2000 x g (kamertemperatuur). Gooi het supernatant weg met een aanzuigpipet. OPMERKING: K562-cellen werden gebruikt tijdens dit protocol. Het protocol kan echter worden aangepast aan verschillende cellijnen.</li>
	<li>Resuspendeerde de pellet in 300 μL ijskoude 0,25x lysisbuffer. OPMERKING: Houd 2 minuten op ijs en draai de buis om de 45 s om een goede lysis van de cellen te garanderen.</li>
	<li>Draai de buizen op de hoogste snelheid (12.000 x g) op 4 °C gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het supernatant en plaats het in een nieuwe buis van 1,5 ml. Dit zal de cytoplasmatische fractie zijn. Ongeveer 300 μL van de cytoplasmatische fractie zal worden bereikt.</li>
	<li>De resterende pellet zal de kernfractie zijn. Voeg 500 μL ijskoude PBS toe aan de pellet en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 2.000 x g . OPMERKING: Tijdens deze stap wordt overtollig DNA verwijderd.</li>
</ol>3. RNA-opruiming met behulp van een RNA-zuiveringskit
OPMERKING: Dit protocol werd bereikt met behulp van een in de handel verkrijgbare RNA-zuiveringskit (zie materiaaltabel).
<ol><li>Scheid de cytoplasmatische RNA-monsters en de nucleaire cytoplasmatische monsters (omdat de fractioneringsstappen tussen hen variëren).<ol><li>Om de cytoplasmatische fractie te scheiden, voegt u 1.050 μL 3,5x RLT-lysisbuffer (zie materiaaltabel) en vortex kort toe. Voeg vervolgens 750 μL 90% ethanol toe en laad het op de kolom van de RNA-opruimkit. OPMERKING: De oplossing moet goed worden gemengd voordat deze op de kolom wordt geladen.</li>
		<li>Om de kernfractie te scheiden, voegt u 600 μL 3,5x lysisbuffer en vortex toe. Voeg vervolgens 600 μL 70% ethanol toe.</li>
	</ol></li>
	<li>Laad zowel cytoplasmatische als nucleaire fracties op RNA-kolommen (zie tabel met materialen). OPMERKING: Voor de rest van stap 3 volgen zowel de cytoplasmatische als de nucleaire monsters dezelfde procedure. Zorg er echter voor dat deze monsters onafhankelijk van elkaar blijven.<ol><li>Laad zowel cytoplasmatische als nucleaire fracties op RNA-kolommen en draai gedurende 30 s bij 8.000 x g bij kamertemperatuur. Gooi de overtollige stroom door.</li>
		<li>Voeg 350 μL wasbuffer toe uit een in de handel verkrijgbare zuiveringskit (RW1-buffer, zie materiaaltabel), draai opnieuw en gooi de stroom door.</li>
		<li>Voeg DNAse-oplossing (1U/uL) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur toe. Voeg vervolgens 350 μL wasbuffer toe, draai opnieuw en gooi de stroom erdoorheen.</li>
		<li>Voeg 500 μL milde wasbuffer (RPE, zie Tabel met materialen) toe, draai opnieuw en gooi de stroom door. Voeg 500 μL milde wasbuffer toe, draai opnieuw, maar slechts gedurende 2 minuten.</li>
		<li>Verplaats de kolom naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg 30 μL water toe aan de spinkolom. Laat de kolom 1 minuut zitten voordat je gaat draaien.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Validatie van nucleair-cytoplasmatische scheiding
<ol><li>Voer cDNA-synthese uit<ol><li>Zodra subcellulaire compartimenten van RNA zijn geëxtraheerd en gezuiverd, bevestigt u de scheiding van de compartimenten met behulp van qPCR. Om dit te doen, zet u eerst het RNA om in cDNA met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Bereid reverse transcriptase mastermix voor. Voeg sjabloon-RNA toe. Incubeer reacties in een thermocycler. OPMERKING: Voor willekeurige hexameerapparaten zijn de gebruikte fietsparameters weergegeven in tabel 2A. Gebruik de reverse transcriptasereactie onmiddellijk of bewaar bij -20 °C (tabel 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en analyse uit.<ol><li>Verdun de cDNA-synthese met DEPC-water (zie materiaaltabel) tot een eindconcentratie van 20 ng/ml.</li>
		<li>Bereid met behulp van een PCR-hoofdmix de reactie voor elk monster voor met behulp van handmatige instructies zoals hieronder vermeld.</li>
		<li>Verkrijg commerciële sondes die nodig zijn om cytoplasmatische en nucleaire fractionering te detecteren. Gebruik MALAT1 als nucleaire marker en TUG1 als cytoplasmatische marker (zie Tabel met materialen). OPMERKING: Sequenties voor MALAT1 en TUG1 zijn opgenomen in tabel 3.</li>
		<li>Bereken het volume van elke component door elke component te vermenigvuldigen met 3 voor elk van de technische replicaties voor het individuele monster.</li>
		<li>Verkrijg voor elk nucleair en cytoplasmatisch monster de volgende mengsels voor elk: (a) Nucleaire fractie met MALAT1, (b) Cytoplasmatische fractie met MALAT1, (c) Nucleaire fractie met TUG1 en (d) Cytoplasmatische fractie met TUG1 (tabel 1C).</li>
		<li>Vortex kort om oplossingen te mengen en 20 μL van het mengsel over te brengen naar elke put van een optische reactieplaat (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Bedek de plaat met een heldere kleeffilm die wordt gebruikt voor qPCR (zie materiaaltabel) en centrifugeer de plaat kort om luchtbellen te verwijderen en draai het monster vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g naar beneden.</li>
		<li>Selecteer met behulp van ontwerp- en analysesoftware (zie materiaaltabel) de standaardcurve voor de cyclusparameters (tabel 2B).</li>
		<li>Gebruik qPCR-software en selecteer Run instellen (aanvullende afbeelding 1).</li>
		<li>Selecteer op de pagina Eigenschappen van gegevensbestand de optie Parameters voor methode en invoercyclus in tabel 2B (aanvullende afbeelding 2).</li>
		<li>Nadat u cyclusparameters hebt ingevoerd, selecteert u het tabblad Plaat en voert u de uit te voeren monsters in (aanvullende afbeelding 3). Selecteer Uitvoering starten. OPMERKING: De beschreven stappen zijn uitgevoerd in een qPCR-machine met behulp van een in de handel verkrijgbare mastermix (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Voer data-analyse uit<ol><li>Nadat de uitvoering is voltooid, maakt u een gegevensspreadsheet met de voorbeeldnaam, doelnaam en kwantificeringscyclus (Cq) (aanvullende tabel 1).</li>
		<li>Begin met de MALAT1-monsters om de kernfractie te berekenen. Trek de MALAT1 cytoplasmatische fractie af van de MALAT1 kernfractie (tabel 4).</li>
		<li>Bereken vervolgens de ΔCq (2^(-waarde)) (tabel 5).</li>
		<li>Ga verder met de MALAT1-monsters om de cytoplasmatische fractie te berekenen, trek de MALAT1-kernfractie af van de MALAT1-cytoplasmatische fractie en bereken vervolgens de ΔCq (2 ^ (-waarde)) (tabel 6). OPMERKING: Kijkend naar de ΔCq, wordt waargenomen dat de nucleaire MALAT1-fractie (groene highlight) een grotere MALAT1-marker heeft dan het cytoplasma (rode highlight), maar nu is bevestiging vereist om ervoor te zorgen dat de cytoplasmatische fractie overwegend cytoplasma is en dat de nucleaire fractie geen cytoplasmatische contaminatie bevat.</li>
		<li>Voer met TUG1-monsters dezelfde berekening uit als hierboven (stappen 4.3.2-4.3.4) (tabel 7). OPMERKING: Kijkend naar de ΔCq, wordt waargenomen dat de cytoplasmatische TUG1-fractie (groene highlight) een grotere TUG1-marker heeft dan de nucleaire fractie (rode highlight), wat een goede scheiding van cytoplasmatische en nucleaire fracties bevestigt (tabel 8, figuur 1).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li>
<li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+localization+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li>
<li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+separate+nuclear%2C+cytosolic%2C+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li>
<li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+localization%3A+message+on+the+move%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li>
<li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+positioning+system%3A+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li>
<li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((150+years+of+the+mass+action+law%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012(2015).</li>
<li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35(2016).</li>
<li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li>
<li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+biogenesis%2C+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhuysen%2C+J-M+%22Bacterial+Cell+Wall%22">Bacterial Cell Wall</a>. , Elsevier. (1994).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Enzyme+Structure+and+Mechanism%22">Enzyme Structure and Mechanism</a>. , (1985).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+win+the+battle+with+RNase%22">How to win the battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li>
<li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selinexor%2C+a+first-in-class+XPO1+inhibitor%2C+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, Supplement 1 233(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Gedurende het protocol werden enkele stappen ondernomen om de elementen te optimaliseren om het meest effectief te zijn voor de cellijn van belang. Hoewel de stappen binnen het protocol relatief eenvoudig zijn, kunnen analyse en kleine aanpassingen tijdens kritieke aspecten van het protocol nodig zijn. De meest kritische stap in het protocol is het wijzigen van de concentratie van de lysisbuffer tot een juiste concentratie op basis van de cellijn van belang en het cellulaire doelwit. Aangezien het gebruik van lysisbuffer...

Cellulaire fractionering in subcellulaire componenten maakt de isolatie en studie van gedefinieerde biochemische domeinen mogelijk en helpt bij het bepalen van de lokalisatie van specifieke cellulaire processen en hoe dit hun functie kan beïnvloeden1. Isolatie van RNA van verschillende intracellulaire locaties kan zorgen voor een verbeterde nauwkeurigheid van genetische en biochemische analyse van transcriptieniveaugebeurtenissen en andere interacties tussen de kern en het cytoplasma, wat dient als het primaire doel van het huidige protocol2. Dit protocol is ontwikkeld om de isolatie van cytoplasmatische en nucleaire RNA's te garanderen om hun respectieve rollen in nucleaire export te bepalen en om te begrijpen hoe de subcellulaire lokalisatie van RNA's in de kern en het cytoplasma hun functie in cellulaire processen kan beïnvloeden. Met behulp van materialen uit een typische laboratoriumomgeving was het mogelijk om nucleaire en cytoplasmatische fractionering effectiever en goedkoper te bereiken dan eerder vastgestelde protocollen zonder de kwaliteit van de resultaten in gevaar te brengen3.
Bovendien kan de uitwisseling van moleculen tussen het cytoplasma en de kern direct worden bestudeerd door deze regio's te scheiden. Meer specifiek is het begrijpen van het transcriptoom essentieel voor het begrijpen van ontwikkeling en ziekte. RNA's kunnen zich echter op elk moment op verschillende rijpingsniveaus bevinden en kunnen de downstream-analyse bemoeilijken. Dit protocol maakt het mogelijk om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische subcellulaire fracties, wat kan helpen bij studies van RNA en een beter begrip van een bepaald RNA van belang mogelijk maakt, zoals de lokalisatie van niet-coderende RNA's of analyse van splice junctions binnen de kern.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA's, waaronder mRNA's, rRNA's en lange niet-coderende RNA's (lncRNA's), vanwege de grootteselectiviteit van de gebruikte RNA-zuiveringskolom, die kan worden gewijzigd om andere RNA's van belang te isoleren. Voorheen was de functie van lange RNA's, zoals mRNA's en lncRNA's, sterk afhankelijk van hun respectieve lokalisatie binnen de cel 4,5. Daarom is de studie van de export van de kern naar subcellulaire domeinen meer gericht op het begrijpen van de rol die het exporteren van RNA of andere cellulaire componenten op de cel kan hebben. lncRNA's dienen als een goed voorbeeld hiervan, omdat hun vertaling en daaropvolgende effecten grotendeels afhankelijk zijn van nabijheid en interacties met andere vormen van RNA6. Bovendien is de uitwisseling van cellulaire elementen tussen nucleaire en cytoplasmatische regio's gekoppeld aan resistentiemechanismen tegen verschillende kankerbehandelingen7. De isolatie van intracellulaire compartimenten heeft de ontwikkeling van nucleaire exportremmers mogelijk gemaakt, wat de effecten van resistentiemechanismen tegen verschillende therapieën heeft verminderd8.
Na het scheiden van nucleair en cytoplasmatisch RNA worden stappen uitgevoerd om het RNA van belang te zuiveren. Omdat RNA-zuiveringskits vaak worden aangetroffen in laboratoria en functioneren om lange RNA's te zuiveren en te isoleren, dienen ze het doel van dit protocol goed. Voor RNA-zuivering is het genereren van 260:280-verhoudingen groter dan 1,8 van cruciaal belang om de kwaliteit van monsters voor RNA-sequencing of andere soortgelijke procedures te waarborgen die een hoge mate van zuiverheid en isolatie vereisen. Onregelmatige 260:280-waarden wijzen op fenolbesmetting, die een slechte isolatie aantonen en onnauwkeurige resultaten opleveren9.
Zodra de RNA-zuivering is voltooid en 260:280-waarden boven een acceptabel bereik liggen, werd qPCR gebruikt om de isolatieresultaten van nucleaire en cytoplasmatische fracties te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het interessegebied om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In dit protocol werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als nucleaire en cytoplasmatische markers, respectievelijk10. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering met MALAT1 aan te tonen, terwijl cytoplasmatische fractionering naar verwachting laag zal zijn. Omgekeerd, wanneer TUG1 wordt gebruikt, wordt verwacht dat cytoplasmatische fractioneringsniveaus hoger zijn dan nucleaire fractioneringsniveaus.
Met behulp van dit protocol was het mogelijk om RNA's te isoleren op basis van hun positie van actie in de cel. Vanwege de wijdverspreide toegang tot veel materialen en het gebruik van alleen lysisbuffer- en op dichtheid gebaseerde centrifugatietechnieken tijdens dit experiment, is de toepasbaarheid op andere RNA-typen en andere cellulaire componenten wijdverspreid. Dit kan belangrijke informatie opleveren door licht te werpen op locatiespecifieke expressiegebeurtenissen die anders zonder scheiding niet van elkaar te onderscheiden zouden zijn.

<table><tbody><tr><td>Agilent Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td>Het Agilent TapeStation-systeem is een geautomatiseerde elektroforese-oplossing voor de monsterkwaliteitscontrole van DNA- en RNA-monsters.&nbsp;</td></tr><tr><td>0.5% Nonidet P-40</td><td>Thermo-Fischer</td><td>28324</td><td>Gebruikt bij het maken van lysisbuffer</td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 8.0</td><td>Thermo-Fischer</td><td>15568025</td><td>Gebruikt bij het maken van lysisbuffer</td></tr><tr><td>MALAT1 GE Assay</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00273907_s1</td><td>Gebruikt voor bevestiging van Nucleaire fractie.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4326659</td><td>De Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate met barcode is geoptimaliseerd om ongeëvenaarde temperatuurnauwkeurigheid en uniformiteit te bieden voor snelle, efficiënte PCR-amplificatie. Deze plaat, geconstrueerd uit een enkel stuk van rigide polypropyleen in een 96-well formaat, is compatibel met Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR-systemen en thermische cyclers.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4311971</td><td>De Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film vermindert de kans op vervuiling tussen de wells en verdamping van monsters wanneer het wordt toegepast op een microplaat tijdens qPCR</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-023</td><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) is een gebalanceerde zout oplossing die wordt gebruikt voor verschillende celkweek toepassingen, zoals het wassen van cellen voorafgaand aan dissociatie, het transporteren van cellen of weefselmonsters, het verdunnen van cellen voor het tellen en het bereiden van reagentia.</td></tr><tr><td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNA cleanup kits maken efficiënte RNA cleanup van enzymatische reacties en opruiming van RNA mogelijk dat gezuiverd is door verschillende methoden. Bevat RW1, RLT, RW1 buffers vermeld in het protocol.</td></tr><tr><td>QuantStudio 6</td><td>Thermo-Fischer</td><td>A43180</td><td>qPCR software gebruikt tijdens het protocol. Bevat Design en Analysis Software voor het analyseren van fractionering monsters</td></tr><tr><td>RLT Buffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Lysis buffer van RNA clean-up kit</td></tr><tr><td>RPE Buffer</td><td>Qiagen</td><td>1018013</td><td>Wasbuffer van RNA clean-up kit</td></tr><tr><td>RW1 Buffer</td><td>Qiagen</td><td>1053394</td><td>Wasbuffer van RNA clean-up kit</td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Assays</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4331182</td><td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays vertegenwoordigen de grootste verzameling vooraf ontworpen assays in de industrie met meer dan 2,8 miljoen assays voor 32 eukaryote soorten en talrijke microben. TaqMan Gene Expression assays stellen u in staat om snel resultaten te krijgen zonder tijd te verspillen aan het optimaliseren van SYBR Green primers en zonder extra tijd te besteden aan het uitvoeren en analyseren van smeltcurven.</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4305719</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix is de ideale reagensoplossing wanneer u een master mix nodig hebt voor meerdere 5' nuclease DNA-toepassingen. Applied Biosystems reagentia zijn gevalideerd met TaqMan assays en Applied Biosystems real-time systemen om gevoelige, nauwkeurige en betrouwbare prestaties te garanderen, elke keer.</td></tr><tr><td>TUG1 GE Assay</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00215501_m1</td><td>Gebruikt voor bevestiging van Cytoplasmatische fractie.</td></tr><tr><td>UltraPure DEPC-Treated Water</td><td>Thermo-Fischer</td><td>750024</td><td>UltraPure DEPC-behandeld water is geschikt voor gebruik met RNA. Het wordt bereid door incubatie met 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC), en wordt vervolgens geautoclaveerd om het DEPC te verwijderen. Sterile gefilterd.</td></tr></tbody></table>

bereiding van cytoplasmatische en nucleaire lange rna's uit primaire en gekweekte cellen

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

De scheiding van intracellulaire componenten is al vele jaren een belangrijk hulpmiddel in de cellulaire biologie en heeft nuttig inzicht kunnen geven in hoe hun locatie hun functie kan beïnvloeden. In het bijzonder is de scheiding van nucleair en cytoplasmatisch RNA belangrijk geworden in de context van kankercellen en de zoektocht naar nieuwe doelen voor geneesmiddelen. Het kopen van kits voor nucleair-cytoplasmatische RNA-extractie kan duur zijn wanneer veel van de vereiste materialen te vinden zijn in een typische laboratoriumomgeving. Met behulp van de huidige methode, die duurdere kits of andere tijdrovende processen kan vervangen, zijn alleen een zelfgemaakte lysisbuffer, een benchtopcentrifuge en RNA-isolatiezuiveringskolommen nodig om nucleair en cytoplasmatisch RNA te isoleren. Lysisbuffer wordt gebruikt om het buitenmembraan van de cel zachtjes te lyseren zonder de integriteit van de nucleaire envelop aan te tasten, waardoor de intracellulaire componenten kunnen worden vrijgegeven. Vervolgens kunnen de kernen worden geïsoleerd door een eenvoudige centrifugatiestap, omdat ze een hogere dichtheid hebben dan de lysisoplossing. Centrifugatie wordt gebruikt om deze gebieden te scheiden op basis van hun dichtheidsverschillen om subcellulaire elementen in de kern te isoleren van die in het cytoplasma. Zodra de centrifugatie de verschillende componenten heeft geïsoleerd, wordt een RNA-opruimkit gebruikt om het RNA-gehalte te zuiveren en wordt qPCR uitgevoerd om de scheidingskwaliteit te valideren, gekwantificeerd door de hoeveelheid nucleair en cytoplasmatisch RNA in de verschillende fracties. Statistisch significante niveaus van scheiding werden bereikt, wat de effectiviteit van het protocol illustreert. Bovendien kan dit systeem worden aangepast voor de isolatie van verschillende soorten RNA (totaal, klein RNA, enz.), Wat gerichte bestudering van cytoplasma-nucleusinteracties mogelijk maakt en helpt bij het begrijpen van de verschillen in de functie van RNA die zich in de kern en het cytoplasma bevinden.

Om er zeker van te zijn dat nucleaire en cytoplasmatische isolatie was bereikt, werd een qPCR uitgevoerd om de resultaten te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het gebied van belang om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In deze studie werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als respectievelijk nucleaire en cytoplasmatische primers. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering aan te tonen met MALAT1 als een positieve controle voor nucleai...

Het huidige protocol biedt een efficiënte en flexibele methode om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische fracties met behulp van gekweekte cellen en vervolgens te valideren met behulp van qPCR. Dit dient effectief als vervanging voor andere RNA-voorbereidingskits.

Bereiding van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA's uit primaire en gekweekte cellen

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Dit protocol is nodig om de verschillende rollen van gedefinieerde biochemische elementen in de kern en het cytoplasma te evalueren en om intracellulaire interacties tussen deze domeinen binnen verschillende cellijnen te analyseren. Deze techniek maakt gebruik van alledaagse laboratoriumapparatuur en reagentia om de cytoplasmatische en nucleaire fracties efficiënter te scheiden. Dit protocol kan dit goedkoper en sneller doen dan andere protocollen.Naarmate studies over cytoplasmatische en nucleaire interacties wijdverspreider worden, kan de impact van lokalisatie op intracellulaire gebeurtenissen beter worden begrepen. De uitwisseling tussen het cytoplasma en de kern kan worden geanalyseerd, wat aangeeft of bepaalde moleculen tijdens deze uitwisselingen kunnen leiden tot de ontwikkeling van kanker, zoals studies over nucleaire eiwitten hebben aangetoond. De meest kritische stap in het protocol is het aanpassen van de concentratie van de lysisbuffer naar een juiste concentratie.Omdat het gebruik van lysisbuffer grotendeels afhankelijk is van de verstoring van celmembranen en er natuurlijke varianten zijn in de effectiviteit van lysisbuffer op verschillende cellijnen. Om te beginnen, pellet de cellen, met behulp van 1,5 milliliter buizen via centrifugatie gedurende vijf minuten op 2000 G.Gooi het supernatant weg met behulp van een aanzuigende pipet. Resuspendeerde de pellet in 300 microliter ijskoude lysisbuffer.Draai vervolgens de buizen met een snelheid van ongeveer 12.000 G bij vier graden Celsius gedurende twee minuten. Verwijder het supernatant voorzichtig en plaats het in een nieuwe buis van 1,5 milliliter. De resterende pellet zal de kernfractie zijn.Voeg vervolgens 500 microliter ijskoude PBS toe aan de pellet en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 2000 G bij kamertemperatuur. Om de scheiding van de compartimenten met qPCR te bevestigen, zet u eerst het RNA om in complementair DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare kit. Bereid reverse transcriptase master mix voor.Voeg sjabloon-RNA toe. Incubeer reacties in een thermocycler. Ga verder voor het uitvoeren van kwantitatieve polymerasekettingreactie en -analyse.Begin met het verdunnen van de cDNA-synthese met DEPC-water om een uiteindelijke concentratie van 20 nanogram per milliliter te hebben. Bereid met behulp van een PCR-mastermix de reactie voor elk monster voor met behulp van handmatige instructies. Verkrijg commerciële sondes die nodig zijn om cytoplasmatische en nucleaire fractionering te detecteren.Gebruik MALAT1 als nucleaire marker en TUG1 als cytoplasmatische marker. Bereken het volume van elke component door elke component met drie te vermenigvuldigen voor elk van de technische replicaties voor het individuele monster. Verkrijg voor elk nucleair en cytoplasmatisch monster de mengsels kernfractie met MALAT1, cytoplasmatische fractie met MALAT1, kernfractie met TUG1 en cytoplasmatische fractie met TUG1.Vortex kort om oplossingen te mengen en 20 microliter van het mengsel over te brengen naar elke put van een optische reactieplaat. Bedek de plaat met een heldere kleeffilm die wordt gebruikt voor qPCR en centrifugeer de plaat kort om luchtbellen te verwijderen en draai het monster vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 300 keer G. Selecteer met behulp van ontwerp- en analysesoftware de standaardcurve voor de fietsparameters.Gebruik qPCR-software en selecteer setup run. Selecteer op de eigenschappenpagina van het gegevensbestand de optie methode- en invoercyclusparameters. Nadat u cyclusparameters hebt ingevoerd, selecteert u het plaattabblad en voert u de monsters in die moeten worden uitgevoerd.Selecteer start run. Nadat de uitvoering is voltooid, maakt u een gegevensspreadsheet met de voorbeeldnaam, doelnaam en kwantificeringscyclus. Begin met de MALAT1-monsters om de kernfractie te berekenen.Trek de MALAT1 cytoplasmatische fractie af van de MALAT1 kernfractie. Ga verder met de MALAT1-monsters om de cytoplasmatische fractie te berekenen. Trek MALAT1 kernfractie af van MALAT1 cytoplasmatische fractie en bereken vervolgens de twee verhoogd tot negatieve delta CQ. Voer de berekeningen uit met TUG1-monsters.Wanneer TUG1 aanwezig is als een positieve controle voor cytoplasmatische elementen, zullen de cytoplasmatische fractioneringsniveaus naar verwachting hoger zijn dan nucleaire fractioneringsniveaus. Een negatief resultaat waarbij niveaus van cytoplasmatische fractionering worden waargenomen in het monster met MALAT1. Dit duidt op besmetting van RNA geïsoleerd uit de kernfractie, mogelijk als gevolg van lysisconcentraties die te laag of te hoog zijn.MALAT1 en TUG1 vertoonden de hoogste correlatie met nucleaire en cytoplasmatische scheiding zoals bevestigd door een Western blot en RNA-elektroforese, die de zuiverheid en kwaliteit van de monsters bevestigde. Bovendien kan de zuiverheid van nucleaire en cytoplasmatische extracten worden aangetoond door een Western blot met lamin als marker voor kernfractie en alfa-tubuline als positieve marker voor de cytoplasmatische fractie. Er werd geen piek waargenomen in de cytoplasmatische RNA-elektroforese, wat een hoge kwaliteit en weinig of geen contaminatie in het cytoplasmatische RNA-monster aantoonde.Het gebruik van lysisbuffer is van cruciaal belang voor een goede fractionering en het optimaliseren van de lysisbufferconcentratie tot de gewenste cellijn van belang is essentieel. Deze techniek maakt de gerichte studie van nucleaire en cytoplasmatische interactie mogelijk, die breed toepasbaar is op een verscheidenheid aan onderzoeksonderwerpen en zorgt voor een beter begrip van hoe lokalisatie van specifieke biologische elementen kan correleren met hun functie.

preparation-cytoplasmic-nuclear-long-rnas-from-primary-cultured

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Een protocol voor de voorbereiding van robuuste, kleinschalige HeLa nucleaire extracten wordt beschreven. Dit protocol is waardevol voor testen die het gebruik van kleine populaties van cellen, zoals cellen behandeld met medicijnen of RNAi vereisen. De methode moet voor diverse genexpressie assays en andere celtypes, die onder andere cellen.

Kleinschalige nucleaire extracten voor functionele testen van gen-expressie Machines

RNA polymerase II synthetiseert een precursor RNA dat buiten de 3 'uiteinde van het rijpe mRNA. Het uiteinde van het rijpe RNA cotranscriptionally gegenereerd op een plaats bepaald door RNA-sequenties, via de endonuclease activiteit van de splitsing complex. Hier hebben we detail de methode om splitsingreacties studeren in vitro.

Analyse van RNA processing Reacties Met behulp van Cell Free Systems: 3 &#39;End Splitsing van pre-mRNA Substrates<em&gt; In vitro</em

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Dit manuscript beschrijft een aanpak om selectieve cognate RNP's te isoleren die in eukaryote cellen worden gevormd via een specifieke oligonucleotide-gestuurde verrijking. We tonen de toepasbaarheid van deze aanpak door een cognate RNP te isoleren die gebonden is aan het retrovirale 5' niet-vertaalde gebied dat is samengesteld uit DHX9/RNA-helicase A.

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Deze RNA pull-down methode kunt identificeren van de RNA-doelstellingen van een lang niet-coderende RNA (lncRNA). Gebaseerd op de kruising van zelfgemaakte, ontworpen anti-zin DNA oligonucleotide sondes specifiek voor deze lncRNA in een passende vaste weefsel of cellijn, hierdoor efficiënt de opname van alle RNA doelen met de lncRNA.

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Hier presenteren we een Bioinformatic aanpak en analyses om lijn-1 expressie te identificeren op de Locus specifieke niveau.

De volgende-generatie van RNA het rangschikken en een bioinformatica pijpleiding om uitgedrukte lijn-1S op het Locus-specific niveau te identificeren

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Leer een efficiënte methode voor RNA-isolatie uit nucleaire en cytoplasmatische fracties in gekweekte cellen, gevalideerd met qPCR. Dit protocol biedt een kosteneffectief alternatief voor bestaande kits.

Bereiding van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA's uit primaire en gekweekte cellen

Meer video's verkennen