Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen
7 april 2023
Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.
Ons protocol biedt gedetailleerde 2D-mapping van fosforescentielevensduur en zuurstofconcentratie in macroscopische objecten, met name levend dierlijk weefsel en hele dieren, door middel van speciale sondes en detectiematerialen. Deze informatie is belangrijk voor veel onderzoeksgebieden. Ons protocol maakt gebruik van een geïntegreerde en compacte beeldvormingsmodule die werkt in TCSPC-modus en biedt eenvoudige en nauwkeurige visualisatie van levensduur en zuurstofverdeling in complexe biologische monsters, zoals levensweefsel.
Neem de Cricket adapter en inspecteer deze van verschillende kanten. Verwijder de C-mount adapter aan de voorzijde om de Photonis PP0360EF versterker in de Cricket te laten zien en plaats vervolgens de C-mount adapter terug. Verwijder de C-mount adapter aan de voorzijde van de Cricket en plaats het 650 plus/minus 50 nanometer emissiefilter.
Repareer het door de C-mount terug te plaatsen. Sluit vervolgens de TPX-cameramodule met drie nokken aan op de achterkant van de Cricket-module via hun ringadapters. Sluit de lens aan op de voorkant van de Cricket-module via de C-mount adapter.
Sluit de LED aan op een voeding en een pulsgenerator. Monteer nu de 390-nanometer superheldere LED op een paal die is bevestigd aan een breadboard in de zwarte doos. Schakel de LED in en focus deze om een effectieve en uniforme excitatie van het afgebeelde monster te garanderen.
Monteer de camera-assemblage bovenop de optische zwarte doos naar beneden gericht naar het podium waar de monsters worden afgebeeld. Sluit de camera en LED aan op generatoren met twee pulsen en een vierkanaals oscilloscoop. Met behulp van instellingen op de oscilloscoop en pulsgeneratoren synchroniseert u de pulsen die naar de camera en de LED worden verzonden.
Gebruik de speciale kabel en aansluiting op de Cricket-eenheid om de versterker aan te sluiten op een standaardvoeding en stel de versterking in op 2,7 volt. Plaats het monster voor de cameralens. Schakel vervolgens de camera en alle elektrische modules in, behalve de versterker.
Activeer de SOFI-software om de operationele parameters af te stemmen, zoals scherpstellen en sample-uitlijning. Stel in de modules de framebelichting in op 0,01 seconden. Selecteer Oneindige frames en stel de pixelbewerkingsmodus in op tijd boven drempel.
Ga vervolgens naar Voorvertoning en selecteer Actieve module om het venster Medipix / Timepix-frames te openen. Pas in de volgende stap, na het starten van de opname, de kleurenschaal aan en roteer de afbeelding naar de gewenste oriëntatie. Schakel daarna de lichten in de kamer uit en schakel de versterker in.
Focus de camera-optiek op het voorbeeldpodium met de scherpstelmogelijkheden van de lens en Cricket-adapter om heldere beelden van monsters met een goed contrast en helderheid te genereren. Zodra de focus is voltooid, sluit u de SOFI-software. Ga vervolgens naar de terminal, voer de opdrachten van de op maat gemaakte ontwerpsoftware uit om de onbewerkte gegevens in het binaire formaat te verkrijgen en sluit de terminal.
Open een nieuwe terminal om de verkregen gegevens te verwerken. Laad het gegevensbestand en voer het gegevensreducer uit. Analyseer de nabewerkingsgegevens met een speciaal programma geschreven in C-taal dat de gegevens in een ICS-afbeeldingsbestand schrijft.
Open vervolgens de ICS-afbeeldingsbestanden met behulp van de vrij beschikbare Time Resolved Imaging-software en gebruik twee exponentiële functies om het fosforescentieverval aan te passen. Open ten slotte de Fitted. ICS-afbeeldingsbestanden met de beschikbare beeldanalysesoftware.
Genereer fosforescentielevensduurafbeeldingen met behulp van opzoektabellen en codeer ze in pseudo-kleurenschaal. Gebruik de functie Meten om de gemiddelde levensduurwaarden voor de gehele afbeelding of interessegebieden te berekenen. Fosforescentie-intensiteit en fosforescentie lifetime imaging microscopiebeelden van de platina octaethylporfyrine kleurstofsensorvlek in de zuurstofrijke en zuurstofarme toestanden worden getoond.
Zorg ervoor dat het juiste emissiefilter in de Cricket is gemonteerd en dat de juiste LED, kabelverbindingen en pulsinstellingen worden gebruikt. Momenteel is dit protocol beperkt tot diermodellen, maar kan mogelijk worden toegepast om pathologische toestanden geassocieerd met weefselhypoxie, zoals kanker, beroerte en ontsteking, te diagnosticeren en te behandelen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe optische imager die is ontworpen voor macroscopische fotoluminescentie-levensduurbeeldvorming, wat bijzonder nuttig is bij biologische monsters zoals levend dierweefsel. Het protocol maakt gedetailleerde mapping van de fosforescentie-levensduur en de zuurstofconcentratie mogelijk, wat essentieel is voor het begrijpen van diverse biologische processen.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Biologische beeldvorming
- Fosforescentie-levensduuranalyse
- Zuurstofconcentratiemeting
Achtergrond
- Macroscopische beeldvorming is essentieel voor het bestuderen van complexe biologische monsters.
- Bestaande methoden analyseren monsters met een langdurig verval mogelijk niet efficiënt.
- Dit onderzoek heeft tot doel de visualisatietechnieken in levende weefsels te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Optische beeldvorming met time-correlated single-photon counting (TCSPC) modus
- Toepassing op levend dierweefsel
- Gebruik van op maat ontworpen beeldvormingsmodules en software voor gegevensverwerking
Belangrijkste resultaten
- Effectieve visualisatie van levensduur en zuurstofdistributie
- Vermogen om fosforescentie-levensduurbeelden met een hoog contrast te genereren
- Succesvolle toepassing bij het observeren van hypoxische condities in weefsel
Conclusies
- De studie demonstreert een innovatieve beeldvormingsbenadering voor biologisch onderzoek.
- Potentiële toepassingen voor het diagnosticeren en behandelen van aandoeningen gerelateerd aan weefselhypoxie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Kwantitatieve mapping van weefseloxygenatie met behulp van fosforescentie-levensduimimaging vervult een kritieke behoefte aan nauwkeurige hypoxiebeoordeling in preklinisch onderzoek. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen bij ziektemodellering en ondersteunt mechanistische risicoreductie voor doelwitvalidatie in de oncologie en het metabool onderzoek. De snelle, hooggevoelige imaging van het platform maakt een robuuste evaluatie van weefselmicro-omgevingen mogelijk, wat bijdraagt aan besluitvorming over portfolio's in een vroeg stadium.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van weefseloxygenatie mogelijk als functionele biomarker in ziektemodellen.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door ruimtelijk opgeloste hypoxiegegevens te verschaffen in levende en ex vivo weefsels.
- Faciliteert targetvalidatie door de zuurstofdistributie te koppelen aan de activiteit van biologische pathways.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde weefselmodellen voor voor downstream compound screening onder gecontroleerde oxygenatietoestanden.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve levensduurmetingen voor assay-standaardisatie.
- Maakt high-throughput gereedheid mogelijk door de beeldvormingstijd te reduceren tot minder dan 20 seconden per monster.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische modellen uit met ziekterelateerde hypoxiesignaturen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt metabole beeldvorming in zowel ex vivo als levende diersystemen.
- Biedt kwantitatieve eindpunten voor risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van therapeutische kandidaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit imaging-platform integreert het volledige traject van vroege ontdekking tot preklinische validatie en ondersteunt workflows voor targetvalidatie, lead-identificatie en translationeel onderzoek.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing van zuurstofafhankelijke mechanismen in weefselmodellen mogelijk.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve read-outs voor assayontwikkeling en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert ruimtelijk opgeloste, kwantitatieve levensduur- en zuurstofconcentratiekaarten voor vergelijkende analyse.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en preklinische fasen door imaging-outputs af te stemmen op ziekterelateerde hypoxie-biomarkers.
- Enterprise Reuse: Biedt een modulaire, reconfigureerbare imaging-capaciteit die aanpasbaar is aan diverse probes en weefselsystemen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in door hypoxie gedreven ziektemodellen.
- Operationele waarde: Levert snelle, reproduceerbare beeldvorming met gestandaardiseerde protocollen en flexibele probe-compatibiliteit.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalallocatie door het leveren van robuuste kwantitatieve eindpunten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van gevalideerde weefseloxygenatiegegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in optische beeldvorming en fosforescentie-levensduuranalyse.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie, waaronder TCSPC-compatibele camera's en beeldversterkers.
- Vereist cross-team standaardisatie van beeldvormingsprotocollen en workflows voor data-analyse.
- Aanpasbaar aan diverse weefselmodellen en probe-chemieën met de juiste configuratie.
- Momenteel beperkt tot diermodellen; uitbreiding naar andere systemen vereist verdere validatie.
