Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

Een ernstig obstakel voor de behandeling van kanker is de beperkte toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen als gevolg van fysiologische barrières. De ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die in staat zijn om biologische barrières te behandelen, is dus sterk gewenst om de efficiëntie van de medicijnafgifte te verbeteren. Het doel van deze procedure is om de cyclische celdoordringende peptiden te synthetiseren voor verbeterde cel-tot-cel penetratie.

Het voordeel van deze methode is dat de peptidecyclisatie gemakkelijk kan worden bereikt door substitutiereacties met cysteïnes en hars zonder dat er metaalkatalysatoren nodig zijn. De opname van aromatische cross-links verbetert de algehele hydrofobiciteit van de peptiden in vergelijking met de hydrofiele lactam- of triazoolkruisverbindingen, waardoor hun permeabiliteit wordt verbeterd. Monteer om te beginnen het handmatige peptidesyntheseapparaat in de zuurkast.

Plaats de driewegkranen op het vacuümspruitstuk en sluit ze aan op stikstof. Zorg ervoor dat u de ongebruikte inlaten afsluit. Bevestig een polypropyleenkolom van 10 milliliter op de driewegkranen en giet het reactiemengsel of de oplosmiddelen uit de polypropyleenkolom af met behulp van een rubberen pipetbol of een vacuüm via een afvalvanger.

Om de hars voor te bereiden op peptidesynthese, voegt u 4 tot 5 milliliter DMF toe aan de vereiste hoeveelheid hars en brengt u deze over naar de polypropyleenkolom met zachte stikstof die gedurende 30 minuten borrelt om de hars voldoende op te zwellen. Giet de DMF af en voeg 4 tot 5 milliliter 50%morfoline/DMF toe aan de hars. Bor stikstof voorzichtig gedurende 30 minuten om de N-terminale Fmoc-groep te verwijderen en laat het mengsel vervolgens uitlekken.

Was de hars drie keer grondig door 4 tot 5 milliliter DMF aan de kolom toe te voegen en elke keer minstens 1 minuut met stikstof te borrelen. Was de hars op dezelfde manier drie keer met dichloormethaan en drie keer met DMF. Los vervolgens 648,8 milligram Fmoc en PBF-beschermde arginine en 372,6 milligram HATU op in 5 milliliter DMF in een centrifugebuis.

Voeg 348,4 microliter DIPEA toe om de koppelingsreactie te activeren en breng het reactiemengsel over naar de polypropyleenkolom met hars. Roer het mengsel voorzichtig met borrelende stikstof gedurende 1 tot 2 uur en herhaal de koppelingsreactie dan eenmaal. Giet het reactiemengsel af en was de hars achtereenvolgens met DMF, dichloormethaan en nogmaals DMF drie keer elk gedurende ten minste 1 minuut per keer.

Verwijder de Fmoc-beschermende groep en was de hars volgens de eerder getoonde procedure voordat u doorgaat met het koppelen van het volgende aminozuur. Koppel vervolgens de bèta-alanine als een afstandhouder voor FITC-etikettering met behulp van hetzelfde proces dat wordt getoond voor aminozuurkoppeling en voeg vervolgens een mengsel van FITC, DIPEA en DMF toe aan de polypropyleenkolom in het donker om FITC-etikettering van peptiden op de hars uit te voeren. De reactie zou bijna 8 uur duren.

Om de cyclisatie van het lineaire peptide uit te voeren, voegt u gedurende 2 minuten een mengsel van trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan en dichloormethaan toe aan de polypropyleenkolom om selectief de trityl-beschermende groep cysteïne te verwijderen. Giet het mengsel af en herhaal de procedure totdat de gelige oplossing kleurloos wordt om de trityl-beschermende groep volledig te verwijderen. Voer opeenvolgende wasbeurten van de hars uit met DMF en dichloormethaan ten minste drie keer en los 4, 4'bis-broommethyl-bifenyl op in DMF met DIPEA.

Voeg de oplossing toe aan de kolom en reageer gedurende 4 uur. Was de hars met 4 tot 5 milliliter methanol twee keer gedurende vijf minuten elk en droog het met een continue stroom stikstof. Voor peptiden die cysteïnes bevatten, behandel de hars met een effectieve splitsingscocktail van trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan en water of trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan, 1, 2-ethanedithiol en water.

Behandel de peptidegebonden hars gedurende 2 tot 3 uur om het peptide te splitsen en verwijder vervolgens het trifluorazijnzuur voorzichtig met een stroom stikstof. Om de ruwe peptiden te verkrijgen, voegt u 4 tot 5 milliliter diethylether toe aan het gekloofde peptidepreparaat om de ruwe peptiden neer te slaan en centrifugeert u gedurende 4 minuten op 10.000 x g. Gooi het supernatant voorzichtig weg en droog het peptide gedurende 3 minuten aan de lucht in een effectieve zuurkast.

Los het kleinschalige ruwe peptide op in 800 microliter acetonitril en analyseer het vervolgens met behulp van omgekeerde fase high-performance vloeistofchromatografie en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Ent 100.000 HeLa-cellen in 2 milliliter DMEM in een 12-putkamer met een weefselkweekplaatinzet en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verwijder het medium en incuber de cellen in de kamers met 1 milliliter 10 micromolaire FITC-R8 of FITC-sR8-4 in FBS-vrije DMEM gedurende 1 uur.

Verwijder daarna het medium met de peptiden en was de cellen drie keer met 1 milliliter PBS. Voeg 1 milliliter verse FBS-vrije DMEM toe aan de kamers en co-incubeer vervolgens de HeLa-cellen in de kamer met de weefselkweekplaatinzet, met de HeLa-cellen op de ronde coverslips aan de onderkant gedurende 2 uur. Bevestig de HeLa-cellen op de ronde coverslips met 2,5% glutaaraldehyde gedurende 15 minuten en kleurt de cellen vervolgens gedurende 15 minuten met DAPI.

Observeer ten slotte de HeLa-cellen op de coverslips onder een fluorescentiemicroscoop. Een schematisch diagram van de synthese van FITC-gelabeld lineair R8-peptide en FITC-gelabeld genietbaar R8-peptide wordt hier gepresenteerd. De HPLC- en MS-spectra van het lineaire R8-peptide en het nietje R8-peptide zijn in deze figuur weergegeven.

De retentietijd van het geniete peptide was aanzienlijk langer dan die van het lineaire analoog, wat wijst op een verhoogde algehele hydrofobiciteit van het peptide na cyclisatie met de hydrofobe crosslink. Deze grafische afbeelding toont de stabiliteit van het lineaire peptide en het geniete peptide in aanwezigheid van 25% FBS. De cyclische R8 blijft 77,3% intact na incubatie met FBS gedurende 4 uur, terwijl zijn lineaire tegenhanger grotendeels werd afgebroken, wat wijst op een verbeterde proteolytische stabiliteit van het cyclische R8-peptide.

Live-cell fluorescentiemicroscopiebeelden van HeLa-cellen en 4T1-cellen na 1 uur incubatie met 3 micromolair FITC-gelabeld lineair R8-peptide en FITC-gelabeld genietbaar R8-peptide worden hier getoond. Het is te zien dat de cellen behandeld met cyclisch R8 met aromatische cross-link een hogere intracellulaire fluorescentie vertoonden dan die behandeld met hun lineaire tegenhanger. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met flowcytometrie-analyse.

Om verder te onderzoeken of cyclisch R8 een verbeterde cel-tot-cel penetratie verleent, werden transwell-modellen gebruikt om de barrièrepermeabiliteit van de peptiden van de ene cellaag naar de andere te simuleren. De cyclische R8 vertoonde duidelijk een hogere trans-barrièrepenetratie dan het lineaire R8-peptide, zoals aangegeven door een significante toename van intracellulaire fluorescentie. Volledige deprotectie van de tritylgroep van cysteïne en hars is belangrijk voor de volgende cyclisatiestap.

Bovendien hangt de cyclisatie-efficiëntie ook af van de specifieke sequenties en de lengtes van de peptiden als gevolg van sterische effecten. In een dergelijk geval zou het nuttig zijn om een hars met een lager laadvermogen of cyclisatie van de peptiden onder verdunde concentraties in de oplossingsfase te gebruiken. Deze cyclische peptiden vertoonden een verbeterde cel-tot-cel permeabiliteit in vergelijking met hun lineaire tegenhangers.

Wij geloven dat ze een grote belofte inhouden voor het overwinnen van biologische barrières en zullen worden gebruikt voor een moleculaire voor verdere toepassingen op het gebied van medicijnafgifte.