Intestinale permeabiliteit bepalen met lucifergeel in een apical-out enteroïde model

Het toepassen van Lucifer Yellow op de media van Apical-out enteroïden biedt een eenvoudige methode voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse van alle drie de belangrijkste paracellulaire intestinale permeabiliteitsroutes in een 3D-model. Het is een relatief eenvoudige techniek die ons in staat stelt om de permeabiliteit te beoordelen met behulp van een enteroïde model. We werken met deze techniek in onze studies van necrotiserende enterocolitis.

Deze techniek kan echter nuttig zijn bij het bestuderen van elke menselijke darmziekte, met behulp van een enteroïde model. Het demonstreren van de procedures vandaag zal onze postdoctorale onderzoekswetenschappers, Dr. Tyler Leiva en Dr. Alena Golubkova, evenals Camille Schlegel, de onderzoeksassistent supervisor van ons laboratorium. Om te beginnen, laat de Androids ingebed in BMM gedurende zeven tot 10 dagen groeien met 50% LWRN-geconditioneerde media voor de apiical-out of AO enteroid-generatie.

Verwijder de media rond de BMM-koepels en voeg 500 microliter celhersteloplossing of CRS toe aan één put. Schraap de koepel, pipetteer hem meerdere keren op en neer om het CRS te homogeniseren met de enteroïden ingebed in BMM-koepels en voeg deze oplossing toe aan de volgende put. Schraap nogmaals de koepel en pipetteer deze meerdere keren op en neer voordat u de oplossing overbrengt naar een microcentrifugebuis.

Voeg 500 microliter CRS toe aan de tweede put, pipetteer op en neer om het goed te mengen en breng het over naar de eerste put. Pool vanaf de eerste put de CRS enteroïde BMM-oplossing in dezelfde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en herhaal deze pooling voor de resterende putten totdat de inhoud van alle putten in CRS is. Plaats de microcentrifugebuizen met gepoolde CRS-oplossing gedurende één uur op een rotator bij vier graden Celsius.

Centrifugeer vervolgens de microcentrifugebuis op 200 X g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius voordat u het supernatant verwijdert en de enteroïde pellet opnieuw opschort in één milliliter van 50% LWRN-geconditioneerde media. Breng voorzichtig 500 microliter van de opnieuw gesuspendeerde enteroïde of media-oplossing over op elke put van de ultralage aanhechting 24 put weefselkweekplaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% CO2, gedurende drie dagen voorafgaand aan het experimenteren.

Zorg ervoor dat AO-enteroïden ten minste 72 uur voor gebruik worden opgeschort. Breng alle enteroïden die in media zijn gesuspendeerd uit elke put voorzichtig over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 300 X g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.

Voeg 10 microliter van vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide of LPS toe aan 500 microliter 50% LWRN-geconditioneerde media per put om de mastermix te bereiden en suspensie de AO-enteroïde pellet uit de behandelingsgroep opnieuw in 500 microliter LPS plus 50% LWRN-geconditioneerde media. Pipet op en neer om grondig te mengen. Aliquot 500 microliter suspensie in elke put van een 24-put ultralage bevestigingsplaat.

Op dezelfde manier suspensie de AO-enteroïden uit de onbehandelde controlegroep in 500 microliter 50% LWRN-geconditioneerde media per put en aliquot 500 microliter van deze suspensie in elke put van een afzonderlijke 24-well ultra-lage bevestigingsplaat. Induceer hypoxie in de met LPS behandelde AO-enteroïden met behulp van een modulaire incubatorkamer met 1% zuurstof, 5% koolstofdioxide en 94% stikstof, en incubeer de enteroïden met hypoxie en LPS gedurende 24 uur. Plaats de onbehandelde en LPS plus hypoxie, behandelde culturen gedurende 24 uur in een 5% kooldioxide-incubator.

Om de paracellulaire permeabiliteit te meten met Lucifer Yellow of LY, brengt u de enteroïde of mediasuspensie voorzichtig van elke put over in een microcentrifugebuis. Warm Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing of DPBS, en 50% LWRN geconditioneerde media in een waterbad van 37 graden Celsius. Centrifugeer de suspensie bij 300 X g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de media en was de enteroïde pellet met 500 microliter warme DPBS voor centrifugeren bij 300 X g gedurende drie minuten. Verwijder het supernatant met een micropipet en herhaal de DPBS-wasstap nog een keer. Voeg na het wassen van de DPBS 450 microliter warme 50% LWRN-geconditioneerde media toe en voeg de suspensie toe aan een plaat met 24 putten.

Voeg vervolgens 50 microliter van 2,5 milligram per milliliter LY toe aan elk putje. Draai de plaat voorzichtig om te mengen en plaats hem twee uur in een 5% kooldioxide-incubator. Pipetteer de enteroïde suspensie van elke put voorzichtig in een microcentrifugebuis.

Centrifugeer het en verwijder het supernatant dat de enteroïde pellet achterlaat. Was de pellet met 500 microliter warme DPBS en centrifugeer deze. Verwijder het supernatant dat de pellet achterlaat.

Herhaal drie wasbeurten van de DPBS voordat u de pellet opnieuw opschort met 1000 microliter koude DPBS en dissociëer de enteroïden door krachtig te mengen met behulp van een pipet. Bereid voor de Lucifer Yellow-standaardcurve de normen voor die zijn verdund in DPBS zoals beschreven in de tekst. Pipetteer 150 microliter van elk monster per put in drievoud op een plaat met 96 putten.

Meet de fluorescentie bij een excitatiepiek van 428 nanometer en een emissiepiek van 536 nanometer op een fluorescentieplaatlezer. Bereken de concentraties met behulp van statistische software en een curve met vier parameters die de standaardcurve interpoleert. Immunofluorescente kleuring van de enteroïden gesuspendeerd in 50% LWRN-media gedurende 72 uur toonde Zo-1 op het buitenste apicale oppervlak van de enteroïde, terwijl bèta-catenine wordt gezien op het basolaterale oppervlak.

Het gaf de verwachte polariteitsomkering van enteroïden aan die een AO-conformatie van enteroïden bevestigde. Basolaterale out of BO-enteroïden behandeld met LPS en hypoxie vertoonden een significant verhoogde permeabiliteit die werd aangetoond in een Lucifer Yellow- of LY-test door de verhoogde opname van LY-kleurstof in het enteroïde lumen, vergeleken met onbehandelde controles. Lucifer Yellow assay toonde ook de verhoogde opname van LY in het lumen van behandelde AO enteroïden in vergelijking met onbehandelde controles.

Het bevestigde de verhoogde permeabiliteit van AO-enteroïden behandeld met LPS en hypoxie, in vergelijking met de onbehandelde controles. Het is belangrijk om de enteroïde pellets grondig te wassen om ervoor te zorgen dat alle extraluminale LY wordt verwijderd. Het maakt de nauwkeurige kwantificering van de resterende intraluminale LY mogelijk bij het berekenen van de permeabiliteit.

Voor kwalitatieve analyse kunnen enteroïden worden gevisualiseerd via fluorescente microscopie voor LY-opname in het lumen. Na LY-incubatie en daaropvolgende wasstappen voordat u zich distantieert van microplaataflezing.