Name: Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Leer caspase-activering evalueren om aangeboren immuunceldood te beoordelen bij infecties en kanker. Deze methode biedt inzicht in ziekteprocessen en ondersteunt therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken leden van het Kanneganti-lab voor hun opmerkingen en suggesties, en we bedanken J. Gullett, PhD, voor wetenschappelijke bewerkingsondersteuning. Het werk in ons lab wordt ondersteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 en CA253095 (aan T.-D.K.) en door de Amerikaanse Libanese Syrian Associated Charities (aan T.-D.K.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

T.-D.K. is consultant voor Pfizer.

Het monitoren van caspase splitsing en activering biedt een van de meest uitgebreide beelden van aangeboren immuun PCD-activering als onderdeel van de aangeboren immuunrespons. Het hier beschreven protocol demonstreert een strategie om caspase-activering te controleren als reactie op IAV-, HSV1- en F. novicida-infecties en de steriele trigger LPS + ATP, maar tal van andere stimuli kunnen PCD induceren en kunnen in deze methode worden gebruikt, zoals is aangetoond in verschillende publicaties 44,48,49,50,51,52,53...

Het aangeboren immuunsysteem fungeert als de eerste verdedigingslinie tijdens infectie en als reactie op steriele stimuli, zoals weefselbeschadiging en veranderingen in homeostase. Aangeboren immuunsensoren op het celoppervlak en in het cytoplasma reageren op pathogene of schade-geassocieerde moleculaire patronen (respectievelijk PAMPs of DAMPs) om ontstekingssignaleringsroutes en cellulaire reacties te activeren. Een van de belangrijkste processen van de aangeboren immuunrespons is de inductie van celdood om geïnfecteerde of beschadigde cellen te verwijderen en verdere aangeboren en adaptieve immuunresponsen te stimuleren. Geprogrammeerde celdood (PCD) is een zeer geconserveerd proces tussen soorten, wat het evolutionaire belang ervan als een aangeboren immuunmechanisme benadrukt.
Er zijn verschillende aangeboren immuun PCD-routes die in alle celtypen kunnen worden geactiveerd. Caspasen zijn een belangrijke familie van sterk geconserveerde, intracellulaire, cysteïne-afhankelijke proteasen die van cruciaal belang zijn voor veel PCD-routes, waaronder de traditioneel niet-inflammatoire apoptoseroute, evenals inflammatoire PCD-routes zoals pyroptose, necroptose en PANoptose 1,2,3,4,5 . Er zijn 11 menselijke en 10 muriene caspasen die goed gedefinieerd zijn, evenals pseudo-caspasen die functioneel kunnen zijn, en de meeste worden constitutief uitgedrukt als inactieve monomere of dimerische pro-caspasen die decolleté vereisen voor activering 6,7. Caspasen bevatten ook belangrijke domeinen voor de rekrutering en vorming van multiproteïnecomplexen. Deze omvatten het caspase-activerings- en rekruteringsdomein (CARD), dat te vinden is in caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 en caspase-11, of het death effector-domein (DED), dat wordt gevonden in caspase-8 en caspase-10. Door zowel hun proteolytische activiteit als hun vermogen om multiproteïnecomplexen te vormen, zijn caspasen kritieke aanjagers van aangeboren immuun-PCD.
De rol van caspasen in aangeboren immuun-PCD werd voor het eerst geïdentificeerd in apoptose, waarbij de initiator caspases, caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10, de beul caspases, caspase-3, caspase-6 en caspase-7 activeren om celdood 8,9,10,11,12 te veroorzaken. Initiator caspasen kunnen worden geactiveerd door diverse signaalcascades; De extrinsieke route activeert caspase-8 door extracellulaire ligand-geïnduceerde doodsreceptorsignalering en de intrinsieke route activeert caspase-9 door de verstoring van mitochondriale integriteit13. Geactiveerde initiator caspasen splitsen de linker en scheiden de grote en kleine katalytische subeenheden van beul caspasen om hun actieve vormen te produceren. De caspasen van de beul splitsen vervolgens hun substraten om de cel te demonteren, wat resulteert in DNA-degradatie, membraanblebbing, nucleaire fragmentatie en het vrijkomen van apoptotische lichamen14,15. Dit proces eindigt meestal in een niet-lytische en niet-inflammatoire vorm van celdood in combinatie met de onmiddellijke klaring van de stervende cellen door efferocytose16. Defecten in efferocytose of een gebrek aan fagocytische cellen kunnen echter leiden tot de accumulatie van apoptotische cellen, die vervolgens lytische en inflammatoire celdood ondergaan17,18.
De inflammatoire caspasen, waaronder caspase-1 (mens en muis), caspase-4 en caspase-5 (menselijk) en caspase-11 (muis), zijn ontdekt te worden geactiveerd tijdens een vorm van inflammatoir aangeboren immuun PCD (III-PCD) genaamd pyroptose. Caspase-1-activering is geassocieerd met de vorming van inflammasomen, multiproteïnecomplexen die een cytosolische aangeboren immuunsensor, een adaptermolecuul (apoptose-geassocieerd speck-achtig eiwit met een CARD [ASC]) en caspase-1 bevatten. De vorming van dit complex stelt caspase-1 in staat om nabijheidsgemedieerde autoproteolyse te ondergaan om zijn actieve vorm vrij te geven, die doelsubstraten kan splitsen, waaronder de pro-inflammatoire cytokines interleukine (IL) -1β en IL-18 en het porievormende molecuul gasdermine D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, caspase-4 en caspase-5 kunnen GSDMD ook activeren zonder de stroomopwaartse vorming van het inflammasoom na het detecteren van PAMP's zoals lipopolysaccharide (LPS)19,20. Deze caspasen ondergaan dimerisatie gevolgd door oligomerisatie en zelfsplitsing voor activering na binding aan cytosolisch LPS, wat leidt tot niet-canonieke inflammasoomactivering24,25,26 en caspase-1 activering op een celintrinsieke manier om IL-1β en IL-18 rijping20 te induceren. De rijping en afgifte van deze pro-inflammatoire cytokines karakteriseren deze caspasen als 'inflammatoir'. Bovendien is gebleken dat de apoptotische caspase-8 zich lokaliseert naar het inflammasoom, waardoor een verband wordt gelegd tussen apoptotische en pyroptotische processen. Studies hebben aangetoond dat de apoptotische caspase-8 ook van cruciaal belang is voor het reguleren van een andere vorm van PCD genaamd necroptose. Het verlies van caspase-8 resulteert in spontane receptor-interagerende serine-threonine kinase 3 (RIPK3)-gemedieerde gemengde lineage kinase domein-like pseudokinase (MLKL) activering om de III-PCD route van necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35 aan te sturen.
Hoewel caspasen historisch zijn geclassificeerd als "apoptotisch" of "inflammatoir" op basis van het type celdood dat ze initiëren, suggereert groeiend bewijs dat er uitgebreide overspraak is tussen de aangeboren immuun-PCD-routes door caspasen 3,4. Bijvoorbeeld, de inflammatoire caspase-1 van inflammasomen splitst de apoptotische caspase-7 op zijn canonieke activeringsplaats34. Caspase-1 activering kan ook leiden tot de splitsing van apoptotische substraten zoals poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)36. In cellen zonder GSDMD kan caspase-1 ook caspase-337,38 splijten. Bovendien kan de canoniek apoptotische caspase-3 gasdermin E (GSDME) splitsen om PCD17,18 te induceren en verwerkt ook GSDMD in een inactieve vorm40. Verder is caspase-8 rekrutering voor het inflammasoomcomplex waargenomen 39,40,41,42,43,44,45, en caspase-8 is een belangrijke regulator van canonieke en niet-canonieke inflammasoomactivatie 39. Er zijn ook overlappende en redundante rollen voor caspase-8 en caspase-1 in veel ontstekingsaandoeningen, en aangeboren immuun-PCD gekenmerkt door de activering van pyroptotische, apoptotische en necroptotische componenten komt voor in het ziektespectrum 39,46,47,48,49,50.
Op basis van deze overspraak tussen inflammatoire en apoptotische caspasen werd een belangrijke kloof in het mechanistische begrip van aangeboren immuniteit en PCD geïdentificeerd, wat leidde tot de ontdekking van PANoptose. PANoptose is een unieke vorm van III-PCD die wordt geactiveerd als reactie op pathogenen, PAMP's, DAMP's en veranderingen in homeostase en wordt gereguleerd door PANoptosomen - veelzijdige macromoleculaire complexen die componenten van andere celdoodroutes integreren 44,50,51,52,53,54,55 . De totaliteit van de biologische effecten in PANoptose kan niet individueel worden verklaard door pyroptose, apoptose of necroptose alleen 3,4,35,36,39,46,47,48, aangezien PANoptose wordt gekenmerkt door de activering van meerdere caspasen, waaronder caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 en/of caspase-7, afhankelijk van de context 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose is in toenemende mate betrokken bij infectie- en ontstekingsziekten, evenals bij kankers en kankertherapieën 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Gezien de essentiële rol van caspasen in celdoodroutes, waaronder apoptose, pyroptose, necroptose en PANoptose, is het belangrijk om technieken te ontwikkelen om hun activering te karakteriseren en de volledige complexiteit van de PCD-routes te begrijpen. Het protocol beschrijft hier een methode om cellen te stimuleren en de daaropvolgende activering van caspasen te meten (figuur 1). Deze methode maakt gebruik van de proteolytische splitsing van caspasen, die over het algemeen nodig is voor hun activering, als een middel om ze te bestuderen. Door middel van western blotting kunnen de eiwitgroottes worden bepaald, waardoor de inactieve pro-caspasen en hun geactiveerde, gesplitste vormen duidelijk kunnen worden gevisualiseerd en gedifferentieerd.
De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn 1) het vermogen om de activering van meerdere caspasen parallel van een enkele populatie van endogene cellen te beoordelen om pcd-activering nauwkeuriger te bepalen en 2) het gebruik van relatief eenvoudige laboratoriumtechnieken die geen uitgebreide training of dure apparatuur vereisen. Eerdere protocollen hebben westerse blotting, fluorescerende reporters of antilichaamkleuring gebruikt om caspase-activering in kweeksupernatanten, cel- en weefsellysaten, hele cellen via microscopie en in vivo 67,68,69,70,71 te controleren, maar deze technieken controleren over het algemeen slechts één of twee caspasen in een monster. Bovendien, terwijl synthetische peptidesubstraten die caspasesplitsingsplaatsen bevatten die fluoresceren bij splitsing zijn gebruikt om caspase-activering in cel- of weefsellysaten te controleren69, kunnen deze substraten vaak door meer dan één caspase worden gesplitst, waardoor het moeilijk is om de specifieke activering van individuele caspasen in dit systeem te bepalen. Bovendien stelt het gebruik van western blotting in plaats van het gebruik van fluorescerende reporters of andere op tags gebaseerde methoden onderzoekers in staat om endogene cellen te gebruiken in plaats van specifieke cellijnen te maken met reportergenen. Er zijn meerdere voordelen aan het gebruik van endogene cellen, waaronder het feit dat veel vereeuwigde cellijnen een tekort hebben aan belangrijke celdoodmoleculen72,73, wat de resultaten zou kunnen beïnvloeden. Bovendien maakt het gebruik van endogene cellen de evaluatie van verschillende celtypen mogelijk, zoals macrofagen, epitheelcellen en endotheelcellen, in plaats van een enkele afstamming. Western blotting is ook een relatief eenvoudige en kosteneffectieve techniek die kan worden uitgevoerd in laboratoria over de hele wereld zonder de noodzaak van grote, dure apparatuur of gecompliceerde opstellingen.
Dit protocol is breed toepasbaar in de biologie om zowel de celdoodafhankelijke als celdoodonafhankelijke functies van caspasen te begrijpen, inclusief hun steigerrollen en functies in andere ontstekingssignaleringsroutes74. Het toepassen van deze methode maakt een uniforme aanpak mogelijk in de studie van aangeboren immuun-PCD-routes en ontstekingssignalering tussen ziekten en aandoeningen, en dit protocol kan worden gebruikt om kritieke regulerende processen en mechanistische verbindingen te identificeren die de ontwikkeling van toekomstige therapeutische strategieën zullen informeren.

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu;m filter</td><td>Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>12% polyacrylamide gel with 10 wells&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate&nbsp;</td><td>Corning</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G needle&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m cell strainer&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>150 mm tissue culture dishes</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>182-cm2 tissue culture flask</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>Accessory white trans tray</td><td>Cytiva</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;caspase-1 antibody</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;caspase-11 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;caspase-3 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;caspase-7 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;caspase-8 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;caspase-9 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;cleaved caspase-3 antibody&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;cleaved caspase-7 antibody&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;cleaved caspase-8 antibody&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash;&beta;-Actin antibody (C4) HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase Soy Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Bead bath</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229315</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescence imager (Amersham 600)&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;chamber</td><td>VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Eelectrophoresis apparatus&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Francisella novicida (U112 strain)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>Gel releaser&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>Herpes simplex virus 1 (HF strain)</td><td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>Human anti&ndash;caspase-1 antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>Human anti&ndash;caspase-8 antibody</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&nbsp;</td><td>constructed per Hoffmann et al.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L929 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>cell line for creating L929-conditioned media</td></tr><tr><td>L-cysteine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP376-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP substrate</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td>standard-sensitivity HRP substrate</td></tr><tr><td>MDCK cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>cell line for determining IAV viral titer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nonfat dried milk powder</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40 solution&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Power source&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablet</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Rocking shaker</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma

evaluatie van caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Aangeboren immuniteit biedt de kritieke eerste verdedigingslinie als reactie op ziekteverwekkers en steriele beledigingen. Een belangrijke mechanistische component van deze respons is de initiatie van aangeboren immuungeprogrammeerde celdood (PCD) om geïnfecteerde of beschadigde cellen te elimineren en immuunresponsen te verspreiden. Overtollig PCD wordt echter geassocieerd met ontsteking en pathologie. Daarom is het begrijpen van de activering en regulatie van PCD een centraal aspect van het karakteriseren van aangeboren immuunresponsen en het identificeren van nieuwe therapeutische doelen in het hele ziektespectrum.
Dit protocol biedt methoden voor het karakteriseren van aangeboren immuun-PCD-activering door caspasen te monitoren, een familie van cysteïne-afhankelijke proteasen die vaak worden geassocieerd met verschillende PCD-routes, waaronder apoptose, pyroptose, necroptose en PANoptose. Eerste rapporten karakteriseerden caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10 als initiator caspases en caspase-3, caspase-6 en caspase-7 als effector caspases in apoptose, terwijl latere studies vonden dat de inflammatoire caspasen, caspase-1, caspase-4, caspase-5 en caspase-11, pyroptose veroorzaken. Het is nu bekend dat er uitgebreide overspraak is tussen de caspasen en andere aangeboren immuun- en celdoodmoleculen over de eerder gedefinieerde PCD-routes, waardoor een belangrijke kenniskloof wordt geïdentificeerd in het mechanistische begrip van aangeboren immuniteit en PCD en leidt tot de karakterisering van PANoptose. PANoptose is een unieke aangeboren immuuninflammatoire PCD-route gereguleerd door PANoptosoomcomplexen, die componenten, waaronder caspasen, van andere celdoodroutes integreren.
Hier worden methoden gegeven voor het beoordelen van de activering van caspasen als reactie op verschillende stimuli. Deze methoden maken de karakterisering van PCD-routes mogelijk, zowel in vitro als in vivo, omdat geactiveerde caspasen proteolytische splitsing ondergaan die kan worden gevisualiseerd door western blotting met behulp van optimale antilichamen en blottingcondities. Er zijn een protocol en western blotting workflow opgesteld die de beoordeling van de activering van meerdere caspasen uit dezelfde cellulaire populatie mogelijk maken, waardoor een uitgebreide karakterisering van de PCD-processen wordt geboden. Deze methode kan worden toegepast op onderzoeksgebieden in ontwikkeling, homeostase, infectie, ontsteking en kanker om PCD-routes te evalueren tijdens cellulaire processen in gezondheid en ziekte.

PANoptosis is waargenomen als reactie op talrijke bacteriële, virale en schimmelinfecties en andere ontstekingsstimuli, evenals in kankercellen 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <...

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Dit protocol biedt een veelzijdig begrip van de activering van celdoodprocessen, wat kritische inzichten kan bieden in ziektemechanismen en therapeutische strategieën kan informeren. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van een eenvoudigere techniek en om toegang te krijgen tot de activering van meerdere caspasen die noodzakelijk zijn vanuit een enkele populatie van endogene cellen om de activering sterk te bepalen. Aangeboren immuunceldood is betrokken bij het hele ziektespectrum, van infecties tot ontstekingsziekten tot kankers.Het begrijpen van de moleculaire mechanismen van celdood door caspase-activering kan kritische inzichten bieden in ziekteprocessen. Dr. Julieann, een postdoctoraal onderzoeksmedewerker van een laboratorium, zal de procedure demonstreren. Na het isoleren van het beenmerg en het differentiëren van de BMDM's, infecteert u de cellen met het influenza A-virus.Bereken het virusvolume dat nodig is bij een infectiemultipliciteit van 20 plaquevormende eenheden. Verwijder de media uit de BMDM's en was de cellen eenmaal met 500 microliter PBS. Voeg 450 microliter Influenza A-virus in DMEM met hoge glucose zonder warmte-geïnactiveerde FBS toe aan elke put en incub

evaluation-of-caspase-activation-to-assess-innate-immune-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

This video demonstrates the assessment of multiple caspase activations in bone marrow-derived macrophages through stimulation with the influenza virus. Following macrophage lysis, heat-inactivation of lysate, and centrifugation, intracellular caspases are collected for subsequent immunological analysis.

Assessment of the Activation of Multiple Caspases in Macrophages

Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.

In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Hier wordt een experimentele workflow gepresenteerd die de detectie van caspase-8-verwerking direct bij het death-inducerende signaleringscomplex (DISC) mogelijk maakt en de samenstelling van dit complex bepaalt. Deze methodologie heeft brede toepassingen, van het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van celdoodroutes tot de dynamische modellering van apoptosenetwerken.

Het meten van de samenstelling van cd95-doodsopwekkend signaleringscomplex en verwerking van procaspase-8 in dit complex

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Influenza A-virus (IAV) -infectie activeert de caspasen die gastheer en virale eiwitten splitsen, die op hun beurt pro- en antivirale functies hebben. Door gebruik te maken van remmers, RNA-interferentie, site-gerichte mutagenese en western blotting en RT-qPCR-technieken, werden caspasen geïdentificeerd in geïnfecteerde zoogdiercellen die gastheercorticonctine en histondeacetylasen splitsen.

Het identificeren van caspasen en hun motieven die eiwitten splitsen tijdens influenza A-virusinfectie

Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.

Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Leer caspase-activering evalueren om aangeboren immuunceldood te beoordelen bij infecties en kanker. Deze methode biedt inzicht in ziekteprocessen en ondersteunt therapeutische strategieën.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Meer video's verkennen