Gebruik van in vivo beeldvorming om te screenen op morfogenese fenotypes in Candida albicans mutante stammen tijdens actieve infectie bij een zoogdiergastheer

Candida albicans morfogenese wordt veroorzaakt door een groot aantal omgevingssignalen. Door morfogenese in vivo te bestuderen, bepalen we hoe het organisme al deze omgevingssignalen integreert en erop reageert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om morfogenese te bestuderen in afwezigheid van bias of artefacten die kunnen worden geïntroduceerd met behulp van in vitro modelsystemen.

Zeer weinig mensen hebben ervaring met intradermale injecties. Ik raad ten zeerste aan dat iemand die nieuw is bij deze techniek contact opneemt met hun dierenarts voor dierenhulp voor hulp bij het leren ervan. De procedure wordt gedemonstreerd door Rohan Wakade, een postdoc uit onze laboratoriumgroep.

Begin met het voorbereiden van het dier op inenting door chlorofylvrije chow gedurende ten minste zeven dagen vóór de inenting te voeren. Neem een dag voorafgaand aan de injectie een schar Canadese albicanscellen uit één kolonie met behulp van een tandenstoker. Ent 25 milliliter YPD en herhaal dit proces meerdere keren om cellen uit verschillende kolonies te verkrijgen.

Incubeer de cultuur 's nachts bij 30 graden Celsius in een orbitale shaker incubator bij 175 RPM. Centrifugeer één milliliter cultuur gedurende twee minuten bij 500 x g en was de gist vervolgens drie keer met één milliliter steriel DPBS. Resuspendeer de pellet in één milliliter steriel DPBS en verdun de cultuur op 1 tot 100.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en pas dienovereenkomstig de celdichtheid aan. Maak vervolgens het entmateriaal voor injectie door gelijke volumes van de gerefereerde en experimentele stam te mengen. Breng met behulp van een wattenstaafje met een vrij verkrijgbare ontharingscrème royaal aan op het binnen- en buitenoppervlak van beide oren van een verdoofd dier.

Veeg na twee tot drie minuten het oor voorzichtig af met een droog gaasje gevolgd door gaasjes verzadigd met steriel water om ontharingsresten grondig te verwijderen. Nadat u het oppervlak van de oren met 70% ethanol hebt gesteriliseerd, mengt u het entmateriaal goed door de injectieflacon meerdere keren om te keren of te vortexen. Zuig 20 tot 30 microliter entmateriaal in een insulinespuit.

Houd de naald rechtop en tik zachtjes op de spuit om ervoor te zorgen dat er lucht in de loop aan de bovenkant zit. Werp voorzichtig lucht en overtollig entmateriaal terug in de entafleider of een afvalbuis, zodat de zuiger zich op de 10 microliter-markering bevindt. Breng over de toonbank dubbelzijdige huidtape aan op een kleine conische of ronde bodem plastic buis en drapeer het oor over de tape, vermijd het ontwrichten van de anesthesieneuskegel.

Houd de naald van de spuit bijna evenwijdig aan de huid en vermijd grote aderen, steek de punt van de naald in de buitenste laag van de huid totdat de schuine kant net bedekt is en injecteer het entmateriaal langzaam intradermaal. Een goede intradermale injectie zal een kleine bubbel in de huid verhogen. Houd de naald 15 tot 20 seconden op zijn plaats voordat u deze uit het oor verwijdert om lekkage te minimaliseren.

Volg institutionele protocollen en markeer de kooi met biohazard-labels die aangeven dat dieren in de kooi zijn geïnfecteerd met Candida albicans. Met behulp van dezelfde gewassen culturen die werden gebruikt om het entmateriaal te bereiden, creëert u een verdunning van 1 tot 50 cellen in RPMI 1640, aangevuld met 10% warmte en geactiveerd foetaal runderserum en incubeert u bij 37 graden Celsius met tuimelen gedurende vier uur. Onderzoek het monster met een microscoop.

Tel ten minste 100 cellen en noteer het aantal gist- en filamenteuze cellen voor elke stam. Draai het lange werkafstandsobjectief op zijn plaats en plaats een druppel onderdompelingsvloeistof op de lens. Laat de lens zakken om mogelijke schade te voorkomen bij het plaatsen van de afdeksel.

Plaats nummer 1.5 cover slip over de podiumopening en plak deze op zijn plaats. Verhoog het objectief zodat de dompelvloeistof in contact komt met zowel de objectieflens als de cover slip. Beveilig een anesthesieneuskegel op het microscoopstadium op zo'n manier dat deze de neus van het dier volledig bedekt wanneer deze in positie is voor beeldvorming.

Plaats de neus van een verdoofde muis in de neuskegel. Plaats een druppel steriel water op de afdekslip boven de objectieflens. Pas de anesthesieneuskegel aan en plaats de muis zo dat het oor van de muis zich boven de waterdruppel bevindt.

Neem nog een hoeslip en plaats de rand van de cover slip parallel aan het lichaam van de muis, waarbij de rand de muis raakt waar het oor het hoofd ontmoet. Laat met behulp van een scharnierbeweging de vrije rand van de afdekslip naar de microscoopfase zakken. Als de cover slip tegen de microscoopfase komt, zal het oor worden afgevlakt.

Plak de bovenste hoes goed vast om net genoeg druk vast te houden om het oor plat te houden en te voorkomen dat het haar of de snorharen van de muis in de tape worden gevangen. Tenzij een microscoop met een omgevingskamer wordt gebruikt, bedek het lichaam van de muis losjes met een steriel gordijn om een normale thermische omgeving te behouden. Met behulp van wit licht, widefield imaging, pas het focusvlak aan in het oorweefsel en focus op de rode bloedcellen die in de bloedvaten bewegen.

Om een signaal-ruisverhouding te verkrijgen die sterk genoeg is, zodat de morfologie voor alle cellen in het gezichtsveld kan worden bepaald, past u het laservermogen of de beeldsnelheid aan. Om weefselschade te voorkomen, gebruikt u het laagst mogelijke laservermogen. Kies een gezichtsveld met duidelijke filamentvorming in de gerefereerde stam en waar de meeste organismen voldoende verspreid zijn om hun morfologie te bepalen.

Stel de bovenste en onderste scherpstelvlakken in voor een Z-stack. Het is niet nodig om de volledige diepte van het geïnfecteerde gebied te bedekken, maar houd er rekening mee dat organismen aan de boven- of onderkant van het afgebeelde volume meestal worden uitgesloten van de analyse. Verkrijg Z-stack-afbeeldingen, pseudokleur elk kanaal om elke stam te onderscheiden en overlay de kanalen.

Sla de afbeeldingen op. Gebruik beeldbewerkingssoftware om een maximale projectie van de Z-stack uit te voeren in een tweedimensionaal beeld. Tel elk organisme dat in de maximale projectiebeelden wordt gezien per stamtype en morfologie.

De gerefereerde stam vormt in vitro snel filamenten. Terwijl de EFG1 Null er niet in slaagde de filamenten te vormen. De EFG1 Null vertoont ook in vivo een significant filamentatiedefect.

Ongeveer 9% van de EFG1 Null-cellen groeide in vivo als filamenten. Evenzo vertoonde de CYR1 Null-mutante stam een filamentatiedefect in vitro in vergelijking met de verwezen stam. Daarentegen groeide 53% van de CYR1 Null-mutantcellen in vivo als filamenten.

De filamenten gevormd door de CYR1 Null-mutant waren korter dan de referentiestam. Het is van cruciaal belang om de naald parallel aan de huid te houden tijdens de inenting. Het doel is om het entmateriaal net onder de buitenste laag van de huid te plaatsen.

Deze techniek kan ook worden gebruikt met muizenstammen die een fluorescerend eiwit tot expressie brengen in gastheercellen van belang, waardoor we gastheerpathogeeninteracties in vivo kunnen bestuderen.