Contactovergevoeligheid als een muizenmodel van allergische contactdermatitis

Een objectieve laboratoriummethode die hier wordt gepresenteerd, kan helpen bij het bestuderen van de contactovergevoeligheidsreactie bij muizen, die allergische contactdermatitis bij mensen nabootst. De contactovergevoeligheidsreactie kan niet alleen worden gemeten door ooroedeem, maar ook door verschillende laboratoriumtests die de studie van cellulaire mechanismen die bij deze reactie betrokken zijn, mogelijk maken. Het meer in-contact overgevoeligheidsmodel kan verschillende omgevingsfactoren en nieuwe stoffen testen om aan te tonen of geteste factoren T-celafhankelijke immuunresponsen moduleren, die kunnen worden gebruikt om nieuwe therapieën te implementeren.

Begin met het scheren van de muizenhuid met een scheermesje en het labelen van de poot. Breng zes uur voor de inductie van contactovergevoeligheid, of CHS, grijze zeep aan met water en scheer een vierkant gebied van twee centimeter op de borst en buik van de muis. Sensibiliseer de muizen op dezelfde dag door 150 microliter vers bereide 5% hapten op de eerder geschoren plek aan te brengen.

Pas in de bedieningsmuis alleen het voertuig toe. Droog de haptenplek gedurende 30 seconden voordat u het dier terug in de kooi plaatst. Meet op dag vier de oordikte van een verdoofde muis met behulp van een micrometer op nul uur door een waarnemer die zich niet bewust is van de experimentele groepen.

Breng vervolgens 10 microliter vers bereide 04% hapten aan beide zijden van de oren aan in test- en controlegroepen en laat het 30 seconden drogen. Op dag vijf, 24 uur na de vorige 0,4% hapten-toepassing, herhaalt u de meting van de oordikte voor de 24-uursmeting. 24 uur na de oordiktemeting, wanneer de muis nog steeds in diepe anesthesie is, snijdt u de oren zo dicht mogelijk bij de schedel af met een schaar.

Aan de distale kant van de oren, Maak een pons met een diameter van zes millimeter met behulp van een biopsiepons. Meet het gewicht van elke oorbiopsie op de analytische balans en druk het uit in milligrammen. Voor de myeloperoxidase, of MPO, assay, plaats de oorbiopten in een microcentrifugebuis van twee milliliter met roestvrijstalen kralen en voeg 500 microliter van de voorbereide buffer toe.

Homogeniseer de biopten gedurende 10 minuten in een homogenisator en koel het monster vervolgens gedurende 15 minuten af bij 4 graden Celsius voordat u het opnieuw gedurende 10 minuten homogeniseert. Haal de kralen eruit zodra biopten zijn gehomogeniseerd. Vries de homogenaten 30 minuten in bij min 20 graden Celsius.

Ontdooi en draai de monsters en herhaal de homogenisatie- en vriesprocedure drie keer. Als u klaar bent, centrifugeert u het homogenaat op 3.000 G gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius. Oogst het supernatant met een pipet om de MPO-activiteit te meten en druk deze uit in eenheden per eiwit van één milligram.

Om een vasculaire permeabiliteitstest uit te voeren, sensibiliseert u muizen op dag nul en op dag vier direct uitdagen door hapten op de oren aan te brengen met behulp van de eerder genoemde procedure. Injecteer 23 uur later intraveneus 8,3 microliter per gram lichaamsgewicht van 1% Evans blauwe kleurstof in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing, of DPBS, in de verdoofde muis. Na een uur de muis opnieuw verdoven om de oorbiopten te verzamelen, zoals eerder beschreven.

Om de kleurstof uit het weefsel te extraheren, incubeert u de biopsieën in de buizen met één milliliter formamide bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide gedurende 18 uur. Na het verzamelen van oorbiopten, wanneer de muis nog steeds onder diepe anesthesie is, verwijdert u de oogbol met een pincet. Oefen zachte druk uit op de muis en verzamel bloed uit de retro-orbitale sinus in de buis voor serumverzameling.

Keer de buis zes keer om en wacht 30 minuten tot het bloed stolt. Centrifugeer vervolgens de buis op 1, 300 tot 2.000 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Sensibiliseer de donormuizen met TNCB hapten op dag nul met behulp van de eerder genoemde procedure Op dag vier, na het desinfecteren van de huid, isoleert u de oksel- en inguinale lymfeklieren, of ALN's, van de verdoofde muis met behulp van een tang, gevolgd door het isoleren van de milt.

Pureer het weefsel tussen de berijpte uiteinden van twee microscoopglaasjes en passeer de celsuspensie door een celzeef met een poriegrootte van 70 micrometer. Was vervolgens de cellen met DPBS aangevuld met 1% foetaal runderserum en centrifugeer ze op 300 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant en resuspensie de resterende celkorrel in één tot vijf milliliter DPBS.

Bereid een 1:1 mengsel van ALN's en milt om een concentratie tot 7,0 maal 10 tot de zevende cellen in 200 microliter DBPS te bereiken voordat u het mengsel van CHS-effectorcellen intraveneus injecteert in een verdoofde muis. Meet de oordikte op nul uur en na 24 uur van de uitdaging. De gegevens toonden aan dat muizen die gevoelig waren voor TNCB en vier dagen later in de oren werden uitgedaagd, een aanzienlijk verhoogde zwelling van het oor ontwikkelden, vergeleken met schijngevoelige en vervolgens op dezelfde manier uitgedaagde controlemuizen.

De toename van ooroedeem in de testgroep resulteerde in een verhoogd oorgewicht, MPO-activiteit, interferon gammaconcentratie in de oorextracten, oedemateuze dermisveranderingen in het histologisch onderzoek en vasculaire permeabiliteit van het oor De TNP-specifieke IgG1-antilichamen waren verhoogd in de sera van de testmuizen in vergelijking met de controledieren. De dieren die de CHS-effectorcellen ontvingen van donoren die eerder met TNCB waren gesensibiliseerd, vertoonden een significant verhoogde zwelling van het oor, vergeleken met dieren die de cellen niet hebben ontvangen. Het meest kritieke moment is het triggeren van contactovergevoeligheid.

Hapten-oplossing is zeer vluchtig en lichtgevoelig, dus het moet snel op de huid van de dieren worden aangebracht. Aanvullende tests kunnen worden uitgevoerd op de geïsoleerde effectorcellen. Celculturen kunnen bijvoorbeeld worden vastgesteld om het vermogen om te prolifereren in aanwezigheid van antigenen te beoordelen.