Name: ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer ATAC-seq optimalisatie voor kanker epigenetica onderzoek met epitheliale celtypen. Deze methode identificeert chromatine toegankelijkheidsveranderingen en helpt bij het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de UND Genomics Core-faciliteit voor uitstekende technische assistentie.
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health [P20GM104360 tot M.T., P20 GM104360 tot A.D.] en start-upfondsen verstrekt door de University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [tot M.T.].

1. Voorbereidingen voordat het experiment begint
<ol><li>Bereid lysis buffervoorraad voor. OPMERKING: De optimale nucleaire isolatiebuffer kan voor elk celtype anders zijn. We raden aan om zowel de hypotone buffer die in het originele artikel8 is gebruikt als een CSK-buffer12,13 voor elk celtype te testen met behulp van trypanblauwe kleuring.<ol><li>Om hypotone buffer (Greenleaf buffer) te bereiden, mengt u 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 en 0,1% NP-40.</li>
		<li>Om CSK-buffer te bereiden, mengt u 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2 en 0,1% Triton X-100.</li>
	</ol></li>
	<li>Zorg ervoor dat de celkweekcondities optimaal zijn; onderzoek de cellen onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen verhoogde niveaus van apoptose zijn.</li>
	<li>Zet de centrifuge aan om deze op 4 °C te laten komen.</li>
</ol>2. Celoogst
<ol><li>Aspirate media uit een celcultuur met <80% samenvloeiing. Cellen worden meestal gekweekt in een schaal van 35 mm of 60 mm, op basis van het aantal benodigde cellen, behandelingen, enz.</li>
	<li>Was de cellen met 1 ml of 3 ml PBS.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml of 1 ml trypsine toe en incubeer gedurende 2-3 minuten (afhankelijk van de celtypen). Gebruik voorzichtig een pipet van 1 ml om goed te mengen.</li>
	<li>Voeg 1 ml of 2 ml media toe aan het bord en meng goed. Breng over naar een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen in een buis van 15 ml gedurende 3 minuten bij 300 x g. OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren.</li>
	<li>Aspirateer de media en resuspendeer de cellen in 1 ml of 2 ml medium. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om een homogene eencellige oplossing te bereiden. Voor weefsels kan een Dounce-homogenisator worden gebruikt om weefsels te homogeniseren en grote celklompen of aggregaten te minimaliseren. Sommige weefsels vereisen filtratie (bijv. Celzeefmachines) en/of FACS-celsortering om levensvatbare cellen te isoleren en een oplossing met één cel te verkrijgen.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van een celteller. OPMERKING: In deze studie werd een geautomatiseerde celteller (Tabel van Materialen) gebruikt.</li>
	<li>Centrifugeer het vereiste celvolume (bijvoorbeeld een volume met 1 x 106 cellen op basis van het celgetal) bij 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Resuspendeer de celpellet met 1 x 106 cellen in 1 ml koude PBS. OPMERKING: Als het aantal cellen kleiner is dan 1 x 106 cellen, verlaagt u het koude PBS-volume om de celoplossing in dezelfde concentratie te bereiden (1 x 106 cellen/ml).</li>
</ol>3. Cellyse
<ol><li>Breng 25 μL (= 2,5 x 104 cellen) over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren. Laat ongeveer 3 μL supernatant achter om ervoor te zorgen dat de cellen niet worden weggegooid.</li>
	<li>Voeg 25 μL lysisbuffer toe en resuspensieer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg. OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren. Laat ongeveer 3 μL supernatant achter om ervoor te zorgen dat de cellen niet worden weggegooid.</li>
</ol>4. Tn5 tagmentatie
<ol><li>Resuspenseer de pellet onmiddellijk in 25 μL Tn5-reactiemengsel. Het Tn5-reactiemengsel is als volgt: 12,5 μL 2x Tagmentation DNA-buffer (TD-buffer), 1,25-5 μL Tn5 transposase en 11,25-7,5 μL nucleasevrij water. OPMERKING: De standaardconcentratie van Tn5 is 2,5 μL voor 2,5 x 104 cellen.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C. OPMERKING: Meng de oplossing elke 10 min.</li>
</ol>5. DNA-zuivering
OPMERKING: Zuivering is vereist voor versterking. DNA-zuivering gebeurt met behulp van de MinElute PCR-zuiveringskit (Materiaaltabel).
<ol><li>Voeg 5 μL natriumacetaat van 3 M (pH 5,2) toe.</li>
	<li>Voeg onmiddellijk 125 μL Buffer PB toe en meng goed.</li>
	<li>Volg het PCR-zuiveringskitprotocol vanaf stap 2.<ol><li>Plaats de spinkolom in een opvangbuis van 2 ml.</li>
		<li>Breng het monster aan op de spinkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT.</li>
		<li>Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis.</li>
		<li>Voeg 750 μL buffer PE toe aan de spinkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT.</li>
		<li>Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis.</li>
		<li>Centrifugeer de spinkolom gedurende 5 minuten om het membraan volledig te drogen.</li>
		<li>Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml.</li>
		<li>Eluteer de DNA-fragmenten met 10 μL buffer EB.</li>
		<li>Laat de kolom 1 min staan bij RT.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT om het DNA te elueren.</li>
	</ol></li>
</ol>6. PCR-versterking
OPMERKING: PCR-versterking van getransponeerde (tagmented) DNA's is noodzakelijk voor sequencing. In dit voorbeeld zijn nextera kitadapters (Materiaaltabel) gebruikt. De in dit onderzoek gebruikte primers zijn opgenomen in tabel 1.
<ol><li>Stel de volgende PCR-reactie in 200 μL PCR-buizen in (50 μL voor elk monster). Het PCR-reactiemengsel is als volgt: 10 μL geëlueerd DNA (stap 5.), 2,5 μL van 25 mM Adapter 1, 2,5 μL van 25 mM Adapter 2, 25 μL van 2x PCR-mastermix en 10 μL nucleasevrij water</li>
	<li>Voer pcr-versterkingsprogramma deel 1 uit (tabel 2). OPMERKING: Voor initiële versterking worden dezelfde voorwaarden gebruikt voor alle monsters die een standaard thermische cycler gebruiken.</li>
	<li>Real-time qPCR (totaal 14,5 μL per monster)<ol><li>Stel met behulp van 5 μL van het product uit het PCR-versterkingsdeel 1 (stap 6.2.) de volgende reactie in, dit keer inclusief SYBR-goud en detectie in een real-time PCR-machine.</li>
		<li>Bereid het PCR-reactiemengsel als volgt: 5 μL PCR-product uit stap 6.2., 0,75 μL SYBR-goud (1000x verdund), 5 μL 2x PCR-mastermix en 3,75 μL nucleasevrij water. OPMERKING: De precieze cyclusnummers voor bibliotheekversterking voordat de verzadiging voor elk monster wordt bereikt, worden bepaald door qPCR (tabel 3) om de GC- en groottebias in PCR10 te verminderen. SYBR Gold werd verdund met nucleasevrij water. Om de verdunde oplossing te maken, werd 1 μL SYBR Gold (voorraadconcentratie 10.000x) toegevoegd aan 999 μL nucleasevrij water. De looptijd van RT-qPCR vermeld in tabel 3 is ongeveer 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Bepaal het vereiste aantal extra PCR-cycli met behulp van de uitvoeringsparameters uit stap 6.3.<ol><li>Aantal cycli = 1/4 maximale (verzadigde) fluorescentie-intensiteit (typisch 3 of 4 PCR-cycli)</li>
	</ol></li>
	<li>PCR-versterkingsprogramma deel 2 (volume = 45 μL; Tabel 4): Nadat u het cyclusnummer hebt bepaald, stelt u PCR's in met extra cycli berekend in stap 6.4.1. Als het berekende cyclusgetal bijvoorbeeld 3 is, stelt u 3 cycli in het onderstaande programma in. De totale cycli zouden 8 zijn (5 in stap 6.2., plus 3 extra cycli in stap 6.5.)</li>
</ol>7. Kralen zuivering
OPMERKING: Hier werden AMPure XP (Table of Materials) kralen gebruikt.
<ol><li>Voeg aan de PCR-producten die in de vorige stap zijn versterkt 150 μL kralen toe bij RT. OPMERKING: Zelfgemaakte AMPure kralen14 kunnen in dit proces worden gebruikt.</li>
	<li>Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.</li>
	<li>Plaats de buizen gedurende 5 minuten op een magnetische standaard.</li>
	<li>Verwijder het supernatant voorzichtig.</li>
	<li>Was de kralen met 200 μL 80% ethanol. OPMERKING: 80% ethanol moet vers worden bereid.</li>
	<li>Herhaal stap 7.4.</li>
	<li>Verwijder de ethanol volledig.</li>
	<li>Droog de monsters gedurende 10 minuten aan de lucht bij RT.</li>
	<li>Resuspend met 50 μL el elutiebuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).</li>
	<li>Herhaal de kralenzuivering (stappen 7.1.-7.9.) om de primerbesmetting verder te minimaliseren.</li>
</ol>8. DNA-concentratie en kwaliteitscontrole
<ol><li>Meet de DNA-concentratie met behulp van een nucleïnezuurkwantificatiekit (Tabel van materialen).</li>
	<li>Controleer de versterkte DNA-fragmenten door gel-elektroforese met SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% agarosegel) of een geautomatiseerd elektroforesesysteem (bijv. TapeStation, bioanalyzer).</li>
</ol>9. Volgorde
<ol><li>Voer high-throughput sequencing uit met behulp van de versterkte DNA-monsters12,13. OPMERKING: Versterkte DNA-monsters zijn klaar voor high-throughput sequencing. Om nucleosomale DNA-fragmentinformatie te behouden, wordt paired-end sequencing aanbevolen boven single-end sequencing. Beide uiteinden van de DNA-fragmenten geven aan waar de transposase bindt. Voor het in kaart brengen van open chromatinegebieden is 30 miljoen reads/sample doorgaans voldoende.</li>
</ol>10. Data-analyse
<ol><li>Gegevensfiltratie op basis van de kwaliteit van de basisoproep: stel de minimale gemiddelde basiskwaliteitsscore in op 20 (99% nauwkeurigheid).</li>
	<li>Adapter bijsnijden: verwijder de adapterreeksen met een geschikt gereedschap. OPMERKING: Het trim galore wrapper tool (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) werd gebruikt om adaptersequenties te verwijderen. Voor ATAC-seq bibliotheken die door Illumina Tn5 zijn voorbereid, wordt de volgende reeks gebruikt als adaptersequentie: CTGTCTCTTATACACATCT. De minimale volgordelengte om adapterverontreiniging te herkennen is ingesteld op 5.</li>
	<li>Genoomkartering: Breng de metingen in kaart aan het juiste genoom met Bowtie met behulp van de volgende parameters "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Een voorbeeld van het in kaart brengen van kwaliteit van MDA-MB-231 basale borstkankercellen is hieronder: Leest met ten minste één gerapporteerde uitlijning: 52,79% Leeswaarden die niet uitlijnd zijn: 13,10% Leest met uitlijningen onderdrukt als gevolg van -m: 34,11%</li>
	<li>Ontdubbeling: Markeer de PCR-duplicaten door Picard tools16.</li>
	<li>Een genoomdekkingsbestand genereren voor gegevensvisualisatie: converteer de ontdubbelde paired-end reads naar single-end leesfragmenten. Genoomdekkingssporen worden verkregen met behulp van genomeCoverageBed van bedtools17.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+the+regulatory+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and the regulatory epigenome.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+chromatin+accessibility+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers.</a> Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).</li>
<li>Sanghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+associates+with+protein-RNA+correlation+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer.</a> Nature Communications. 12 (1), 5732(2021).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+accessibility+landscape+of+primary+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chromatin accessibility landscape of primary human cancers.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li>
<li>Boyle, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+and+characterization+of+open+chromatin+across+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome.</a> Cell. 132 (2), 311-322 (2008).</li>
<li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAIRE+%28Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li>
<li>Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+DNA+methylation+and+chromatin+structural+analysis+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution.</a> Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+chromatin+defined+by+DNaseI+and+FAIRE+identifies+regulatory+elements+that+shape+cell-type+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity.</a> Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 1(2015).</li>
<li>Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+overview+of+epigenomic+profiling+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A comparative overview of epigenomic profiling methods.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687(2021).</li>
<li>Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+ATAC-Seq+data+recovered+from+cryopreserved+breast+cell+lines+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue.</a> Scientific Reports. 9 (1), 516(2019).</li>
<li>Takaku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA3-dependent+cellular+reprogramming+requires+activation-domain+dependent+recruitment+of+a+chromatin+remodeler%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler.</a> Genome Biology. 17, 36(2016).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), 25(2009).</li>
<li>Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://broadinstitute.github.io/picard/">https://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2022).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INO80+governs+superenhancer-mediated+oncogenic+transcription+and+tumor+growth+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma.</a> Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).</li>
<li>Takaku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA3+zinc+finger+2+mutations+reprogram+the+breast+cancer+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network.</a> Nature Communications. 9 (1), 1059(2018).</li>
<li>Oldfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-Y+controls+fidelity+of+transcription+initiation+at+gene+promoters+through+maintenance+of+the+nucleosome-depleted+region%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region.</a> Nature Communications. 10 (1), 3072(2019).</li>
<li>Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+SMARCB1+suppresses+super-enhancers+to+govern+hESC+lineage+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination.</a> Elife. 8, 45672(2019).</li>
<li>Elrod, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integrator+complex+attenuates+promoter-proximal+transcription+at+protein-coding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes.</a> Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
<li>Porter, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+inhibition+with+specific+activation%3A+How+p53+and+MYC+redistribute+the+transcriptome+in+the+DNA+double-strand+break+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response.</a> Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).</li>
<li>Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+mediates+epithelial+to+mesenchymal+transitions+by+repression+of+estrogen+receptor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha.</a> Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).</li>
<li>McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PeaKDEck%3A+A+kernel+density+estimator-based+peak+calling+program+for+DNaseI-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).</li>
<li>Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+profiling+by+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+breast+cancer+therapy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 1786(2021).</li>
<li>Bhattacharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+channel+proteins+ORAI3+and+STIM1+mediate+TGF-%CE%B2+induced+Snai1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression.</a> Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).</li>
<li>Schep, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+nucleosome+fingerprints+enable+high-resolution+mapping+of+chromatin+architecture+within+regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions.</a> Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen relevante of materiële financiële belangen zijn die verband houden met het onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven.

ATAC-seq is op grote schaal gebruikt voor het in kaart brengen van open en actieve chromatinegebieden. De progressie van kankercellen wordt vaak aangedreven door genetische veranderingen en epigenetische herprogrammering, wat resulteert in veranderde chromatinetoegankelijkheid en genexpressie. Een voorbeeld van deze herprogrammering wordt gezien tijdens de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) en het omgekeerde proces, mesenchymale naar epitheliale overgang (MET), waarvan bekend is dat het belangrijke cellulaire h...

Chromatine toegankelijkheid is een belangrijke vereiste voor de regulatie van genexpressie op een genoombrede schaal1. Veranderingen in de toegankelijkheid van chromatine worden vaak geassocieerd met verschillende ziektetoestanden, waaronder kanker 2,3,4. In de loop der jaren zijn tal van technieken ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen het chromatinelandschap te onderzoeken door gebieden van chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen. Sommigen van hen omvatten DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, en de focus van dit artikel, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq brengt toegankelijke gebieden in kaart door gebruik te maken van een belangrijk kenmerk van DNase, namelijk de preferentiële vertering van naakt DNA vrij van histonen en andere eiwitten zoals transcriptiefactoren5. FAIRE-seq, vergelijkbaar met ChIP-seq, maakt gebruik van formaldehyde crosslinking en sonicatie, behalve dat er geen immunoprecipitatie bij betrokken is en de nucleosoomvrije regio's worden geïsoleerd door fenol-chloroformextractie6. De MAPit-methode maakt gebruik van een GC-methyltransferase om de chromatinestructuur te testen met een resolutie van één molecuul7. ATAC-seq vertrouwt op de hyperactieve transposase, Tn58. De Tn5 transposase bindt bij voorkeur aan open chromatinegebieden en plaatst sequencingadapters in toegankelijke gebieden. Tn5 werkt via een DNA-gemedieerd "knip en plak" mechanisme, waarbij de transposase vooraf geladen met adapters bindt aan open chromatine sites, knipt DNA en ligeert de adapters8. Tn5-gebonden gebieden worden hersteld door PCR-versterking met behulp van primers die naar deze adapters gloeien. FAIRE-seq en DNase-seq vereisen een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal (~ 100.000 cellen tot 225.000 cellen) en een afzonderlijke bibliotheekvoorbereidingsstap voordat9 wordt gesequenceerd. Aan de andere kant is het ATAC-seq-protocol relatief eenvoudig en vereist het een klein aantal cellen (<50.000 cellen)10. In tegenstelling tot de FAIRE-seq- en DNase-seq-technieken is de sequencingbibliotheekvoorbereiding van ATAC-seq relatief eenvoudig, omdat het geïsoleerde DNA-monster al door Tn5 wordt getagd met de sequencingadapters. Daarom is alleen de PCR-versterkingsstap met de juiste primers nodig om de bibliotheekvoorbereiding te voltooien en hoeven de voorafgaande verwerkingsstappen zoals eindreparatie en adapterligatie niet te worden uitgevoerd, waardoor tijd wordt bespaard11. Ten tweede vermijdt ATAC-seq de noodzaak van bisulfietconversie, klonen en versterking met regiospecifieke primers die vereist zijn voor MAPit7. Vanwege deze voordelen is ATAC-seq een enorm populaire methode geworden voor het definiëren van open chromatinegebieden. Hoewel de ATAC-seq-methode eenvoudig is, vereisen meerdere stappen optimalisatie om hoogwaardige en reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Dit manuscript bespreekt optimalisatieprocedures voor standaard ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding, met name drie parameters: (1) lysisbuffersamenstelling, (2) Tn5-transposaseconcentratie en (3) celnummer. Daarnaast biedt dit artikel voorbeeldgegevens van de optimalisatieomstandigheden met behulp van zowel kankerachtige als niet-kankerachtige aanhangende epitheelcellen.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Natural</td></tr><tr><td>10 &micro;L XL TipOne tips</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>Gefilterd en met lage retentie</td></tr><tr><td>100 &micro;L XL TipOne RPT tips</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td>Gefilterd en met lage retentie</td></tr><tr><td>100 &micro;L XL TipOne tips</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840</td><td>Gefilterd en met lage retentie. Bevelled Grade</td></tr><tr><td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;L TipOne RPT tips</td><td>USA Scientific</td><td>1183-1810</td><td>Gefilterd en met lage retentie</td></tr><tr><td>200 &micro;L TipOne RPT tips</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td>Gefilterd en met lage retentie</td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>YBP136010</td><td>Genetic Analysis Grade</td></tr><tr><td>All the cell lines used in this study are obtained from ATCC</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364658</td><td>SX2415</td></tr><tr><td>AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Bead purification kit</td></tr><tr><td>CellDrop Cell Counter</td><td>DeNovix</td><td>CellDrop FL</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>BioUltra, watervrij, &ge;99% (titratie)</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC615100020</td><td>Watervrij; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - TET Tested</td><td>R&amp;D Systems</td><td>S10350</td><td>Drievoudig 0,1 &micro;m gefilterd</td></tr><tr><td>Gibco DMEM 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td>[+] 4,5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Gibco PBS 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>(0,25%), fenolrood</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>IBI Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MilliporeSigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA-zuiveringskit</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>IBI Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>BioXtra, &ge;98% (acidimetrisch), pellets (watervrij)</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Sample Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td>2x TD en Tn5 Transposase</td></tr><tr><td>NP - 40 (IGEPAL CA-630)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I8896</td><td>voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>PCR Detection System</td><td>BioRad</td><td>1855484</td><td>CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1851</td><td>BioPerformance Certified, geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen; Nucleïnezuurkwantitatiekkit</td></tr><tr><td>Quibit Assay Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>MilliporeSigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Homemade</td><td>-</td><td>pH 5,2</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>IBI Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix, 1,25 mL</td><td>BioRad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure 0,2 mL PCR 8-Tube Strips</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td>Flex-free, natuurlijk, polypropyleen</td></tr><tr><td>TempPlate 384-WELL PCR PLATE</td><td>USA Scientific</td><td>1438-4700</td><td>Single notch. Natuurlijk polypropyleen</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>MilliporeSigma</td><td>648311</td><td>ULTROL Grade</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>IBI Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit</td><td>Illumina</td><td>PE-121-1003</td><td>paired-end</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>BioXtra, stroperige vloeistof</td></tr><tr><td>Water</td><td>MilliporeSigma</td><td>W3500</td><td>sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celcultuur</td></tr></tbody></table>

atac-seq optimalisatie voor kanker epigenetica onderzoek

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

De test voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) onderzoekt de toegankelijkheid van desoxyribonucleïnezuur (DNA) met behulp van het hyperactieve Tn5-transposase. Tn5 snijdt en ligeert adapters voor high-throughput sequencing binnen toegankelijke chromatinegebieden. In eukaryote cellen is genomisch DNA verpakt in chromatine, een complex van DNA, histonen en andere eiwitten, dat fungeert als een fysieke barrière voor de transcriptionele machinerie. Als reactie op extrinsieke signalen rekruteren transcriptiefactoren chromatineremodelleringscomplexen om toegang tot de transcriptionele machinerie mogelijk te maken voor genactivering. Daarom is het identificeren van open chromatinegebieden nuttig bij het monitoren van versterker- en genpromotoractiviteiten tijdens biologische gebeurtenissen zoals kankerprogressie. Omdat dit protocol gemakkelijk te gebruiken is en een lage celinvoervereiste heeft, is ATAC-seq op grote schaal gebruikt om open chromatinegebieden in verschillende celtypen, waaronder kankercellen, te definiëren. Voor succesvolle data-acquisitie moeten verschillende parameters worden overwogen bij het voorbereiden van ATAC-seq-bibliotheken. Onder hen zijn de keuze van de cellysebuffer, de titratie van het Tn5-enzym en het startvolume van cellen cruciaal voor de atac-seq-bibliotheekvoorbereiding in kankercellen. Optimalisatie is essentieel voor het genereren van hoogwaardige gegevens. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de ATAC-seq-optimalisatiemethoden voor epitheelceltypen.

Om succesvolle en hoogwaardige ATAC-seq-gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de experimentele omstandigheden te optimaliseren. ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding kan worden onderverdeeld in de vijf belangrijkste stappen (figuur 1), namelijk cellyse, tagmentatie (fragmentatie en adapterinbrenging door Tn5), genomische DNA-zuivering, PCR-amplificatie en gegevensanalyse. Als eerste proces moet de cellysisbuffer (nucleaire isolatie) eerst voor elk celtype worden geoptimaliseerd. Ofwel de ...

ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.

ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

ATAC-seq stelt ons in staat om de status van de open chromatinegebieden in het genoom te identificeren, die vaak wordt gewijzigd in de ziektetoestanden in vergelijking met de normale toestand. Minder celinvoer, een vereenvoudigd protocol van Tn5-vertering, gevolgd door isolatie van gefragmenteerd DNA en bibliotheekvoorbereiding door PCR-amplificatie en kortere experimentele tijd maken het een voordeligere techniek. Vergelijking van het veranderde epigenetische landschap door ATAC-seq tussen normale en ziekteomstandigheden kan licht werpen op de ziekte-geassocieerde chromatine regulerende elementen en nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën.Deze techniek is gemakkelijk uit te voeren, omdat het geen kritieke experimentele stappen bevat. Om succesvolle ATAC-seq-resultaten te krijgen, zijn slechts een paar standaardisatiestappen nodig. Om te beginnen, breng 25 microliter over van een celsuspensie met een miljoen cellen per milliliter in PBS naar een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter en centrifugeer bij 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Gooi het supernatant voorzichtig weg en voeg 25 microliter lysisbuffer toe. Hang de cellen opnieuw op door voorzichtig op en neer te pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant voorzichtig weg.Suspensie de pellet onmiddellijk opnieuw in 25 microliter Tn5-reactiemengsel en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Meng de oplossing elke 10 minuten. Voeg vijf microliter 3-molair natriumacetaat en 125 microliter buffer PB toe aan de Tn5-gelabelde DNA-oplossing.Meng goed. Plaats vervolgens de spinkolom in een verzamelbuis van 2 milliliter en breng het monster aan op de spinkolom. Centrifugeer bij 17.900 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur en gooi de doorstroom weg.Voeg PE-buffer toe aan de kolom en draai de kolom. Plaats de spinkolom terug in dezelfde verzamelbuis en centrifugeer deze gedurende vijf minuten om het membraan volledig te drogen. Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter.Eluteer de DNA-fragmenten met 10 microliter buffer EB en laat de kolom een minuut staan bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens op 17.900 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur om het DNA te elueren. Stel de PCR-reactie in PCR-buizen van 200 microliter in en voer PCR Amplification Program Part One uit.Bereid voor real-time QPCR het PCR-reactiemengsel voor door vijf microliter PCR-product, 0,75 microliter 1.000 keer verdund SYBR Gold, vijf microliter 2X PCR Master Mix en 3,75 microliter nucleasevrij water toe te voegen. Bepaal het vereiste aantal extra PCR-cycli met behulp van de uitvoeringsparameters. Zodra het cyclusnummer is bepaald, stelt u PCR's in met de extra cycli die eerder zijn berekend.Voeg aan de versterkte PCR-producten 150 microliter kralen toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buizen gedurende vijf minuten op een magnetische standaard en verwijder het supernatant voorzichtig. Was de kralen met 200 microliter 80% ethanol en verwijder het supernatant.Verwijder de ethanol volledig en droog de monsters gedurende 10 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur. Ten slotte opnieuw suspensie met 50 microliter elutiebuffer. Plaats de buis op een magnetische standaard en breng het eluaat over in een verse microcentrifugebuis van 1,7 milliliter.Een vergelijking van de efficiëntie van cellysis met behulp van trypan blue wordt hier getoond. NMuMG-cellen werden behandeld met een hypotone buffer en CSK-buffer en gekleurd met trypanblauw. Hogere cellyse-efficiëntie werd waargenomen in met CSK behandelde cellen.ATAC-seq bibliotheken werden bereid uit MDA-MB-231 borstkankercellen. Na PCR-versterking werden PCR-producten geanalyseerd op een 0,5X TBE, 1,5% agarose gel voor en na kralenzuivering. Primers worden meestal verwijderd door de eerste kralenzuivering.DNA-bandpatronen van 1X TAE 1% agarose gel-elektroforese en een geautomatiseerde elektroforese zijn ook geïndiceerd. SYBR Gold werd gebruikt om de hier getoonde DNA-fragmenten te visualiseren. Een genoombrowsertrack met de ERS1-locus wordt hier gepresenteerd.De genoomdekking van de ATAC-seq-gegevens in T47D-cellen wordt in deze afbeelding weergegeven. Primers uit een eerdere publicatie zijn gebruikt en hun doelgebieden zijn geel gemarkeerd. Een staafdiagram met de verrijking van primer amplicon in ATAC-seq-bibliotheken wordt hier weergegeven.ATAC-seq bibliotheken werden voorbereid door de hypotone buffer of een CSK-buffer. De representatieve afbeelding toont de genoombrowservisualisatie voor ATAC-seq-optimalisatie. De ATAC-seq-gegevens van de 25.000-cel input conditie toonden de hoogste verrijking van nucleosoomvrije fragmenten, terwijl de 100,000-cel input conditie de hoogste mononucleosomale DNA's vertoonde.Genoombrowsertracks met ATAC-seq-gegevens van verschillende celnummers worden hier gepresenteerd. HOMER-piekannotatieanalyse wordt weergegeven in deze representatieve afbeelding. HOMER classificeerde elke piek als een promotor proximale of distale piek.Het aantal celinvoerkeuze van de cellysebuffer en de concentratie van het Tn5-enzym afhankelijk van het celtype zijn de meest kritische parameter die moet worden gestandaardiseerd. Tn5 gefuseerd met eiwit A in de cut-and-tack-techniek wordt veel gebruikt om DNA-bindingsplaats te identificeren voor een eiwit van belang met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor dat eiwit van belang.

atac-seq-optimization-for-cancer-epigenetics-research

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.

Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine in combinatie met high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een genoom-brede methode aan het licht brengen van toegankelijke chromatine. Dit is een stapsgewijze ATAC-seq-protocol, van moleculaire aan computationele uiteindelijk geoptimaliseerd voor menselijke lymfocyten (Th1/Th2). Dit protocol kan worden aangenomen door onderzoekers zonder voorafgaande ervaring in volgorde van volgende-generatie methoden.

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

Gedetailleerde protocollen voor de invoering van een gemanipuleerde split-TET2 enzym (appelwijn) in zoogdiercellen voor chemische afleidbare DNA-hydroxymethylation en epigenetische remodeling worden gepresenteerd.

Een gemanipuleerde Split-TET2 enzym voor chemische-afleidbare DNA Hydroxymethylation en epigenetische Remodeling

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een test voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) op de geactiveerde CD4 + menselijke lymfocyten. Het protocol is aangepast om het minimaliseren van verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest van 50% tot 3% via de invoering van een nieuwe lysis-buffermengsel.

ATAC-seq Assay met lage mitochondriaal DNA besmetting van primaire menselijke CD4 + T lymfocyten

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

We presenteren een protocol voor assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifiek op adipocyten met behulp van kernsortering met vetweefsels geïsoleerd uit transgene reportermuizen met nucleaire fluorescentielabeling.

Adipocyt-specifieke ATAC-Seq met vetweefsels met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering

Dit manuscript schetst een protocol voor het voorbereiden van een ATAC-seq-bibliotheek van neutrofielen uit muizenbeenmerg, met als doel een optimale levensvatbaarheid van neutrofielen en een hoge bibliotheekkwaliteit te garanderen. Het biedt stapsgewijze instructies voor BMC-voorbereiding, immunomagnetische sortering en bibliotheekconstructie, en dient als een waardevolle gids, vooral voor nieuwkomers in het bestuderen van neutrofielen.

ATAC-SEQ Bibliotheekbereiding van van muizen beenmerg-afgeleide neutrofielen

Hier presenteren we een snel en eenvoudig ATAC-seq-protocol dat geïmplementeerd kan worden in L4-fase Caenorhabditis elegans whole-worm met slechts 30 μL wormpellet.

Chromatine toegankelijkheidsprofilering bij hele Caenorhabditis elegans L4-larven

Leer ATAC-seq optimalisatie voor kanker epigenetica onderzoek met epitheliale celtypen. Deze methode identificeert chromatine toegankelijkheidsveranderingen en helpt bij het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën.

ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

Meer video's verkennen