Mechanostimulatie van meercellige organismen via een microfluïdisch compressiesysteem met hoge doorvoer
23 december 2022
Het huidige protocol beschrijft het ontwerp, de fabricage en de karakterisering van een microfluïdisch systeem dat in staat is om honderden Drosophila melanogaster-embryo's uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig te comprimeren met minimale tussenkomst van de gebruiker. Dit systeem maakt beeldvorming met hoge resolutie en herstel van monsters mogelijk voor poststimulatieanalyse en kan worden geschaald om plaats te bieden aan andere meercellige biologische systemen.
Dit protocol legt uit hoe microfluïdica-technologieën kunnen worden gefabriceerd en gebruikt om de experimentele voordelen te benutten in monsterdoorvoer, geautomatiseerde verwerking en de mogelijkheid om nauwkeurig mechanische stress toe te passen en tegelijkertijd monsters te visualiseren. Deze techniek minimaliseert de handmatige hantering van meercellige biologische organismen, zoals embryo's en organoïden, voor hun immobilisatie, uitlijning en live beeldvorming. Het maakt ook de toepassing van mechanische compressie op hen mogelijk voor mechanobiologische studies.
Fabricage van mallen met hoge beeldverhoudingskenmerken voor deze microfluïdische chip kan een uitdaging zijn met conventionele microfabricagetechnieken. De tips die in dit videoartikel worden uitgelegd, kunnen deze uitdagingen overwinnen. Reinig om te beginnen de siliciumwafer eerst met aceton en vervolgens met isopropylalcohol.
Plaats de siliciumwafer gedurende 30 minuten op een hete plaat van 250 graden Celsius. voor uitdroging bakken. Bekleed de siliciumwafer met hexamethyldisiloxaan in een dampprime-oven.
Plaats een fles SU-8 2100 Photoresist gedurende 15 minuten in een oven van 60 graden Celsius om de viscositeit te verminderen. Giet een milliliter van de verwarmde Photoresist voor elke centimeter van de siliciumwafer die op de hete plaat wordt geplaatst totdat de Photoresist het grootste deel van het oppervlak bedekt. Pas pre-spin eerst toe bij 250 rotaties per minuut gedurende 30 seconden en vervolgens bij 350 rotaties per minuut gedurende nog eens 30 seconden, beide met 100 RPM per seconde versnelling.
Pas vervolgens eerst een draai toe bij 500 rotaties per minuut gedurende 15 seconden met 100 RPM per seconde versnelling, en vervolgens bij 1,450 rotaties per minuut gedurende 30 seconden met 300 RPM per seconde versnelling. Verwijder de randkraal met een cleanroom swab en spuit aceton op de wafer om onvolkomenheden te verwijderen en een uniforme coating te bevorderen. Stel de siliconen wafer bloot aan 350 millijul per centimeter vierkant UV-licht door het fotomasker.
Gebruik de aligner van het contactmasker om na blootstelling baksel aan te brengen op de siliciumwafer en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Plaats het bekerglas in een ander groter bekerglas en vul het grotere bekerglas met een nieuwe ontwikkelaarsoplossing. Plaats een metalen gaas op het bekerglas.
Plaats de siliconen wafer ondersteboven op het metalen gaas. Laat de siliciumwafer 30 minuten ondergedompeld in de ontwikkelaar met de roerder ingeschakeld. Breng de siliciumwafer over in een ultrasone badsonicator gevuld met de verse ontwikkelaar gedurende een uur bij 40 kilohertz.
Haal vervolgens de wafel uit het bekerglas en was deze met een nieuwe ontwikkelaarsoplossing. Bereid de voorgeharde PDMS-oplossing door de PDMS-basis te mengen met het uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op één. Ontgas het mengsel door het in een centrifuge van 500 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te plaatsen.
Giet het voorgeharde PDMS op een siliciumwafer en ontgas het opnieuw. Plaats ten slotte het niet-uitgeharde PDMS in een oven van 60 graden Celsius om uit te harden. Gebruik een scalpel om de randen van het uitgeharde PDMS-gebied te snijden dat overeenkomt met de microfluïdische chipgeometrie.
Pons de inlaat- en uitlaatgaten op PDMS met behulp van een biopsiepons of een naald met een stompe punt. Plaats het PDMS op de glasplaat met het patroonoppervlak naar de glasschuif gericht na plasmabehandeling om de microkanalen af te dichten via covalente binding. Laat Oregon-R volwassen vliegen eieren leggen op appelsap agarplaten en verzamel de platen op de gewenste ontwikkelingstijd na het leggen van eieren voor het gegeven experiment.
Overspoel de agar met embryo-eiwas en roer de embryo's voorzichtig met een verfkwast om ze van de agar los te maken. Breng de embryo's gedurende 90 seconden over naar een 50% bleekoplossing, af en toe roerend. Zeef de embryo's door een weefselzeef en spoel de bleekoplossing grondig weg met water.
Breng de embryo's over naar een glazen petrischaaltje van 90 millimeter met voldoende embryo-eiwassing om de embryo's volledig te bedekken. Onderzoek de embryo's met transilluminatie op een ontleedmicroscoop en selecteer embryo's van het gewenste ontwikkelingsstadium om in het microfluïdische apparaat te laden. Primeer alle zeven embryo-microkanalen door ze te vullen met 0,4 micrometer gefilterde IPA door de belangrijkste embryo-inlaatpoort.
Vervang de IPA door 0,4 micrometer gefilterd gedeïoniseerd water. Vervang vervolgens het DI-water door embryo-ei-wasoplossing. Verzamel ongeveer 100 vooraf geselecteerde embryo's uit de glazen petrischaal met behulp van een glazen pipet.
Pipetteer vervolgens de embryo's in de embryo-inlaatpoort en oefen ongeveer drie PSI-negatieve druk uit op de gasinlaat met behulp van een draagbare vacuümpomp om de embryomicrokanalen te openen. Kantel vervolgens de microfluïdische chip naar beneden zodat de embryo's automatisch kunnen uitlijnen en zich in de microkanalen van het embryo kunnen nestelen. Als de embryo-microkanaalinlaten verstopt raken door meerdere embryo's die tegelijkertijd binnenkomen, kantelt u de microfluïdische chip naar boven en vervolgens weer naar beneden om de verstopping op te ruimen.
Breng op basis van de vereiste doorvoer maar liefst 300 embryo's in de embryomicrokanalen. Zodra de embryolading is voltooid, verwijdert u het vacuüm om de embryo's te immobiliseren. Kantel vervolgens de microfluïde chip terug naar de horizontale positie.
Sluit een draagbare positieve drukbron met een manometer aan op de gasinlaat om drie PSI-compressie toe te passen. Als live beeldvormingsexperimenten worden uitgevoerd op de mechanisch gestimuleerde embryo's, plaatst u de microfluïdische chip op een standaard microscooptrap glazen diahouder met de gasinlaat aangesloten op de drukbron. Onderzoek de embryo's onder een fluorescerende microscoop in de microfluïdische kanalen.
Zodra het compressie-experiment is voltooid, kunnen de embryo's worden verzameld voor downstream-analyse. Om dit te doen, breng eerst het vacuüm aan op de gasinlaat om de embryo's te bevrijden. Kantel vervolgens de microfluïdische chip naar boven zodat de embryo's naar beneden kunnen bewegen in de richting van de embryo-introductiepoort.
Verzamel de embryo's van de microfluïdische chip met behulp van een glazen pipet. De functionaliteit van het microfluïdische apparaat werd experimenteel bepaald door Drosophila-embryo's in de compressiekanalen te laden en positieve druk uit te oefenen op de gaskanalen. De embryo's ervaren geen significante compressie onder vacuüm of in neutrale druktoestanden.
Ze worden samengedrukt wanneer positieve druk wordt uitgeoefend. Metingen van de afnemende breedte van de embryo's onder een microscoop laten zien hoe gasdruk kan worden gebruikt om een doelcompressieniveau te verkrijgen. Microfluïdische apparaten die op deze manier zijn gemaakt, maken chemische stimulatie van geïmmobiliseerde monsters mogelijk.
De stimulatie maakt een hoge spatiotemporale beeldvorming mogelijk. Een fundamentele vraag in de ontwikkelingsbiologie is hoe mechanische krachten eiwit- en genexpressie tijdens de ontwikkeling reguleren? Deze technologie stelt ons in staat om mechanische stimulatie toe te passen op een groot aantal embryo's tegelijk, zodat we voldoende hoeveelheden eiwit en RNA kunnen isoleren om vergelijkende proteomics of transcriptomics-experimenten uit te voeren.
Hierdoor kunnen onderzoekers meer te weten komen over de eiwitten en genen die gevoelig zijn voor mechanische krachten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het ontwerp en het gebruik van een microfluïdisch systeem voor het uitlijnen en immobiliseren van Drosophila melanogaster embryo's. Het maakt beelden met een hoge resolutie en het terugwinnen van monsters mogelijk, terwijl handmatige handelingen tot een minimum worden beperkt.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Mechanobiologie
- Embryo-imaging
Achtergrond
- Microfluidische technologieën verbeteren de doorvoer van monsters en de geautomatiseerde verwerking.
- Precieze toepassing van mechanische spanning is cruciaal voor mechanobiologische studies.
- Conventionele microfabricagetechnieken kunnen uitdagend zijn voor structuren met een hoge aspectratio.
- Dit protocol biedt tips om deze uitdagingen te overwinnen.
Doel van de studie
- Om een microfluidisch systeem te vervaardigen voor de immobilisatie en uitlijning van embryo's.
- Om live-imaging van meercellige organismen mogelijk te maken.
- Om mechanische compressie toe te passen voor mechanobiologische analyse.
Gebruikte methoden
- Het reinigen van siliciumwafers met aceton en isopropylalcohol.
- Fabricage van mallen voor microfluïdische chips.
- Uitlijning en immobilisatie van embryo's.
- Hoge-resolutie beeldvorming tijdens het aanbrengen van mechanische stress.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle uitlijning en immobilisatie van honderden embryo's.
- Aantoonbare mogelijkheden voor beeldvorming met een hoge resolutie.
- Effectieve toepassing van mechanische compressie voor analyse.
- Bevestigde schaalbaarheid naar andere multicellular biologische systemen.
Conclusies
- Het microfluidische systeem vermindert de handmatige handelingen aanzienlijk.
- Het verbetert de mogelijkheid om de mechanobiologie in embryo's te bestuderen.
- Deze benadering kan worden aangepast voor diverse meercellige organismen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Microfluïdische compressiesystemen met een hoge doorvoersnelheid maken schaalbare mechanostimulatie van multicellularen organismen mogelijk, waarmee een kritieke bottleneck in het onderzoek naar mechanobiologie en ontwikkelingsbiologie wordt weggenomen. Deze technologie vergroot de voorspellende betrouwbaarheid van studies naar gen- en eiwitexpressie door nauwkeurige, geparalleliseerde mechanische perturbatie en kwantitatieve analyse mogelijk te maken. De integratie ervan ondersteunt een robuuste targetvalidatie en risicoreductie bij vroege ontdekkingsfasen en preklinische kantelpunten in biofarmaceutische pijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt systematische ondervraging van mechanosensitieve routes in modellen van hele organismen mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door mechanische stimuli te correleren met veranderingen in gen- en eiwitexpressie.
- Vergemakkelijkt de voorspellende betrouwbaarheid van mechanistische hypothesen door middel van high-throughput, kwantitatieve resultaten.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, geïmmobiliseerde biologische systemen voor op downstream screening-workflows.
- Standardiseert protocollen voor mechanische stimulatie om reproduceerbaarheid en kwantitatieve vergelijkbaarheid te waarborgen.
- Maakt schaalbare monstervoorbereiding mogelijk voor de ontwikkeling van omics-gebaseerde assays en de evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt de resultaten van mechanostimulatie uit met gen- en eiwitexpressieprofielen die relevant zijn voor de ziekte.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door grootschalige, parallelle monsteranalyse mogelijk te maken.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor de identificatie van translationele biomarkers in multicellular systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit microfluïdische compressiesysteem is geschikt voor alle fasen, van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, en maakt het mogelijk om hypothesen te testen, signaalpaden te verduidelijken en monsters met een hoge doorvoer voor te bereiden voor omics-analyses.
- Discovery Biology: Faciliteert het testen van nulhypothesen door gecontroleerde mechanische perturbatie en kwantitatieve read-outs mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, schaalbare monsterimmobilisatie en stimulatie voor assay-gereedheid.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van de mechanische respons, ter ondersteuning van comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen de discovery- en preklinische fasen door grootschalige, mechanistisch onderbouwde biomarkerstudies te ondersteunen.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een herbruikbaar, aanpasbaar platform voor diverse multicellulaire modelsystemen en experimentele ontwerpen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert en automatiseert de monsterverwerking, waardoor de reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door de generatie van robuuste, kwantitatieve mechanobiologische data te ondersteunen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van mechanistisch gevalideerde targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de fabricage van microfluïdica en het experimenteel ontwerp voor mechanobiologie.
- Toegang tot hoge-resolutie beeldvorming en drukgestuurde microfluïdische instrumentatie is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de workflows van monstervoorbereiding en data-analyse.
- De aanpasbare geometrie maakt gebruik mogelijk in diverse multicellulaire modelsystemen.
- De monsterdoorvoer en schaalbaarheid van het apparaat worden beperkt door de infrastructuur voor fabricage en handling.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Preparation of the Silicon Wafer Mold
3:31
Fabrication of the Microfluidic Chip
4:39
Preparation of the Fruit Fly Embryos
5:47
Applying Mechanical Stimulation to Fruit Fly Embryos Using the Microfluidic Chip
8:19
Results: Experimental Measurement of Embryo Compression Level
8:58
Conclusion
