Mechanostimulatie van meercellige organismen via een microfluïdisch compressiesysteem met hoge doorvoer
December 23rd, 2022
Het huidige protocol beschrijft het ontwerp, de fabricage en de karakterisering van een microfluïdisch systeem dat in staat is om honderden Drosophila melanogaster-embryo's uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig te comprimeren met minimale tussenkomst van de gebruiker. Dit systeem maakt beeldvorming met hoge resolutie en herstel van monsters mogelijk voor poststimulatieanalyse en kan worden geschaald om plaats te bieden aan andere meercellige biologische systemen.
Dit protocol legt uit hoe microfluïdica-technologieën kunnen worden gefabriceerd en gebruikt om de experimentele voordelen te benutten in monsterdoorvoer, geautomatiseerde verwerking en de mogelijkheid om nauwkeurig mechanische stress toe te passen en tegelijkertijd monsters te visualiseren. Deze techniek minimaliseert de handmatige hantering van meercellige biologische organismen, zoals embryo's en organoïden, voor hun immobilisatie, uitlijning en live beeldvorming. Het maakt ook de toepassing van mechanische compressie op hen mogelijk voor mechanobiologische studies.
Fabricage van mallen met hoge beeldverhoudingskenmerken voor deze microfluïdische chip kan een uitdaging zijn met conventionele microfabricagetechnieken. De tips die in dit videoartikel worden uitgelegd, kunnen deze uitdagingen overwinnen. Reinig om te beginnen de siliciumwafer eerst met aceton en vervolgens met isopropylalcohol.
Plaats de siliciumwafer gedurende 30 minuten op een hete plaat van 250 graden Celsius. voor uitdroging bakken. Bekleed de siliciumwafer met hexamethyldisiloxaan in een dampprime-oven.
Plaats een fles SU-8 2100 Photoresist gedurende 15 minuten in een oven van 60 graden Celsius om de viscositeit te verminderen. Giet een milliliter van de verwarmde Photoresist voor elke centimeter van de siliciumwafer die op de hete plaat wordt geplaatst totdat de Photoresist het grootste deel van het oppervlak bedekt. Pas pre-spin eerst toe bij 250 rotaties per minuut gedurende 30 seconden en vervolgens bij 350 rotaties per minuut gedurende nog eens 30 seconden, beide met 100 RPM per seconde versnelling.
Pas vervolgens eerst een draai toe bij 500 rotaties per minuut gedurende 15 seconden met 100 RPM per seconde versnelling, en vervolgens bij 1,450 rotaties per minuut gedurende 30 seconden met 300 RPM per seconde versnelling. Verwijder de randkraal met een cleanroom swab en spuit aceton op de wafer om onvolkomenheden te verwijderen en een uniforme coating te bevorderen. Stel de siliconen wafer bloot aan 350 millijul per centimeter vierkant UV-licht door het fotomasker.
Gebruik de aligner van het contactmasker om na blootstelling baksel aan te brengen op de siliciumwafer en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Plaats het bekerglas in een ander groter bekerglas en vul het grotere bekerglas met een nieuwe ontwikkelaarsoplossing. Plaats een metalen gaas op het bekerglas.
Plaats de siliconen wafer ondersteboven op het metalen gaas. Laat de siliciumwafer 30 minuten ondergedompeld in de ontwikkelaar met de roerder ingeschakeld. Breng de siliciumwafer over in een ultrasone badsonicator gevuld met de verse ontwikkelaar gedurende een uur bij 40 kilohertz.
Haal vervolgens de wafel uit het bekerglas en was deze met een nieuwe ontwikkelaarsoplossing. Bereid de voorgeharde PDMS-oplossing door de PDMS-basis te mengen met het uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op één. Ontgas het mengsel door het in een centrifuge van 500 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te plaatsen.
Giet het voorgeharde PDMS op een siliciumwafer en ontgas het opnieuw. Plaats ten slotte het niet-uitgeharde PDMS in een oven van 60 graden Celsius om uit te harden. Gebruik een scalpel om de randen van het uitgeharde PDMS-gebied te snijden dat overeenkomt met de microfluïdische chipgeometrie.
Pons de inlaat- en uitlaatgaten op PDMS met behulp van een biopsiepons of een naald met een stompe punt. Plaats het PDMS op de glasplaat met het patroonoppervlak naar de glasschuif gericht na plasmabehandeling om de microkanalen af te dichten via covalente binding. Laat Oregon-R volwassen vliegen eieren leggen op appelsap agarplaten en verzamel de platen op de gewenste ontwikkelingstijd na het leggen van eieren voor het gegeven experiment.
Overspoel de agar met embryo-eiwas en roer de embryo's voorzichtig met een verfkwast om ze van de agar los te maken. Breng de embryo's gedurende 90 seconden over naar een 50% bleekoplossing, af en toe roerend. Zeef de embryo's door een weefselzeef en spoel de bleekoplossing grondig weg met water.
Breng de embryo's over naar een glazen petrischaaltje van 90 millimeter met voldoende embryo-eiwassing om de embryo's volledig te bedekken. Onderzoek de embryo's met transilluminatie op een ontleedmicroscoop en selecteer embryo's van het gewenste ontwikkelingsstadium om in het microfluïdische apparaat te laden. Primeer alle zeven embryo-microkanalen door ze te vullen met 0,4 micrometer gefilterde IPA door de belangrijkste embryo-inlaatpoort.
Vervang de IPA door 0,4 micrometer gefilterd gedeïoniseerd water. Vervang vervolgens het DI-water door embryo-ei-wasoplossing. Verzamel ongeveer 100 vooraf geselecteerde embryo's uit de glazen petrischaal met behulp van een glazen pipet.
Pipetteer vervolgens de embryo's in de embryo-inlaatpoort en oefen ongeveer drie PSI-negatieve druk uit op de gasinlaat met behulp van een draagbare vacuümpomp om de embryomicrokanalen te openen. Kantel vervolgens de microfluïdische chip naar beneden zodat de embryo's automatisch kunnen uitlijnen en zich in de microkanalen van het embryo kunnen nestelen. Als de embryo-microkanaalinlaten verstopt raken door meerdere embryo's die tegelijkertijd binnenkomen, kantelt u de microfluïdische chip naar boven en vervolgens weer naar beneden om de verstopping op te ruimen.
Breng op basis van de vereiste doorvoer maar liefst 300 embryo's in de embryomicrokanalen. Zodra de embryolading is voltooid, verwijdert u het vacuüm om de embryo's te immobiliseren. Kantel vervolgens de microfluïde chip terug naar de horizontale positie.
Sluit een draagbare positieve drukbron met een manometer aan op de gasinlaat om drie PSI-compressie toe te passen. Als live beeldvormingsexperimenten worden uitgevoerd op de mechanisch gestimuleerde embryo's, plaatst u de microfluïdische chip op een standaard microscooptrap glazen diahouder met de gasinlaat aangesloten op de drukbron. Onderzoek de embryo's onder een fluorescerende microscoop in de microfluïdische kanalen.
Zodra het compressie-experiment is voltooid, kunnen de embryo's worden verzameld voor downstream-analyse. Om dit te doen, breng eerst het vacuüm aan op de gasinlaat om de embryo's te bevrijden. Kantel vervolgens de microfluïdische chip naar boven zodat de embryo's naar beneden kunnen bewegen in de richting van de embryo-introductiepoort.
Verzamel de embryo's van de microfluïdische chip met behulp van een glazen pipet. De functionaliteit van het microfluïdische apparaat werd experimenteel bepaald door Drosophila-embryo's in de compressiekanalen te laden en positieve druk uit te oefenen op de gaskanalen. De embryo's ervaren geen significante compressie onder vacuüm of in neutrale druktoestanden.
Ze worden samengedrukt wanneer positieve druk wordt uitgeoefend. Metingen van de afnemende breedte van de embryo's onder een microscoop laten zien hoe gasdruk kan worden gebruikt om een doelcompressieniveau te verkrijgen. Microfluïdische apparaten die op deze manier zijn gemaakt, maken chemische stimulatie van geïmmobiliseerde monsters mogelijk.
De stimulatie maakt een hoge spatiotemporale beeldvorming mogelijk. Een fundamentele vraag in de ontwikkelingsbiologie is hoe mechanische krachten eiwit- en genexpressie tijdens de ontwikkeling reguleren? Deze technologie stelt ons in staat om mechanische stimulatie toe te passen op een groot aantal embryo's tegelijk, zodat we voldoende hoeveelheden eiwit en RNA kunnen isoleren om vergelijkende proteomics of transcriptomics-experimenten uit te voeren.
Hierdoor kunnen onderzoekers meer te weten komen over de eiwitten en genen die gevoelig zijn voor mechanische krachten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol legt het ontwerp en gebruik uit van een microfluïdisch systeem voor het uitlijnen en immobiliseren van Drosophila melanogaster embryo's. Het maakt hoge resolutie beeldvorming en monsterherstel mogelijk terwijl het manuele behandeling minimaliseert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluïdica
- Mechanobiologie
- Embryo beeldvorming
Achtergrond
- Microfluïdica technologieën verbeteren de monsterdoorvoer en geautomatiseerde behandeling.
- Precieze mechanische stresstoepassing is cruciaal voor mechanobiologie studies.
- Conventionele microfabricagetechnieken kunnen uitdagend zijn voor functies met een hoge aspectverhouding.
- Dit protocol biedt tips om deze uitdagingen te overwinnen.
Doel van de studie
- Om een microfluïdisch systeem te fabriceren voor embryo immobilisatie en uitlijning.
- Om live beeldvorming van meercellige organismen mogelijk te maken.
- Om mechanische compressie toe te passen voor mechanobiologische analyse.
Gebruikte methoden
- Reiniging van siliconenwafels met aceton en isopropylalcohol.
- Fabricage van mallen voor microfluïdische chips.
- Uitlijning en immobilisatie van embryo's.
- Hoge resolutie beeldvorming tijdens mechanische stresstoepassing.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle uitlijning en immobilisatie van honderden embryo's.
- Hoge resolutie beeldvormingscapaciteiten gedemonstreerd.
- Effectieve toepassing van mechanische compressie voor analyse.
- Schaalbaarheid naar andere meercellige biologische systemen bevestigd.
Conclusies
- Het microfluïdische systeem vermindert manuele behandeling aanzienlijk.
- Het verbetert de mogelijkheid om mechanobiologie in embryo's te bestuderen.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor verschillende meercellige organismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic compression systems enable scalable mechanostimulation of multicellular organisms, addressing a critical bottleneck in mechanobiology and developmental biology research. This technology enhances predictive confidence in gene and protein expression studies by allowing precise, parallelized mechanical perturbation and quantitative analysis. Its integration supports robust target validation and de-risking at early discovery and preclinical inflection points in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of mechanosensitive pathways in whole-organism models.
- Supports functional target validation by correlating mechanical stimuli with gene and protein expression changes.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses through high-throughput, quantitative outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, immobilized biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes mechanical stimulation protocols to ensure reproducibility and quantitative comparability.
- Enables scalable sample processing for omics-based assay development and compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanostimulation outputs with disease-relevant gene and protein expression profiles.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale, parallel sample analysis.
- Provides mechanistic de-risking for translational biomarker identification in multicellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic compression system fits from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and high-throughput sample preparation for omics analyses.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by enabling controlled mechanical perturbation and quantitative readouts.
- Screening: Delivers reproducible, scalable sample immobilization and stimulation for assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mechanical response, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by supporting large-scale, mechanistically informed biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse multicellular model systems and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and automates sample handling, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by supporting robust, quantitative mechanobiology data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanistically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics fabrication and mechanobiology experimental design.
- Needs access to high-resolution imaging and pressure-controlled microfluidic instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis workflows.
- Adaptable geometry allows use across various multicellular model systems.
- Sample throughput and device scalability are limited by fabrication and handling infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Preparation of the Silicon Wafer Mold
3:31
Fabrication of the Microfluidic Chip
4:39
Preparation of the Fruit Fly Embryos
5:47
Applying Mechanical Stimulation to Fruit Fly Embryos Using the Microfluidic Chip
8:19
Results: Experimental Measurement of Embryo Compression Level
8:58
Conclusion
