ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

ATAC-seq stelt ons in staat om de status van de open chromatinegebieden in het genoom te identificeren, die vaak wordt gewijzigd in de ziektetoestanden in vergelijking met de normale toestand. Minder celinvoer, een vereenvoudigd protocol van Tn5-vertering, gevolgd door isolatie van gefragmenteerd DNA en bibliotheekvoorbereiding door PCR-amplificatie en kortere experimentele tijd maken het een voordeligere techniek. Vergelijking van het veranderde epigenetische landschap door ATAC-seq tussen normale en ziekteomstandigheden kan licht werpen op de ziekte-geassocieerde chromatine regulerende elementen en nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën.

Deze techniek is gemakkelijk uit te voeren, omdat het geen kritieke experimentele stappen bevat. Om succesvolle ATAC-seq-resultaten te krijgen, zijn slechts een paar standaardisatiestappen nodig. Om te beginnen, breng 25 microliter over van een celsuspensie met een miljoen cellen per milliliter in PBS naar een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter en centrifugeer bij 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Gooi het supernatant voorzichtig weg en voeg 25 microliter lysisbuffer toe. Hang de cellen opnieuw op door voorzichtig op en neer te pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant voorzichtig weg.

Suspensie de pellet onmiddellijk opnieuw in 25 microliter Tn5-reactiemengsel en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Meng de oplossing elke 10 minuten. Voeg vijf microliter 3-molair natriumacetaat en 125 microliter buffer PB toe aan de Tn5-gelabelde DNA-oplossing.

Meng goed. Plaats vervolgens de spinkolom in een verzamelbuis van 2 milliliter en breng het monster aan op de spinkolom. Centrifugeer bij 17.900 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur en gooi de doorstroom weg.

Voeg PE-buffer toe aan de kolom en draai de kolom. Plaats de spinkolom terug in dezelfde verzamelbuis en centrifugeer deze gedurende vijf minuten om het membraan volledig te drogen. Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter.

Eluteer de DNA-fragmenten met 10 microliter buffer EB en laat de kolom een minuut staan bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens op 17.900 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur om het DNA te elueren. Stel de PCR-reactie in PCR-buizen van 200 microliter in en voer PCR Amplification Program Part One uit.

Bereid voor real-time QPCR het PCR-reactiemengsel voor door vijf microliter PCR-product, 0,75 microliter 1.000 keer verdund SYBR Gold, vijf microliter 2X PCR Master Mix en 3,75 microliter nucleasevrij water toe te voegen. Bepaal het vereiste aantal extra PCR-cycli met behulp van de uitvoeringsparameters. Zodra het cyclusnummer is bepaald, stelt u PCR's in met de extra cycli die eerder zijn berekend.

Voeg aan de versterkte PCR-producten 150 microliter kralen toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buizen gedurende vijf minuten op een magnetische standaard en verwijder het supernatant voorzichtig. Was de kralen met 200 microliter 80% ethanol en verwijder het supernatant.

Verwijder de ethanol volledig en droog de monsters gedurende 10 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur. Ten slotte opnieuw suspensie met 50 microliter elutiebuffer. Plaats de buis op een magnetische standaard en breng het eluaat over in een verse microcentrifugebuis van 1,7 milliliter.

Een vergelijking van de efficiëntie van cellysis met behulp van trypan blue wordt hier getoond. NMuMG-cellen werden behandeld met een hypotone buffer en CSK-buffer en gekleurd met trypanblauw. Hogere cellyse-efficiëntie werd waargenomen in met CSK behandelde cellen.

ATAC-seq bibliotheken werden bereid uit MDA-MB-231 borstkankercellen. Na PCR-versterking werden PCR-producten geanalyseerd op een 0,5X TBE, 1,5% agarose gel voor en na kralenzuivering. Primers worden meestal verwijderd door de eerste kralenzuivering.

DNA-bandpatronen van 1X TAE 1% agarose gel-elektroforese en een geautomatiseerde elektroforese zijn ook geïndiceerd. SYBR Gold werd gebruikt om de hier getoonde DNA-fragmenten te visualiseren. Een genoombrowsertrack met de ERS1-locus wordt hier gepresenteerd.

De genoomdekking van de ATAC-seq-gegevens in T47D-cellen wordt in deze afbeelding weergegeven. Primers uit een eerdere publicatie zijn gebruikt en hun doelgebieden zijn geel gemarkeerd. Een staafdiagram met de verrijking van primer amplicon in ATAC-seq-bibliotheken wordt hier weergegeven.

ATAC-seq bibliotheken werden voorbereid door de hypotone buffer of een CSK-buffer. De representatieve afbeelding toont de genoombrowservisualisatie voor ATAC-seq-optimalisatie. De ATAC-seq-gegevens van de 25.000-cel input conditie toonden de hoogste verrijking van nucleosoomvrije fragmenten, terwijl de 100,000-cel input conditie de hoogste mononucleosomale DNA's vertoonde.

Genoombrowsertracks met ATAC-seq-gegevens van verschillende celnummers worden hier gepresenteerd. HOMER-piekannotatieanalyse wordt weergegeven in deze representatieve afbeelding. HOMER classificeerde elke piek als een promotor proximale of distale piek.

Het aantal celinvoerkeuze van de cellysebuffer en de concentratie van het Tn5-enzym afhankelijk van het celtype zijn de meest kritische parameter die moet worden gestandaardiseerd. Tn5 gefuseerd met eiwit A in de cut-and-tack-techniek wordt veel gebruikt om DNA-bindingsplaats te identificeren voor een eiwit van belang met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor dat eiwit van belang.