Name: Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Leer een protocol voor het isoleren van niet-cardiomyocyten uit post-MI muizenharten voor single-cell RNA-sequencing. Deze methode biedt hoge celviabiliteit tegen lage kosten en ondersteunt onderzoek naar cardiovasculaire pathofysiologie en immuuncelbetrokkenheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Funds van de provincie Zhejiang (LQ22H020010).

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren aan de Zhejiang University en werden goedgekeurd door de Animal Advisory Committee aan de Zhejiang University.
1. Linker anterieure dalende coronaire ligatie (LAD ligatie) operatie
OPMERKING: Acht weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen werden als modellen gebruikt. De harten werden geoogst 2 weken na MI. Linker anterieure dalende kransslagaderligatiechirurgie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven en aangetoond11.
<ol><li>Desinfecteer de chirurgische instrumenten vóór de operatie met 70% ethanol.</li>
	<li>Weeg de muis en verdoof de muis vervolgens met intraperitoneale injecties van 1% pentobarbitalnatrium (50 mg / kg). Observeer de teen-knijpreflex en meet de ademhalingsfrequentie om de diepte van de anesthesie tijdens de procedure te evalueren.</li>
	<li>Plaats de muis op de operatietafel met een verwarmingskussen van 37 °C. Gebruik oogheelkundige zalf om uitdroging van de ogen te voorkomen.</li>
	<li>Ontharing van de linker precordiale borst en nek met ontharingscrème en gebruik wattenstaafjes om haren te verwijderen. Desinfecteer de huid met jodophor, gevolgd door 70% alcohol om het gebied drie keer schoon te maken.</li>
	<li>Voer een middellijn cervicale incisie (0,8-1,0 cm) uit onder een microscoop. Scheid de huid, spieren en weefsel rond de luchtpijp en breng vervolgens een canule van 20 G in de luchtpijp in. OPMERKING: Observeer tijdens het inbrengen van de canule in de luchtpijp onder microscopisch zicht om ervoor te zorgen dat de buis niet in de slokdarm wordt ingebracht.</li>
	<li>Sluit de muis aan op een knaagdierventilator die is ingesteld op 0,2 ml getijdenvolume met 150 slagen per minuut.</li>
	<li>Snijd de muizenborst schuin langs de midclaviculaire lijn met een steriele schaar. Ontleed het onderhuidse weefsel om de ribben bloot te leggen.</li>
	<li>Gebruik een steriele schaar om de huid schuin langs de linker midden-claviculaire lijn (0,8-1,0 cm) te knippen. Voer linker thoracotomie uit om de derde en vierde ribben te scheiden om het hart bloot te leggen. Gebruik een rib retractor voor een duidelijk zicht.</li>
	<li>Open het hartzakje met een gebogen tang en laat vervolgens de linker voorste dalende slagader (onder het linker atriumaanhangsel) los met behulp van een 7-0 zijden hechtdraad. Een bleke voorste wand van de linker ventrikel geeft aan dat de myocardiale perfusie met succes wordt onderbroken.</li>
	<li>Laat het ribretractor los en hecht de thoracale incisie in lagen met een 5-0 zijden hechtdraad terwijl de lucht uit de borst wordt verdreven. Hecht de nekincisie met een 5-0 hechtdraad zijden hechtdraad.</li>
	<li>Verwijder de tracheale buis van de muis zodra de spontane ademhaling is hersteld. Injecteer intraperitoneaal 0,5 ml voorverwarmde steriele zoutoplossing. Injecteer buprenorfine (0,1 mg/kg) elke 12 uur subcutaan om pijn te minimaliseren.</li>
	<li>Plaats ten slotte de muis op het verwarmingskussen om te wachten op reanimatie. Controleer de muis om ervoor te zorgen dat deze niet lijdt aan overmatige dyspneu of bloedingen via visuele observatie.</li>
	<li>Breng de muis terug naar zijn kooi nadat hij wakker is geworden. Controleer de muis de eerste week dagelijks om te controleren of de mobiliteit, verzorging en eetgewoonten voldoende zijn. Volgens de behoeften van het experiment, oogst het hart op verschillende tijdstippen na MI. OPMERKING: In dit protocol werd de eencellige suspensie 2 weken na MI met het hart bereid.</li>
</ol>2. Voorbereiding van de cardiale eencellige suspensie
<ol><li>Voorbereiding van de oplossingen en media<ol><li>Cardiale weefseldissociatiebuffer: Meng 10 mg collagenase IV (600 U / ml), 5 mg dispase II (0, 5 U / ml) en 50 μl DNase I (100 μg / ml) in 5 ml RPMI 1640. Verwarm dit medium voor gebruik voor gebruik voor op 37 °C in een waterbad.</li>
		<li>Celwasbuffer: Bereid 1% BSA of 10% FBS in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, PH 7.4) en bewaar bij 4 °C of op ijs.</li>
		<li>Perfusieoplossing: Voorkoel PBS (PH 7.4) als perfusieoplossing.</li>
		<li>Rode bloedcel (RBC) lysis buffer: Gebruik de RBC lysis buffer zoals vermeld door de fabrikant. OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor de lijst van reagentia en apparatuur die in dit onderzoek worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Euthanaseer de muis door een intraperitoneale pentobarbital natrium (150 mg / kg) injectie.</li>
	<li>Hartdissectie<ol><li>Plaats de muis in rugligging door de achterpoten op hun plaats te bevestigen met plakband.</li>
		<li>Spray het lichaam met 70% ethanol en snijd vervolgens verticaal door de buikhuid en spieren terwijl u vermijdt de lever te doorboren. Open voorzichtig de thorax en vermijd het doorboren van het hart.</li>
		<li>Gebruik de voorgekoelde PBS (PH 7.4) om de linker ventrikel te perfuseren totdat de kleurloze perfusievloeistof wordt waargenomen (ongeveer 15 ml PBS [pH 7.4] is nodig).</li>
		<li>Til het hart voorzichtig op van de thorax met een tang en knip het overtollige weefsel weg dat aan de buitenkant van het hart is bevestigd met een oogheelkundige schaar. Plaats het hart in 1 ml voorgekoelde PBS (PH 7,4) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Enzymatische dissociatie van het hartweefsel<ol><li>Breng het muizenhart over in een put van een 24-putplaat met 150 μL van de hartweefseldissociatiebuffer op ijs en snijd het in kleine stukjes (~ 1 mm) met een schaar.</li>
		<li>Breng het gehakte hartweefsel over in een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml van de weefseldissociatiebuffer. OPMERKING: Het aanbevolen buffervolume voor dissociatie van hartweefsel is 5 ml / hart.</li>
		<li>Plaats de centrifugebuis gedurende 1 uur bij 37 °C in de elektrisch thermostatische zuigerschudder bij 125 tpm. Pipetteer de weefselsuspensie 10 keer per 20 min op en neer.</li>
		<li>Filter de celsuspensie door een 70 μm celzeef om onverteerd weefsel en klonten te verwijderen. Voeg 25 ml van de celwasbuffer toe om de originele buis te spoelen en breng deze vervolgens over om de celzeef te spoelen. Filter vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 40 μm om celklonten verder te verwijderen.</li>
		<li>Centrifugeer de gefilterde celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie het celmonster vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) in 1x RBC-lysisbuffer.</li>
		<li>Voeg vier keer meer volume van de celwasbuffer toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C op 300 x g .</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 10 ml van de celwasbuffer. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 1 ml van de celwasbuffer.</li>
		<li>Meng 18 μL van de celsuspensie met 2 μL van acridine sinaasappel (AO)/propidium jodide (PI) kleuringsoplossing (9:1) en voeg 10 μL van het mengsel toe aan een telkamerschuif. Evalueer de celaantallen en levensvatbaarheid met behulp van een automatische celteller.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727(2021).</li>
<li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+in+myocardial+injury%2C+repair%2C+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li>
<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+Inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
<li>Tzahor, E., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coalition+to+heal-the+impact+of+the+cardiac+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment.</a> Science. 377 (6610), 4443(2022).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167(2018).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752(2022).</li>
<li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681(2021).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li>
<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li>
<li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li>
<li>Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dit artikel was bedoeld om een protocol te beschrijven om enkele niet-cardiomyocyten te isoleren van muizenharten post MI. Het protocol kan worden toegepast om verschillende soorten cellen in de post-MI-micro-omgeving met hoge kwaliteit te isoleren, waaronder immuuncellen, endotheelcellen en fibroblasten. Drie essentiële factoren zijn cruciaal voor het verkrijgen van een hoogwaardige celsuspensie voor single-cell sequencing. De eerste is de instelling van de enzymatische spijsvertering. Het is belangrijk om de tijd van v...

Myocardinfarct (MI) is een van de meest voorkomende hart- en vaatziekten en de mortaliteit ervan neemt over de hele wereld toe1. MI wordt veroorzaakt door een onvoldoende bloedtoevoer naar het omliggende myocardium, wat een gevolg kan zijn van een kransslagaderblokkade die optreedt bij atherosclerotische plaqueruptuur. Hoewel percutane coronaire interventie (PCI) de sterftecijfers van acute MI-patiënten heeft verminderd, blijft de hoge prevalentie van hartfalen na MI een probleem2. De belangrijkste pathofysiologie die ten grondslag ligt aan post-MI hartfalen is de compenserende reactie van het lichaam op hartletsels, waarbij de dode hartspier wordt vervangen door niet-contractiele fibrotische littekens. Deze adaptieve reacties zijn aanzienlijk afhankelijk van lokale ontsteking gemedieerd door de interacties tussen meerdere celtypen en hartweefselcellen, en deze ontsteking wordt nu beschouwd als een potentieel therapeutisch doelwit om fibrotische littekenvorming te verminderen en dus te beschermen tegen post-MI hartfalen 3,4. Interessant is dat de micro-omgeving op de infarctplaats een tijdsafhankelijke overgang ervaart in de infiltrerende celtypen en functies in verschillende stadia van MI 1,5. Veel studies hebben aangetoond dat niet-cardiomyocyten (bijv. Immuuncellen, fibroblasten en endotheelcellen) een centrale rol spelen bij post-MI-ontsteking en weefselherstel 5,6. In de afgelopen jaren is single-cell sequencing op grote schaal gebruikt als een krachtig hulpmiddel voor het ophelderen van de betrokkenheid en functies van niet-cardiomyocyten in de post-MI micro-omgeving 7,8. Dit geeft inzicht in de pathofysiologie van post-MI letsel en herstel en de ontwikkeling van mogelijke therapieën tegen post-MI hartfalen.
High-throughput RNA sequencing (RNA-Seq) is een techniek die wordt gebruikt om volledige transcriptomen in detail te bestuderen met behulp van next-generation sequencing (NGS)7,8,9. Onlangs heeft de ontwikkeling van scRNA-Seq een revolutie teweeggebracht in het biomedische onderzoeksveld. Vergeleken met conventionele bulksequencing analyseert scRNA-Seq genexpressieprofielen en transcriptionele heterogeniteit op het niveau van één cel 7,8. Deze techniek bevordert het onderzoek van de cellulaire pathofysiologie van MI 9,10 aanzienlijk door verschillende circulerende celtypen in de post-MI micro-omgeving te identificeren en de interactie tussen cardiomyocyten en niet-cardiomyocyten bloot te leggen. Deze bevindingen dragen verder bij aan het ontdekken van nieuwe therapeutische doelen voor post-MI hartfalen. Over het algemeen omvat het op scRNA-seq gebaseerde post-MI-experiment drie hoofdsecties: (1) de vaststelling van een post-MI-diermodel; 2) de bereiding van de celsuspensie; en (3) monstersequencing en gegevensanalyse. Opmerkelijk is dat het voorbereiden van de celsuspensie de meest kritieke stap is in de voorbereiding van het scRNA-Seq-experiment, omdat de kwaliteit van de celsuspensie de nauwkeurigheid van de resultaten bepaalt.
Dit protocol is ontworpen om een niet-cardiomyocytencelsuspensie uit het post-MI hartweefsel te extraheren; Veelbetekenend is dat de specifieke details voor het behoud van de levensvatbaarheid en resolutie van cellen zijn opgenomen. Ondertussen is de apparatuur die in dit protocol wordt gebruikt, zoals chirurgische kits voor muizen, knaagdierventilatoren en centrifuges, te vinden in de meeste dierexperimentele centra en biomedische laboratoria, en dus zijn de experimentkosten van dit protocol relatief laag. Bovendien, als tijdspunten en plaatsen van infarct als variabelen worden beschouwd, kan dit protocol worden toegepast om een breed scala aan klinische scenario's te simuleren, vooral voor de post-MI-complicaties.

<table><tbody><tr><td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td><td>Logos biosystems</td><td>F23001</td><td></td></tr><tr><td>Automated&nbsp;Cell&nbsp;Counter</td><td>Logos biosystems</td><td>L20001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Servicebio</td><td>G5001</td><td>Cytoprotectieve effect</td></tr><tr><td>Cell Counting Slides</td><td>Logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td>Dierlijke enzymen</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td>Dierlijke enzymen</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>Voorkomen van celklompjes</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;40&mu;m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Verwijder celklompjes</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;70&mu;m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Verwijder onverteerd weefsel en klonten</td></tr><tr><td>Flow Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>OU QING SI</td><td>10054963976859</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>FST</td><td>12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Forceps</td><td>RWD</td><td>F14012-10</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Scissors</td><td>RWD</td><td>S11036-08</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer</td><td>Beyotime</td><td>C3702-120ml</td><td>Verwijder rode bloedcellen</td></tr><tr><td>Rib Retractor</td><td>FST</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Ventilator</td><td>Harvard</td><td>730043</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Solvent&nbsp;oplossing van enzym</td></tr><tr><td>Sterile Scissor</td><td>RWD</td><td>S14014-10</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell rna-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Myocardinfarct (MI) is een van de meest voorkomende hart- en vaatziekten, met een toenemende mortaliteit wereldwijd. Niet-cardiomyocyten zijn goed voor meer dan de helft van de totale hartcelpopulatie en ze dragen bij aan adaptieve compensaties bij myocardletsel, waaronder ontstekingsreacties, weefselherstel en littekenvorming. Om de post-MI cardiale micro-omgeving te bestuderen, wordt single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) veel gebruikt om verschillende hartceltypen en intercellulaire communicatie te identificeren. Onder de procedures van scRNA-seq monstervoorbereiding is het voorbereiden van de celsuspensie een van de meest kritieke stappen, omdat de levensvatbaarheid van de cel de kwaliteit van de scRNA-seq-resultaten kan beïnvloeden. Daarom hebben we een experimenteel protocol ontworpen voor het bereiden van een niet-cardiomyocytencelsuspensie van post-MI-muizenharten met een extra focus op het verbeteren van de levensvatbaarheid van de cel door milde spijsverteringsenzymen te kiezen, de verteringstijd te regelen en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) toe te passen. Ten slotte isoleerden we CD45+ cellen uit de niet-cardiomyocytencelsuspensie verkregen via dit protocol, en vervolgens voerden we scRNA-seq uit.

Een eencellige suspensie met hoge vitaliteit werd verkregen door toepassing van sectie 2 van dit protocol. Er konden echter nog steeds celfragmenten worden waargenomen (figuur 1A); daarom werd fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) uitgevoerd om de kwaliteit verder te verbeteren16. Na FACS neemt de gemiddelde celgrootte af van 9,6 μm tot 9,1 μm ( tabel 1), wat suggereert dat het aandeel celfragmenten in de celsuspensie effectief kan worden ver...

Hier beschrijven we een protocol om een voldoende hoeveelheid enkele niet-cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid te isoleren uit een post-myocardinfarct (MI) muizenhart. Dit kan worden gebruikt voor daaropvolgende single-cell sequencing, flowcytometrie-analyse en primaire celcultuur.

Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Ons protocol garandeert zowel de levensvatbaarheid van de cel als de isolatie-efficiëntie van eencellige suspensie tegen relatief lage kosten. De relatief lage kosten en eisen aan laboratoriumapparatuur zijn de belangrijkste voordelen van deze techniek. Single cell sequencing onthult de heterogeniteit van niet-cardiomyocyten in cardiale pathofysiologie en biedt ook ideeën voor basis- en klinische studies voor hartaandoeningen.Dit protocol kan worden gebruikt in deze studies naar de post-MI cardiovasculaire omgeving, zoals de betrokkenheid van immuuncellen. Voor de eerste keer voorbereidingen, stel ik voor dat extra aandacht wordt besteed aan het monster pepsine en de verteringstijd. Zodra de buffers en oplossingen zijn voorbereid zoals beschreven in het manuscript, plaatst u een geëuthanaseerde muis die twee weken eerder een hartinfarct had gehad in rugligging op de operatietafel.Bevestig de achterpoten met plakband. Om het hart te verwijderen, spuit je het lichaam met 70% ethanol. Maak een verticale incisie door de buikhuid en spieren terwijl je de lever vermijdt.Zonder het hart te doorboren, opent u voorzichtig de thorax en overgiet u de linkerkamer met een voorkoele PBS-oplossing totdat de perfusievloeistof kleurloos is. Til met een tang het hart voorzichtig op en knip de overtollige weefsels weg die aan de buitenkant zijn bevestigd met een oogheelkundige schaar. Plaats het hart in een milliliter voorgekoelde PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Breng het hart over in een put van een 24-putplaat die op ijs is geplaatst. Pipetteer 150 microliter van de cardiale dissociatiebuffer in de put en snijd het hart in stukjes van een millimeter met een schaar. Breng het gehakte hartweefsel over in een centrifugebuis van 15 milliliter met vijf milliliter van de weefseldissociatiebuffer.Plaats de buis in een thermostatische heen en weer bewegende schudder. Pipetteer de suspensie 10 keer per 20 minuten op en neer. Om klonten en onverteerd weefsel te verwijderen, filtert u de celsuspensie door een 70 micrometer celzeef met behulp van 25 milliliter celwasbuffer.Spoel de centrifugebuis en de celzeef af. Filter vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer om verdere celklonten te verwijderen. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie op 300 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Resuspendeer het celmonster in vijf volumes RBC-lysisbuffer en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg nu vier volumes van de celwasbuffer toe in celsuspensie en centrifuge zoals eerder gedemonstreerd. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de cellen in 10 milliliter van de celwasbuffer en centrifugeert u opnieuw.Aan het einde van de centrifugatie gooit u het supernatant weg en suspensieert u de pellet in één milliliter celwasbuffer. Neem 18 microliter van de suspensie in een andere centrifugebuis en voeg twee microliter acridine oranje propidiumjodidekleuringsoplossing toe. Voeg 10 microliter van deze gekleurde oplossing toe aan een telkamerschuif.Evalueer de celaantallen en levensvatbaarheid met behulp van een automatische celteller. Celfragmenten werden waargenomen in de eencellige hartsuspensie. Fluorescentie geactiveerde celsortering verminderde effectief het aandeel van de celfragmenten en celklontering, wat resulteerde in een verminderde gemiddelde celgrootte.RNA-sequencing bleek een voor de hand liggende scheiding van zeven soorten immuuncellen, zoals aangetoond door de onbewaakte clustering en verminderde T-gedistribueerde stochastische bureninbedding. Elke immuuncel vertoonde een hoge expressie van klassieke markers. Hartweefsel moet klein genoeg worden gesneden om onvolledige spijsvertering te voorkomen, wat leidt tot veel celklontjes in de celsuspensie.De eencellige suspensie die door dit protocol wordt verkregen, kan verder worden toegepast in de stroomanalyse van de primaire celcultuur. Dit protocol komt ten goede aan de studies over de micro-omgeving van myocardiale infectie, wat onderzoekers kan helpen verder te kijken dan de hartweefsels en myocardiale infectie als een systematisch probleem te beschouwen.

preparation-non-cardiomyocyte-cell-suspension-for-single-cell-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

We beschrijven een betrouwbare methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor de cultuur van functionele volwassen hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Hier gepresenteerd is een protocol om verschillende subgroepen van macrofagen en andere niet-immuuncellen van mens en muis myocardium te isoleren door het voorbereiden van een enkelvoudige celsuspensie door enzymatische spijsvertering. Gating schema's voor flow cytometrie gebaseerde identificatie en karakterisering van geïsoleerde macrofagen worden ook gepresenteerd.

Isolatie van macrofaag subsets en stromale cellen van myocardiale monsters van mens en muis

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, transfectie, en de lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten.

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.

Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

Hier beschrijven we een tweestaps celverteringsprotocol voor het bereiden van een eencellige suspensie van de halsslagaders van muizen.

Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing

Leer een protocol voor het isoleren van niet-cardiomyocyten uit post-MI muizenharten voor single-cell RNA-sequencing. Deze methode biedt hoge celviabiliteit tegen lage kosten en ondersteunt onderzoek naar cardiovasculaire pathofysiologie en immuuncelbetrokkenheid.

Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Meer video's verkennen