Name: Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer de synthese van cyclische celdoordringende peptiden met aromatische kruisverbindingen voor verbeterde penetratie van biologische barrières. Deze methode zonder metalen katalysatoren verhoogt hydrofobiciteit en verbetert efficiëntie van medicijnafgifte aan tumorcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) en de Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075).

1. Voorbereiding van de apparatuur
OPMERKING: Voer alle procedures uit in een werkende zuurkast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
<ol><li>Monteer het handmatige peptidesyntheseapparaat in de zuurkast (figuur 1). Plaats de driewegkranen (zie materiaaltabel) op het vacuümspruitstuk (zie materiaaltabel) en sluit aan op de stikstof (N2). Zorg ervoor dat u de ongebruikte inlaten afsluit.</li>
	<li>Bevestig een polypropyleenkolom van 10 ml (zie materiaaltabel) op de driewegkranen. Giet het reactiemengsel of de oplosmiddelen uit de polypropyleenkolom af met behulp van een rubberen pipetbol of een vacuüm via een afvalvanger.</li>
</ol>2. Synthese van FITC-gelabeld lineair R8-peptide (FITC-R8) en FITC-gelabeld genietbaar R8-peptide (FITC-sR8-4)
OPMERKING: De peptiden werden gesynthetiseerd volgens een standaard Fmoc-gebaseerd solid-phase peptide synthesis (SPPS) protocol25. De 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-fenoxyacetamido-norleucyl-MBHA-hars (ijsbaanamide MBHA-hars, zie materiaaltabel) werd gedurende het hele onderzoek gebruikt.
LET OP: N, N-dimethylformamide (DMF), N, N-diisopropylethylamine (DIPEA), morfoline en dichloormethaan (DCM) zijn allemaal kleurloos en zijn schadelijk als ze worden ingeademd of door de huid worden opgenomen. Ether is zeer licht ontvlambaar. 1,2-Ethanedithiol (EDT) is een bijzonder geurige stof. Trifluorazijnzuur (TFA) is zeer corrosief en de zuurgraad is 105 keer die van azijnzuur. Bijgevolg moeten alle reagentia en chemicaliën worden behandeld met behulp van beschermende uitrusting in een zuurkast.
<ol><li>Bereid de hars voor op peptidesynthese.<ol><li>Bereken de massa hars die nodig is voor de synthese:Massa hars (mg) = schaal (mmol) / harsbelastingscapaciteit (mmol / g) × 1.000 (mg / g) OPMERKING: Bijvoorbeeld, de massa van ijsbaanamide MBHA-hars (0,572 mmol / g) voor 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol / g × 1.000 mg / g = 350 mg.</li>
		<li>Voeg 4-5 ml DMF toe aan de vereiste hoeveelheid hars en breng over in de 10 ml polypropyleenkolom (stap 1.2) met zachte N2 borrelend gedurende 30 minuten om de hars voldoende op te zwellen en giet vervolgens de DMF af.</li>
		<li>Voeg 4-5 ml 50% morfoline/DMF (v/v) toe aan de hars, laat N2 gedurende 30 min 2x zachtjes bubbelen om de N-terminale Fmoc-groep te verwijderen en giet het mengsel vervolgens af. Was daarna de hars 3x grondig door 4-5 ml DMF aan de kolom toe te voegen en elke keer minstens 1 minuut met N2 te borrelen. Blijf de hars op dezelfde manier wassen met DCM (3x) en DMF (3x).</li>
	</ol></li>
	<li>Voer Fmoc-beschermde aminozuurkoppeling uit zoals hieronder beschreven. OPMERKING: De koppeling van arginine in een 0,2 mmol schaal handmatige synthese wordt hier beschreven als een voorbeeld.<ol><li>Los Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 equiv., 648,8 mg) en 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetramethyluroniumhexafluorfosfaat (HATU, 4,9 equiv., 372,6 mg) op in 5 ml DMF in een centrifugebuis.</li>
		<li>Voeg DIPEA (10 equiv., 348,4 μL) toe om de koppelingsreactie te activeren en breng het reactiemengsel vervolgens over naar de 10 ml polypropyleenkolom met hars (bereid in stap 2.1.3). Roer vervolgens voorzichtig het mengsel met N 2 borrelend gedurende1-2 uur.</li>
		<li>Herhaal de koppelingsreactie (stap 2.2.1 en stap 2.2.2) eenmaal opnieuw.</li>
		<li>Na voltooiing van de koppeling giet u het reactiemengsel af en wast u de hars achtereenvolgens met DMF, DCM en DMF 3x elk gedurende ten minste 1 minuut per keer.</li>
		<li>Voer de koppeling van elk aminozuur uit in volgorde van stappen: Voeg 4-5 ml 50% morfoline / DMF (v / v) toe aan de hars, bubbel voorzichtig met N 2 gedurende 30 minuten 2x om de N α-Fmoc-groep te verwijderen, was vervolgens de hars (zoals weergegeven in stap 2.2.4) en ga verder met het koppelen van het volgende aminozuur (zoals weergegeven in stap 2.2.1 en stap 2.2.2). Ga verder met verschillende cycli van deze stap om synthese van het gewenste peptide te bereiken. OPMERKING: Dit proces kan hier worden gepauzeerd. Condenseer de hars met methanol en droog de hars met een continue stroom van N2. Sluit de polypropyleenkolom af en bewaar de hars vervolgens enkele dagen bij 4 °C (of bij −20 °C voor langere opslag). Zweek de hars op met 4-5 ml DMF gedurende 0,5-1 uur voordat u met een nieuwe synthese begint. Als u direct doorgaat naar de volgende stap, is het niet nodig om de hars te condenseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Label de peptiden met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) zoals hieronder beschreven.<ol><li>Koppel de bèta-alanine als een afstandhouder voor FITC-etikettering met hetzelfde proces als gebruikt voor aminozuurkoppeling in stap 2.2.</li>
		<li>Voer FITC-etikettering van peptiden op de hars uit door een mengsel van FITC (5 equiv.), DIPEA (10 equiv.) en DMF toe te voegen aan de polypropyleenkolom en gedurende 8 uur in het donker te reageren.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer voor de synthese van FITC-sR8-4 cyclisatie van het lineaire peptide uit zoals hieronder beschreven.<ol><li>Voeg gedurende 2 minuten een mengsel van TFA/triisopropylsilaan (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) toe aan de polypropyleenkolom om selectief de Cys (Trt) beschermende groep te verwijderen en giet het mengsel vervolgens af. Herhaal de bovenstaande procedure totdat de gelige oplossing kleurloos wordt om de Trt-beschermingsgroep volledig te verwijderen.</li>
		<li>Voer vervolgens ten minste 3x opeenvolgende wasbeurten van de hars uit met DMF en DCM. Los daarna 4,4'-bis(broommethyl)bifenyl (2 equiv.) op in DMF met DIPEA (4 equiv.), voeg het toe aan de kolom en reageer gedurende 4 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Splits de peptiden zoals beschreven: Na de voltooiing van de peptidesynthese, was de hars met 4-5 ml methanol tweemaal gedurende 5 minuten elk en droog het met een continue stroom van N2. Behandel de hars met een effectieve splitsingscocktail TFA/TIS/H 2 O (95/2.5/2.5, v/v/v), of TFA/TIS/EDT/H 2 O (92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v) voor peptiden die cysteines bevatten, met ongeveer 1 ml splitsingscocktail per 100 mg hars. Behandel de peptidegebonden hars gedurende 2-3 uur om het peptide te splitsen en verwijder vervolgens de TFA voorzichtig met een stroom van N2.</li>
	<li>Om de ruwe peptiden te verkrijgen, voegt u 4-5 ml diethylether toe aan het gekloofde peptidepreparaat om de ruwe peptiden neer te slaan en gedurende 4 minuten op 10.000 × g te centrifugeren. Gooi het supernatant voorzichtig weg en droog het peptide gedurende 3 minuten aan de lucht in een effectieve zuurkast.</li>
	<li>Analyse van de peptiden: Los een kleinschalig ruw peptide (gesplitst uit ongeveer 10 mg peptidegebonden hars) op in 800 μL acetonitril (ACN)/H2O (1/1, v/v) en analyseer vervolgens met behulp van reverse-phase high-performance vloeistofchromatografie (RP-HPLC) en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Zuiver de peptiden met RP-HPLC en LC-MS.<ol><li>Los 50 mg ruw peptideproduct op in 4 ml ACN/H2O (1/1, v/v) en injecteer de oplossing in een RP-HPLC-systeem dat is uitgerust met een C18-kolom (4,6 mm x 150 mm, poriegrootte: 120 Å, deeltjesgrootte: 4 μm; zie materiaaltabel). Elueer het peptide met behulp van een mobiele fase met 0,1% TFA/H2O (v/v) en ACN, met een gradiënt van 10% tot 90% ACN gedurende 30 minuten. Conventionele peptiden werden gedetecteerd bij 220 nm en FITC-gelabelde peptiden bij 494 nm.</li>
		<li>Verzamel de fracties die overeenkomen met de belangrijkste peptidepiek zoals geïdentificeerd door MS en lyofiliseer vervolgens de gewenste peptidefracties. Bewaar het gezuiverde peptide bij −20 °C. OPMERKING: De gevonden m/z van de gezuiverde FITC-R8 zijn als volgt: [M + 3 H]3+: 576,63; [M + 4 H] 4+: 432,72; [M + 5 H] 5+: 346,39; [M + 6 H] 6+: 288,85. De gevonden m/z van de gezuiverde FITC-sR8-4 zijn als volgt: [M + 3 H]3+: 704,74; [M + 4 H] 4+: 528,77; [M + 5 H] 5+: 423,34; [M + 6 H] 6+: 352,91. MS analytische omstandigheden: instrument: ESI (probe bias: +4,5 kV; detector: 1,2 kV); vernevelaar gasstroom: 1,5 l / min; gebogen desolatielijn (CDL): −20 V; CDL temperatuur: 250 °C; bloktemperatuur: 400 °C; debiet: 0,2 ml / min; mobiele fase: 50% H2O/50% ACN.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kwantificering van de FITC-gelabelde peptiden
<ol><li>Los een kleine hoeveelheid gezuiverd peptide op in DMSO als stamoplossing (bijv. 40 μmol/ml).</li>
	<li>Meet de absorptie bij 494 nm (A 494) van 2 μL van de stamoplossing in498 μL 10 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS, pH 7,4) met een microtiterplaat (zie materiaaltabel) met behulp van een multitechnologische microplaatlezer (zie materiaaltabel). De verdunningsfactor is 500 μL/ 2 μL = 250 en de padlengte van de microtiterplaat is 0,5 mm.</li>
	<li>Bereken de concentratie van de stamoplossing met behulp van de volgende formule: Concentratie (mM) = A494 × verdunningsfactor / 0,05 (cm) / 77.000 (cm−1· M−1) × 1.000 (mM·M−1)</li>
	<li>Stel in op een juiste verdunning zodat de gemeten A494-waarde tussen 0,1 en 1,0 ligt. OPMERKING: De metingen moeten meerdere keren worden herhaald om ervoor te zorgen dat de gemeten concentratie nauwkeurig is. De extinctiecoëfficiënt van 77.000 cm−1· M−1 komt voort uit de FITC-groep.</li>
</ol>4. Stabiliteit van peptiden in foetaal runderserum (FBS)
<ol><li>Incubeer het peptide in een concentratie van 100 μM met 250 μL van 25% FBS/H2O (v/v) bij 37 °C. Neem na het incuberen gedurende 0 uur, 1 uur, 2 uur en 4 uur 10 μL aliquots en voeg vervolgens 150 μl 12% trichloorazijnzuur opgelost in H2O/ACN (1/3, v/v) toe om de serumeiwitten neer te slaan.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 10.000 × g en analyseer het supernatant met behulp van HPLC (zoals beschreven in stap 2.8) om de mate van peptideafbraak te bepalen.</li>
	<li>Bereken de verhouding van het piekoppervlak op 1 h, 2 h en 4 h tot dat op 0 h om de fractie van niet-afgebroken peptide op het overeenkomstige tijdstip te verkrijgen. Het resultaat is het gemiddelde van drie parallelle monsters.</li>
</ol>5. Cellulaire opname van de peptiden
<ol><li>Fluorescentie microscopische beeldvorming<ol><li>Plaats een ronde coverslip in een plaat met 12 putten. Ent vervolgens 1 x 105 cellen gelijkmatig op dekzeilen en kweek 's nachts met 2 ml medium. Verwijder het medium en was de cellen 3x met 1 ml PBS. OPMERKING: In deze studie werden HeLa-cellen en 4T1-cellen gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, zie Materiaaltabel) aangevuld met 10% FBS in een 37 °C bevochtigde incubator met 5% CO2.</li>
		<li>Incubeer de cellen met 1 ml 3 μM FITC-gelabelde peptiden in FBS-vrije DMEM gedurende 1 uur bij 37 °C. Verwijder daarna het peptide-bevattende medium en was de cellen 3x met 1 ml PBS.</li>
		<li>Kleuring de cellen met 1 ml Hoechst 33258 gedurende 15 min. Observeer de internalisatie van elk peptide met behulp van een fluorescentiemicroscoop (zie materiaaltabel) met dezelfde fluorescentie-intensiteit en blootstellingstijd. OPMERKING: De volgende instellingen zijn gebruikt voor fluorescentiemicroscopie. Doelstelling: Plan-Apochromaat: 63 x/1.40 Olie DIC M27; Kanaal 1 voor FITC: excitatiefilter: 450-490 nm, emissiefilter: 500-550 nm, belichtingstijd: 230 ms; Kanaal 2 voor Hoechst 33258: excitatiefilter: 335-383 nm, emissiefilter: 420-470 nm, belichtingstijd: 27 ms.</li>
	</ol></li>
	<li>Flowcytometrie analyse<ol><li>Ent 5 x 105 HeLa-cellen gelijkmatig in 12-putplaten en kweek in DMEM gedurende 24 uur bij 37 °C. Verwijder daarna het medium en was de cellen 3x met 1 ml PBS.</li>
		<li>Incubeer de cellen met 1 ml 3 μM FITC-gelabelde peptiden in FBS-vrije DMEM gedurende 1 uur bij 37 °C. Verwijder het peptide-bevattende medium, dissocieer de cellen met 0,25% (w/v) trypsine en 0,53 mM EDTA in PBS gedurende 5 minuten en verzamel de cellen vervolgens door centrifugeren bij 306 × g gedurende 4 minuten. Was de celpellet met PBS.</li>
		<li>Incubeer de cellen met 1 ml 0,05% (w/v) trypan blauw in PBS gedurende 3 minuten om de oppervlaktegebonden fluorescentie te doven en voer kwantitatieve analyse van intracellulaire fluorescentie uit met behulp van een flowcytometer (zie tabel met materialen). OPMERKING: Flowcytometrie-instellingen: excitatie: 488 nm, emissie: 530 nm. Trypan blue kan ook de fluorescentie van dode cellen doven en helpen bij het onderscheiden van levende / dode cellen tijdens de analyse van de opname van peptiden.</li>
		<li>Behandel en test 4T1-cellen met behulp van flowcytometrie volgens hetzelfde protocol als beschreven voor HeLa-cellen. Verzamel 5 x 105 cellen per monster en stel drie parallelle monsters per groep in.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Verkenning van de cel-tot-cel penetratie van de peptiden met behulp van transwell modellen
<ol><li>Ent 1 x 10 5 HeLa-cellen in 2 ml DMEM in een 12-putkamer met een weefselkweekplaatinzet (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C met5% CO2. Verwijder daarna het medium en incuber de cellen in de kamers met 1 ml 10 μM FITC-R8 of FITC-sR8-4 (gezuiverd met HPLC) in FBS-vrije DMEM gedurende 1 uur.</li>
	<li>Verwijder het medium met de peptiden en was de cellen 3x met 1 ml PBS. Voeg 1 ml verse FBS-vrije DMEM toe aan de kamers en co-incubeer vervolgens de HeLa-cellen in de kamer met de weefselkweekplaatinzet met de HeLa-cellen op de ronde coverslips aan de onderkant gedurende 2 uur.</li>
	<li>Bevestig de HeLa-cellen op de ronde coverslips met 2,5% glutaaraldehyde gedurende 15 minuten en kleurt de cellen vervolgens gedurende 15 minuten met DAPI. Observeer vervolgens de HeLa-cellen op de coverslips onder een fluorescentiemicroscoop. Behandel en test 4T1-cellen met hetzelfde protocol als dat voor HeLa-cellen.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly%28%CE%B2-amino+esters%29+delivery+platform+for+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly%28mannitol-co-PEI%29+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li>
<li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li>
<li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+on+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li>
<li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li>
<li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li>
<li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+Classes%2C+origin%2C+and+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li>
<li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+%28PNA%29+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li>
<li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li>
<li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery%3A+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li>
<li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+%CE%B2-catenin+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li>
<li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+%CE%B1-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li>
<li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li>
<li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+in+shape%3A+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+%CE%B1-helical+peptides%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li>
<li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li>
<li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+short+%CE%B1-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li>
<li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li>
<li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrocyclic+cell+penetrating+peptides%3A+A+study+of+structure-penetration+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+%CE%B1-helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li>
<li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+proteolytically+stable%2C+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li>
<li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cationic+amphiphilic+%CE%B1-helical+peptides+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li>
<li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides%3A+Tales+of+tails+wagging+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De chemische stabilisatie van peptiden door conformationele beperkingen op te nemen, is een effectieve strategie gebleken voor het verbeteren van de stabiliteit en celdoorlaatbaarheid van het peptide26. In dit protocol wordt een stapsgewijze procedure beschreven voor de synthese van cyclische CPP's met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen. Vergeleken met de hydrofiele lactam- of triazoolkruisverbindingen22,27, ver...

De afgelopen decennia zijn getuige geweest van snelle vooruitgang in de ontwikkeling van celdoordringende peptiden (CPP's) voor medicijnafgifte. CPP's zijn op grote schaal gebruikt als moleculaire transporters voor de behandeling van een reeks levensbedreigende ziekten, waaronder neurologische aandoeningen1,2, hartaandoeningen3, diabetes4, dermatose5 en kanker 6,7. Kanker blijft een wereldwijde gezondheidslast die gepaard gaat met een hoge mate van morbiditeit en mortaliteit, ondanks wijdverspreide onderzoeksinspanningen8. Een ernstig obstakel voor de behandeling van kanker is de beperkte toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen als gevolg van fysiologische barrières zoals compacte extracellulaire matrix (ECM), abnormale tumorvasculatuur, meerdere membraanbarrières en hoge interstitiële vloeistofdruk (IFP)9. Daarom wordt het ontwikkelen van nieuwe CPP's met een superieur vermogen om ladingen over biologische barrières te leveren beschouwd als een essentiële strategie voor de behandeling van kanker10,11.
CPP's kunnen worden onderverdeeld in kationische, amfipathische en hydrofobe CPP's in termen van hun fysisch-chemische eigenschappen12. Onder deze, de positief geladen HIV-TAT peptide en de synthetische polyarginine zijn van aanzienlijk belang in biomedisch onderzoek en zijn uitgebreid bestudeerd om intracellulaire drug deliveryte vergemakkelijken 13. Tunnemann et al. rapporteerden dat een minimale lengte van acht arginines essentieel is voor efficiënte celpenetratie van de synthetische polyargininepeptiden, gebaseerd op een celpermeabiliteitsstudie uitgevoerd met R3 tot R12-peptiden14. Deze CPP's hebben echter over het algemeen een korte plasmahalfwaardetijd vanwege hun snelle hydrolyse in vivo. Bovendien is er weinig bekend over de optimalisatie van de chemische structuur van CPP's om hun transbarrièrevermogen te vergroten, omdat het een uitdaging is om meerdere celmembranen te penetreren15. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die in staat zijn om biologische barrières te penetreren sterk gewenst om de efficiëntie van de medicijnafgifte te verbeteren. In 2020 ontdekten Komin et al.16 een CPP genaamd CL-peptide, dat een helixmotief (RLLRLLR) en een polyargininestaart (R7) bevat voor het kruisen van de epitheliale monolaag. Een reeks CL-peptidevarianten werd ook gesynthetiseerd door het spiraalvormige patroon te veranderen. Deze verkenning zou een belangrijke leidraad kunnen zijn voor de ontwikkeling van nieuwe CPP's voor de levering van ladingen over biologische barrières. Bovendien optimaliseerden Dietrich et al. de celdoorlaatbaarheid van het StAX-peptide, waardoor de Wnt/β-catenine-signaleringsroute werd geremd door de algehele hydrofobiciteit van de peptiden te verhogen17.
Conformatiebeperking van ongestructureerde lineaire peptiden door cyclisatie is een effectieve manier om hun proteolytische stabiliteit en permeabliteit te verbeteren18,19,20. De structurele versterking verhoogt de proteaseweerstand van cyclische peptiden, waardoor ze in vivo stabieler zijn in vergelijking met hun lineaire tegenhangers. Bovendien kan de cyclisatie van peptiden mogelijk de polaire peptide-ruggengraat maskeren door intramoleculaire waterstofbinding te bevorderen, waardoor de membraandoorlaatbaarheid van de peptiden wordt verhoogd21. In de afgelopen twee decennia zijn chemoselectieve cyclisatiemethoden effectieve strategieën geworden voor de constructie van cyclische peptiden met verschillende architecturen, zoals all-hydrocarbon, lactam, triazole, m-xyleen, perfluoroaryl en andere cross-links22,23. De biologische barrière opgelegd door de geavanceerde tumormicro-omgeving zou de penetratie van geneesmiddelen in solide tumoren kunnen verminderen24. We hebben eerder ontdekt dat de cyclische CPP's een superieure weerstand tegen enzymatische spijsvertering vertoonden ten opzichte van hun lineaire tegenhangers20. Bovendien is de algehele hydrofobiciteit van de peptiden van cruciaal belang voor hun verbeterde celdoorlaatbaarheid22. Op basis van de hierboven besproken studies kan de combinatie van een positief geladen patroon, verhoogde algehele hydrofobiciteit en verbeterde proteolysestabiliteit worden verondersteld om de permeabiliteit van CPP's over biologische barrières heen te vergroten. In een recente studie identificeerden we twee cyclische CPP's met aromatische crosslinks op posities i en i + 7 die een verbeterde permeabiliteit in tumorcellen en weefsels vertonen in vergelijking met hun lineaire tegenhangers15. Hier wordt een beknopt synthetisch protocol gepresenteerd voor de synthese van fluorescerend gelabelde cyclische CPP's en de belangrijkste stappen om hun permeabiliteit te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>Aladdin</td><td>K1722093</td><td>stinkstof</td></tr><tr><td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N'N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td><td>HEOWNS</td><td>A-0443697</td><td></td></tr><tr><td>4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl</td><td>TCI</td><td>B1921</td><td></td></tr><tr><td>4T1 cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>4T1-cellen werden gekweekt in DMEM-medium aangevuld met 10% FBS (Hyclone) in een 37 &deg;C bevochtigde incubator met 5% CO2.</td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Adamas</td><td>1484971</td><td>toxiciteit</td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>Energie</td><td>W330229</td><td>schadelijk voor de huid</td></tr><tr><td>Di-ethylether</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>ontbrandbaar</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Beyotime</td><td>ST038</td><td>schadelijk voor de huid</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd adelaarsmedium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massaspectrometer voor elektrospray-ionisatie</td><td>Waters</td><td>G2-S Tof</td><td></td></tr><tr><td>Etheen-diaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>BioFroxx</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne isothiocyanaaat isomer (FITC)</td><td>Energie</td><td>E0801812500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer 7</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>HEOWNS</td><td>F-81070</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>GL Biochem</td><td>GLS201115-35202</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-&beta;Ala-OH</td><td>Adamas</td><td>51341C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-cellen</td><td>ATCC</td><td></td><td>HeLa-cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS (Hyclone) in een 37 &deg;C bevochtigde incubator met 5% CO2.</td></tr><tr><td>Hogedrukvloeistofchromatografie</td><td>Agilent</td><td>Agilent 1260</td><td></td></tr><tr><td>Hogedrukvloeistofchromatografiekolom</td><td>Agilent</td><td>Poroshell EC-C18 120, 4,6 &times; 150 mm (poregrootte 120 &Aring;, deeltjesgrootte 4 &mu;m)</td><td></td></tr><tr><td>Lyofilisaat</td><td>SP Scientific</td><td>Vir Tis</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxiciteit</td></tr><tr><td>Microtiterplaat</td><td>Thermo &mu;drop plate</td><td>N12391</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>HEOWNS</td><td>M99040</td><td>irriterend</td></tr><tr><td>Multi-technologie microplaatlezer</td><td>Thermo</td><td>VARIOSKAN LUX</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>HEOWNS</td><td>E-81416</td><td>irriterend</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Energie</td><td>B020051</td><td>schadelijk voor de huid</td></tr><tr><td>Poly-Prep kolom</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>polypropyleen chromatografiekolommen</td></tr><tr><td>Rink Amide MBHA-hars (0,572 mmol/g)</td><td>GL Biochem</td><td>GLS180301-49101</td><td></td></tr><tr><td>Driewegstopkraan</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Inzet voor weefselkweekplaten</td><td>LABSELECT</td><td>14211</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>HEOWNS</td><td>T63278</td><td>corrosief</td></tr><tr><td>Triisopropylsilaan</td><td>HEOWNS</td><td>T-0284475</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>BioFroxx</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum-manifold</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr></tbody></table>

constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Kanker is een grote uitdaging geweest in de wereldwijde gezondheid. De complexe micro-omgeving van de tumor beperkt echter over het algemeen de toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen, wat leidt tot tumorrecidief. Om de beperkte penetratie van biologische barrières te overwinnen, zijn celdoordringende peptiden (CPP's) ontdekt met een uitstekend membraantranslocatievermogen en zijn ze naar voren gekomen als nuttige moleculaire transporters voor het afleveren van verschillende ladingen in cellen. Conventionele lineaire CPP's vertonen echter over het algemeen een gecompromitteerde proteolytische stabiliteit, wat hun permeabiliteit over biologische barrières beperkt. De ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die biologische barrières kunnen binnendringen en een verbeterde proteolytische stabiliteit vertonen, is dus zeer gewenst om de efficiëntie van de toediening van geneesmiddelen in biomedische toepassingen te bevorderen. We hebben eerder een panel van korte cyclische CPP's gesynthetiseerd met aromatische crosslinks, die een superieure permeabiliteit in kankercellen en weefsels vertoonden in vergelijking met hun lineaire tegenhangers. Hier wordt een beknopt protocol beschreven voor de synthese van het fluorescerend gelabelde cyclische polyarginine R8-peptide en zijn lineaire tegenhanger, evenals belangrijke stappen voor het onderzoeken van hun celpermeabiliteit.

In dit protocol werd een synthetische procedure gepresenteerd om de lineaire polyarginine R8 in zijn cyclische vorm te beperken. De SPPS werd handmatig uitgevoerd met behulp van een eenvoudig apparaat (figuur 1). Het gedetailleerde synthetische proces van SPPS is weergegeven in figuur 2. Kortom, de hars was voldoende opgezwollen, gevolgd door deprotection van de N α-Fmoc beschermingsgroep. Vervolgens werd het N-α-Fmoc-beschermde amino...

Dit protocol beschrijft de synthese van cyclische celdoordringende peptiden met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen.

Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Een ernstig obstakel voor de behandeling van kanker is de beperkte toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen als gevolg van fysiologische barrières. De ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die in staat zijn om biologische barrières te behandelen, is dus sterk gewenst om de efficiëntie van de medicijnafgifte te verbeteren. Het doel van deze procedure is om de cyclische celdoordringende peptiden te synthetiseren voor verbeterde cel-tot-cel penetratie.Het voordeel van deze methode is dat de peptidecyclisatie gemakkelijk kan worden bereikt door substitutiereacties met cysteïnes en hars zonder dat er metaalkatalysatoren nodig zijn. De opname van aromatische cross-links verbetert de algehele hydrofobiciteit van de peptiden in vergelijking met de hydrofiele lactam- of triazoolkruisverbindingen, waardoor hun permeabiliteit wordt verbeterd. Monteer om te beginnen het handmatige peptidesyntheseapparaat in de zuurkast.Plaats de driewegkranen op het vacuümspruitstuk en sluit ze aan op stikstof. Zorg ervoor dat u de ongebruikte inlaten afsluit. Bevestig een polypropyleenkolom van 10 milliliter op de driewegkranen en giet het reactiemengsel of de oplosmiddelen uit de polypropyleenkolom af met behulp van een rubberen pipetbol of een vacuüm via een afvalvanger.Om de hars voor te bereiden op peptidesynthese, voegt u 4 tot 5 milliliter DMF toe aan de vereiste hoeveelheid hars en brengt u deze over naar de polypropyleenkolom met zachte stikstof die gedurende 30 minuten borrelt om de hars voldoende op te zwellen. Giet de DMF af en voeg 4 tot 5 milliliter 50%morfoline/DMF toe aan de hars. Bor stikstof voorzichtig gedurende 30 minuten om de N-terminale Fmoc-groep te verwijderen en laat het mengsel vervolgens uitlekken.Was de hars drie keer grondig door 4 tot 5 milliliter DMF aan de kolom toe te voegen en elke keer minstens 1 minuut met stikstof te borrelen. Was de hars op dezelfde manier drie keer met dichloormethaan en drie keer met DMF. Los vervolgens 648,8 milligram Fmoc en PBF-beschermde arginine en 372,6 milligram HATU op in 5 milliliter DMF in een centrifugebuis.Voeg 348,4 microliter DIPEA toe om de koppelingsreactie te activeren en breng het reactiemengsel over naar de polypropyleenkolom met hars. Roer het mengsel voorzichtig met borrelende stikstof gedurende 1 tot 2 uur en herhaal de koppelingsreactie dan eenmaal. Giet het reactiemengsel af en was de hars achtereenvolgens met DMF, dichloormethaan en nogmaals DMF drie keer elk gedurende ten minste 1 minuut per keer.Verwijder de Fmoc-beschermende groep en was de hars volgens de eerder getoonde procedure voordat u doorgaat met het koppelen van het volgende aminozuur. Koppel vervolgens de bèta-alanine als een afstandhouder voor FITC-etikettering met behulp van hetzelfde proces dat wordt getoond voor aminozuurkoppeling en voeg vervolgens een mengsel van FITC, DIPEA en DMF toe aan de polypropyleenkolom in het donker om FITC-etikettering van peptiden op de hars uit te voeren. De reactie zou bijna 8 uur duren.Om de cyclisatie van het lineaire peptide uit te voeren, voegt u gedurende 2 minuten een mengsel van trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan en dichloormethaan toe aan de polypropyleenkolom om selectief de trityl-beschermende groep cysteïne te verwijderen. Giet het mengsel af en herhaal de procedure totdat de gelige oplossing kleurloos wordt om de trityl-beschermende groep volledig te verwijderen. Voer opeenvolgende wasbeurten van de hars uit met DMF en dichloormethaan ten minste drie keer en los 4, 4'bis-broommethyl-bifenyl op in DMF met DIPEA.Voeg de oplossing toe aan de kolom en reageer gedurende 4 uur. Was de hars met 4 tot 5 milliliter methanol twee keer gedurende vijf minuten elk en droog het met een continue stroom stikstof. Voor peptiden die cysteïnes bevatten, behandel de hars met een effectieve splitsingscocktail van trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan en water of trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan, 1, 2-ethanedithiol en water.Behandel de peptidegebonden hars gedurende 2 tot 3 uur om het peptide te splitsen en verwijder vervolgens het trifluorazijnzuur voorzichtig met een stroom stikstof. Om de ruwe peptiden te verkrijgen, voegt u 4 tot 5 milliliter diethylether toe aan het gekloofde peptidepreparaat om de ruwe peptiden neer te slaan en centrifugeert u gedurende 4 minuten op 10.000 x g. Gooi het supernatant voorzichtig weg en droog het peptide gedurende 3 minuten aan de lucht in een effectieve zuurkast.Los het kleinschalige ruwe peptide op in 800 microliter acetonitril en analyseer het vervolgens met behulp van omgekeerde fase high-performance vloeistofchromatografie en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Ent 100.000 HeLa-cellen in 2 milliliter DMEM in een 12-putkamer met een weefselkweekplaatinzet en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verwijder het medium en incuber de cellen in de kamers met 1 milliliter 10 micromolaire FITC-R8 of FITC-sR8-4 in FBS-vrije DMEM gedurende 1 uur.Verwijder daarna het medium met de peptiden en was de cellen drie keer met 1 milliliter PBS. Voeg 1 milliliter verse FBS-vrije DMEM toe aan de kamers en co-incubeer vervolgens de HeLa-cellen in de kamer met de weefselkweekplaatinzet, met de HeLa-cellen op de ronde coverslips aan de onderkant gedurende 2 uur. Bevestig de HeLa-cellen op de ronde coverslips met 2,5% glutaaraldehyde gedurende 15 minuten en kleurt de cellen vervolgens gedurende 15 minuten met DAPI.Observeer ten slotte de HeLa-cellen op de coverslips onder een fluorescentiemicroscoop. Een schematisch diagram van de synthese van FITC-gelabeld lineair R8-peptide en FITC-gelabeld genietbaar R8-peptide wordt hier gepresenteerd. De HPLC- en MS-spectra van het lineaire R8-peptide en het nietje R8-peptide zijn in deze figuur weergegeven.De retentietijd van het geniete peptide was aanzienlijk langer dan die van het lineaire analoog, wat wijst op een verhoogde algehele hydrofobiciteit van het peptide na cyclisatie met de hydrofobe crosslink. Deze grafische afbeelding toont de stabiliteit van het lineaire peptide en het geniete peptide in aanwezigheid van 25% FBS. De cyclische R8 blijft 77,3% intact na incubatie met FBS gedurende 4 uur, terwijl zijn lineaire tegenhanger grotendeels werd afgebroken, wat wijst op een verbeterde proteolytische stabiliteit van het cyclische R8-peptide.Live-cell fluorescentiemicroscopiebeelden van HeLa-cellen en 4T1-cellen na 1 uur incubatie met 3 micromolair FITC-gelabeld lineair R8-peptide en FITC-gelabeld genietbaar R8-peptide worden hier getoond. Het is te zien dat de cellen behandeld met cyclisch R8 met aromatische cross-link een hogere intracellulaire fluorescentie vertoonden dan die behandeld met hun lineaire tegenhanger. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met flowcytometrie-analyse.Om verder te onderzoeken of cyclisch R8 een verbeterde cel-tot-cel penetratie verleent, werden transwell-modellen gebruikt om de barrièrepermeabiliteit van de peptiden van de ene cellaag naar de andere te simuleren. De cyclische R8 vertoonde duidelijk een hogere trans-barrièrepenetratie dan het lineaire R8-peptide, zoals aangegeven door een significante toename van intracellulaire fluorescentie. Volledige deprotectie van de tritylgroep van cysteïne en hars is belangrijk voor de volgende cyclisatiestap.Bovendien hangt de cyclisatie-efficiëntie ook af van de specifieke sequenties en de lengtes van de peptiden als gevolg van sterische effecten. In een dergelijk geval zou het nuttig zijn om een hars met een lager laadvermogen of cyclisatie van de peptiden onder verdunde concentraties in de oplossingsfase te gebruiken. Deze cyclische peptiden vertoonden een verbeterde cel-tot-cel permeabiliteit in vergelijking met hun lineaire tegenhangers.Wij geloven dat ze een grote belofte inhouden voor het overwinnen van biologische barrières en zullen worden gebruikt voor een moleculaire voor verdere toepassingen op het gebied van medicijnafgifte.

construction-cyclic-cell-penetrating-peptides-for-enhanced

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Eiwit transductie maakt de directe levering van biologisch actieve eiwitten in cellen. In tegenstelling tot conventionele methoden, zoals DNA-transfectie of virale transductie deze niet-invasieve paradigma maakt zeer efficiënte cellulaire manipulatie in een titreerbare manier te omzeilen cellulaire toxiciteit en het risico van oncogene transformatie door permanente genetische modificatie.

Technische Cel-permeabel Protein

Dit protocol details een methode voor de kwantitatieve meting van peptide translocatie in grote unilamellaire lipide blaasjes. Deze methode biedt ook informatie over de snelheid van de membraan translocatie en kan worden gebruikt om peptiden die efficiënt en spontaan kruisen lipidendubbellagen te identificeren.

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

This video demonstrates a technique that uses biotinylated cell-penetrating peptides to detect intracellular protein-protein interactions. The cell-penetrating peptides facilitate the conjugated peptide to enter a cell and specifically bind to its interacting proteins. The biotin, after binding to avidin, allows purification of the interacting proteins’ complex from a cell lysate.

Biotinylated Cell-Penetrating Peptide Probe to Detect Protein-Protein Interactions

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Zijn<sub&gt; 2</sub&gt; Zinkvinger Domeinen

Een eenvoudige en algemene methode voor de synthese van cyclische peptiden met behulp van microgolfbestraling wordt geschetst. Deze procedure maakt de synthese mogelijk van cyclische peptiden met een ruggengraat met verschillende conformatieën, terwijl de zijketens en de farmacofore groepen behouden blijven en daarom, maakt het mogelijk om te screenen op de bioactieve conformatie.

Ontwikkeling van een Backbone cyclisch peptide bibliotheek als potentieel antiparasitaire Therapeutics behulp van microgolfstraling

Dit is een protocol bij het bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op het systeem van de Biotine-avidin-pull-down met de nieuwigheid van het combineren van cel-penetrating sequenties. Het belangrijkste voordeel is dat de volgorde van de doelgroep is geïncubeerd met levende cellen in plaats van de cel lysates en daarom de interacties in het cellulaire kader zal optreden.

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Hier gepresenteerd zijn protocollen voor de creatie van peptide-gebaseerde kleine unilamellaire blaasjes in staat van groei. Om de vesiculo productie van het membraan peptide te vergemakkelijken, zijn deze blaasjes uitgerust met een transcriptie-vertaalsysteem en de peptide-encoding plasmide.

In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei

We beschrijven protocollen voor het beoordelen van de mate van transductie door cel-penetrerende peptiden met behulp van ex vivo imaging systemen, gevolgd door paraffine inbedding, sectie, en confocale fluorescerende microscopie met behulp van cardiale targeting peptide als voorbeeld. In ons protocol kan één dier worden gebruikt om beide soorten beeldvormingsbeoordeling van dezelfde organen te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor studies met de helft wordt gehalveerd.

In Vivo Beeldvorming van transduction efficiëntie van cardiale targeting Peptide

De fluorescentielekkagetest is een eenvoudige methode die het onderzoek van peptide / membraaninteracties mogelijk maakt om hun betrokkenheid bij verschillende biologische processen te begrijpen en vooral het vermogen van cel-penetrerende peptiden om fosfolipiden bilayers te verstoren tijdens een direct cellulair translocatieproces.

Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Dit protocol presenteert de synthese van cyclische peptiden via bisalkylering tussen cysteïne en methionine en de gemakkelijke thiol-yne-reactie veroorzaakt door het propargylsulfoniumcentrum.

Cyclische peptiden construeren met behulp van een on-tether sulfoniumcentrum

Dit protocol heeft tot doel biofunctionele zelfassemblerende peptiden te evalueren voor celadhesie, organoïde morfologie en genexpressie door immunokleuring. We zullen een colorectale kankercellijn gebruiken om een kosteneffectieve manier te bieden om organoïden te verkrijgen voor intensieve tests.

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

Leer de synthese van cyclische celdoordringende peptiden met aromatische kruisverbindingen voor verbeterde penetratie van biologische barrières. Deze methode zonder metalen katalysatoren verhoogt hydrofobiciteit en verbetert efficiëntie van medicijnafgifte aan tumorcellen.

Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

Meer video's verkennen