Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen

iPS-afgeleide microglia vormen een biologisch relevante bron van menselijke microglia voor in vitro experimenten en zijn een belangrijk hulpmiddel om microgliabiologie in gezondheid en ziekte te onderzoeken. We presenteren een eenvoudig microglia differentiatieprotocol dat minimaal gebruik van groeifactoren vereist en een hoge zuiverheid en opbrengst bereikt. Ook demonstreren we een volledig gehumaniseerde fagocytosetest.

iPSC-afgeleide microglia-achtige cellen zijn erg gevoelig voor mediaverdamping. Vermijd het gebruik van de putten in de hoek van de celkweekplaat en vul alle lege putten met water om de overleving te verbeteren. Zodra geïnduceerde pluripotente stamcellen, of iPSC's, 80% confluency hebben bereikt, dissocieert u de kolonies door te wassen met één milliliter DPBS en gedurende twee minuten één milliliter van een dissociatiereagens toe te voegen bij 37 graden Celsius.

Maak de kolonies los met behulp van een cellifter door meerdere keren te schrapen om een enkele celsuspensie te creëren. Verzamel de suspensie en breng ze over in een conische buis van 15 milliliter met negen milliliter DPBS. Centrifugeer vervolgens de cellen op 500 keer g gedurende één minuut, verwijder het supernatant en resuspensieer in één milliliter van het Embryoid Body, of EB, medium.

Neem 10 microliter cellen en verdun één tot twee met trypan blue. Tel de cellen op een hemocytometer en verdun op basis van het celgetal de celvoorraad tot een uiteindelijke verdunning van 10.000 cellen per 100 microliter. Voeg voor platingcellen 100 microliter van de verdunde cellen per put toe aan een laag hechtende ronde bodemplaat met 96 putten.

Centrifugeer de plaat op 125 maal g gedurende drie minuten en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vier dagen. Vervang op dag twee met behulp van een meerkanaalspipet het oude half-EB-medium door een vers medium. Om primitieve macrofaagprecursoren of PMP's te genereren, bedekt u de putten van een plaat met zes putten door één milliliter ijskoude Matrigel-coatingoplossing toe te voegen.

Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee uur of een nacht. Breng op dag vier van EB-differentiatie, met behulp van een pipetpunt van één milliliter, de EB's over naar de met Matrigel gecoate putten. Pipetteer op en neer om de EB's uit de put te halen.

Houd vervolgens de plaat gekanteld zodat de EB's zich aan de rand van de put kunnen nestelen. Zodra alle EB's zijn neergedaald, pipetteer en vervang je voorzichtig het oude medium, terwijl je de EB aan de rand van de put houdt met drie milliliter vers bereid PMP compleet medium. Verdeel de cellen gelijkmatig in de putjes door de plaat handmatig van links naar rechts en van achteren naar voren te schuifelen.

Incubeer vervolgens de plaat gedurende zeven dagen zodat de EB's zich aan de bodem van de put kunnen hechten. Inspecteer na zeven dagen de EB's onder een lichtveldmicroscoop met viervoudige vergroting om er zeker van te zijn dat ze aan de onderkant van de putten zijn bevestigd. Voer een halve mediumverandering uit en vervang op dag 21 het volledige medium door drie milliliter PMP compleet medium.

Zoek op dag 28 naar ronde cellen die PMP's worden genoemd in het supernatant. Verzamel vervolgens het medium met de PMP's met behulp van een pipet van 10 milliliter en een automatische pipetter zonder de EB's te storen. Breng de PMP's in het medium over in een conische buis van 15 milliliter.

Centrifugeer de verzamelde PMP's op 200 keer g gedurende vier minuten en adem het supernatant op voordat u ze opnieuw opschort in één tot twee milliliter microglia-achtige cellen of IMG basaal medium. Tel vervolgens de cellen op de hemocytometer zoals eerder beschreven. Centrifugeer de rest van de cellen en verdun de PMP's tot de gewenste concentratie.

Plaats vervolgens de cellen met een dichtheid van 10 tot de vijfde cellen per vierkante centimeter op met celkweek behandelde platen met behulp van vers bereid IMG compleet medium. Voor live cell phagocytose assay, plaat 20 tot 30 maal 10 tot de vierde PMP's in een 96-well plaat en 100 microliter IMG compleet medium en volg het differentiatieproces gedurende 10 dagen. Verwijder op de dag van de test 40 microliter medium per put en voeg 10 microliter van de nucleaire kleuringsoplossing toe.

Incubeer de plaat gedurende twee uur. Ontdooi de gelabelde synptosomen op ijs en soniceer voorzichtig met behulp van een watersonicator gedurende één minuut. Nogmaals, plaats de synaposomen onmiddellijk op ijs.

Verdun de gelabelde synaptosomen in het volledige IMG-medium met één microliter synaptosomen per 50 microliter medium. Bereid voor negatieve controle 60 micromolair Cytochalasine D in IMG compleet medium om actinepolymerisatie en dus fagocytose te remmen. Voeg vervolgens 10 microliter van deze oplossing toe aan elk putje voor een uiteindelijke concentratie van 10 micromolair en incubeer gedurende 30 minuten.

Verwijder de plaat uit de couveuse en incubeer bij 10 graden Celsius gedurende 10 minuten. Houd de plaat op ijs en voeg 50 microliter medium toe dat synaptokosomen bevat. Centrifugeer de plaat op 270 maal g gedurende drie minuten bij 10 graden Celsius en houd de plaat op ijs totdat de beeldvorming is verkregen.

Plaats de plaat in een live cell imaging-lezer en selecteer de putjes die moeten worden geanalyseerd. Selecteer vervolgens een 20X objectief objectief. Pas vervolgens de focus, Light Emitting Diode of LED, intensiteit, integratietijd en versterking van de heldere veld- en blauwe kanalen aan.

De fluorescentie van het synptoptosoom moet op het beginpunt verwaarloosbaar zijn. Selecteer het aantal afzonderlijke tegels dat in een montage per put moet worden verkregen. Verkrijg 16 tegels in het midden van de put en beeld ongeveer 5% van het totale putoppervlak af.

Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius en het gewenste tijdsinterval voor beeldvorming. Open vervolgens de analysesoftware. Open vervolgens het experiment dat de afbeeldingen bevat en klik op het pictogram Gegevensreductie.

Kies in het menu Imaging Stitching onder Imaging Processing om een volledige afbeelding te maken van de vier bij vier afzonderlijke tegels in de montage met de parameters die in het tekstmanuscript worden beschreven. Definieer een intensiteitsdrempel met behulp van de DAPI- en RFP-kanalen voor deze afbeeldingen. Open een afbeelding en klik op Analyseren.

Selecteer onder Analyse de optie Cellulaire analyse en kies onder Detectiekanaal een gestikte afbeelding in de DAPI- of RFP-kanalen. Ga vervolgens naar het tabblad Primair masker en aantal en stel een drempelwaarde en objectgroottewaarden vast die de celkernen in het DAPI-kanaal of het synasptosoomsignaal in het RFP-kanaal correct selecteren. Als u het aantal kernen wilt tellen, gaat u naar het menu Gegevensreductie en selecteert u onder Beeldanalyse de optie Cellulaire analyse.

Ga nogmaals naar het tabblad Primair masker en aantal en selecteer onder Kanaal de DAPI-gestikte afbeeldingen en gebruik de parameters die in het tekstmanuscript worden beschreven. Ga vervolgens naar het tabblad Berekende statistieken en selecteer Celaantal. Als u vervolgens het gebied van het synasptosoomsignaal wilt verkrijgen, gaat u naar het menu Gegevensreductie en selecteert u onder Analyse de optie Cellulaire analyse.

Ga nogmaals naar het tabblad Primair masker en aantal en selecteer onder Kanaal de optie RFP-gestikte afbeeldingen en gebruik de parameters die in het tekstmanuscript worden beschreven. Ga vervolgens naar het tabblad Berekende statistieken en selecteer Objectsomgebied. Klik op het tabblad Gegevensreductie op OK om de software alle verkregen afbeeldingen te laten analyseren.

Zodra de afbeeldingen zijn geanalyseerd, exporteert u de waarden ObjectSomgebied en Celtelling voor elk tijdstip. Deel vervolgens het objectsomgebied door het aantal cellen om het genormaliseerde gebied per tijdspunt te berekenen. Als u meerdere behandelingen of genotypen vergelijkt, berekent u de fagocytose-index met behulp van de gegeven vergelijking.

Ongedifferentieerde iPSC's vertonen compacte koloniemorfologie met goed gedefinieerde randen. Gedissocieerde iPSC's vormden bolvormige aggregaten die EB's worden genoemd en groeien in omvang tot dag vier van differentiatie. Wanneer de EB's worden verguld voor PMP-generatie, hechten ze zich aan de matrigel-gecoate platen en een laag cellen verspreidt zich en omringt de bolvormige aggregaten.

Op dag 28 verschijnen ronde cellen met een grote cytoplasma/kernverhouding in de suspensie. Het wordt sterk aanbevolen om iPSC's te kweken in Laminin 521-gecoate platen in plaats van Matrigel, vanwege de hogere PMP-opbrengst in Laminin 521-gecoate platen. Na de blootstelling van PMP's aan IMG-medium verwerven cellen een microglia-achtige morfologie met een klein cytoplasma in aanwezigheid van langwerpige processen.

Verder werd de identiteit van microglia geverifieerd door immunofluorescente kleuring. Doorgaans drukt meer dan 95% van de cellen IB1 uit en ongeveer 90% van de cellen expressie P2RY12 en TMEM119. Western blot-analyse bevestigde dat iPSC lagere motorneuronen afleidde voor tot expressie gebrachte synaptische markers van menselijke synaptosomen, synaptophysine en postsynaptische dichtheidseiwit 95.

In controle in vergelijking met het initiële tijdstip, na 10 uur, was het rode fluorescerende signaal robuust, omdat de meeste synaptosomen waren overspoeld en gelokaliseerd waren in zure intracellulaire compartimenten. In met Cytochalasine D behandelde IMG's gaf een sterke vermindering van het rode signaal gedurende nul en 10 uur aan dat het gedetecteerde signaal het gevolg is van fagocytische gebeurtenissen. Het gebied van overspoelde synaptosomen nam met de tijd toe tot 16 uur.

Het gebied van rood signaal van cytochalasine D-behandelde cellen nam echter niet toe met de tijd. iPS-afgeleide Microglia-achtige cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder fagocytose en ontstekingsreactie in de studie van neurologische en neurodegeneratieve ziekten.