Een methode om de correlatie tussen lokale collageenstructuur en mechanische eigenschappen van atherosclerotisch plaquevezelig weefsel te bestuderen

Dit protocol maakt de lokale beoordelingen mogelijk van zowel collageenarchitectuur als mechanische faalkenmerken van vezelig plaqueweefsel. Aangezien zowel structurele als mechanische beoordelingen werden uitgevoerd op hetzelfde weefselmonster, maakt deze techniek het mogelijk om het functionele verband tussen de structurele en mechanische beoordelingen van het weefsel te ontrafelen. De kennis die met dit protocol wordt verkregen over de structuur en faalkenmerken van vezelige plaqueweefsels is de sleutel tot het voorkomen en voorspellen van klinische fatale gebeurtenissen veroorzaakt door atherosclerotische plaqueruptuur.

Om te beginnen knipt u de plaque open langs de lengteas van de slagader met behulp van een chirurgische schaar en een pincet. Knip rechthoekige testmonsters uit de plaquemonsters en zorg ervoor dat de monsters zo groot mogelijk zijn en vermijd weefselgebieden met scheuren of verkalkingen. Neem vervolgens een plaquetestmonster en bevestig beide uiteinden aan de siliconen door naalden in het weefsel vast te pinnen.

Steek de naalden in het gebied van het monster dat zich tijdens de mechanische test in de klemmen van de trekproefinrichting bevindt. Zet een veiligheidsbril op. Gebruik een zijsnijder om de naalden in te korten, zodat ze minder dan een paar millimeter boven het monsteroppervlak uitsteken om te voorkomen dat ze het microscoopobjectief beschadigen.

Vul de petrischaal met PBS totdat het monster is ondergedompeld. Schakel vervolgens het microscoopsysteem in, draai aan de multifoton-toets en open de besturingssoftware van de microscoop. Leg de petrischaal met het testmonster onder het objectief en laat het microscoopobjectief zakken.

Schakel de live scanmodus in. Verplaats het objectief naar een hoek van het voorbeeld met behulp van de knoppen op het slimme deelvenster en klik op het markeringspositiesymbool in het deelvenster Tegelscan. Als het correct wordt uitgevoerd, wordt een raster met alle geselecteerde tegels voor afbeelding oranje weergegeven.

Klik vervolgens op Start in de rechterbenedenhoek van het scherm om een tegelscan van het volledige monsteroppervlak te maken om een overzicht van de monstergeometrie te krijgen. Bekijk na het scannen van de tegel de X- en Y-coördinaten van de linkerbovenhoek van de tegel linksboven in het deelvenster Tegelscan dat automatisch wordt weergegeven. Noteer deze coördinaten in een spreadsheet.

Bekijk in het deelvenster Tegelscan het aantal tegels in de X- en Y-richtingen in het vak ScanField. Let op de grootte van de tegelscan in de spreadsheet. Bereken de coördinaten van de andere tegels door de grootte van de tegel op te tellen of af te trekken.

Selecteer in de tegelscan de tegels die moeten worden afgebeeld met een tweede harmonische generatie of SHG-afbeelding. Vermijd voor de selectie tegels in de klemmen en laat één tegel tussen elke geselecteerde tegel in zowel de lengte- als de omtrekrichting. Identificeer vervolgens de locatie van de tegels die moeten worden afgebeeld met behulp van de berekende coördinaten in deze spreadsheet.

Vul de coördinaten in de daarvoor bestemde vakken in en klik op Enter zodat het doel naar de juiste tegel gaat. Schakel de live scanmodus in. Verhoog het multifoton- of MP-laservermogen door de schuifregelaar in het bovenste paneel en de straalpadinstellingen te gebruiken om het hoogst mogelijke laservermogen te krijgen zonder significante bleking.

Pas vervolgens de detectorversterking aan om heldere beelden zonder verzadigde pixels te verkrijgen met behulp van de knop op het slimme paneel of door op de naam van de detector en de bundelpadinstellingen en extra kanalen te klikken. Typische waarden voor de detectorversterking liggen tussen de 500 en 800 volt. Gebruik de Z-positieknop op het slimme paneel om het scherpstelvlak aan te passen.

Ga vervolgens naar de bovenkant van het voorbeeld en stel de posities van de bovenkant van de Z-stack in door op de pijlpunt in het Z-stack-paneel onder het tabblad Acquisitie van het derde paneel te klikken. Focus vervolgens op het monster totdat het SHG-signaal niet langer wordt gedetecteerd. Klik nogmaals op de pijlpunt in het Z-stack paneel om deze positie in te stellen.

Als u klaar bent, schakelt u de live scanmodus uit. Houd onder het tabblad Acquisitie in het tweede deelvenster de scansnelheid op 400 hertz, stel het lijngemiddelde in op twee en de resolutie op 512 bij 512 pixels per afbeelding met behulp van de vervolgkeuzelijsten. Schakel de knop Bidirectioneel X-scannen in.

Klik op z-step size in het Z-stack paneel en vul een z-step grootte van drie micron in de doos. Klik op Start in de rechterbenedenhoek van het scherm om een Z-stack te maken. Wanneer u klaar bent, slaat u de coördinaten van de tegel op in de bestandsnaam of geeft u elke tegel het nummer.

Na beeldvorming wordt het monster blootgesteld aan mechanische tests. Om een spackle-patroon te genereren, houdt u de airbrush gevuld met weefselkleurstof op ongeveer 30 centimeter afstand van het testmonster en spuit u deze op het lumenale oppervlak. Plaats vervolgens voor uniaxiale trekproeven het monster in de klemmen van de trektester met de omtrekrichting van het monster uitgelijnd met de trekstrekrichting en de lumenale zijde van het monster naar boven gericht.

Zorg ervoor dat de initiële meterlengte zo is ingesteld dat de breedte-lengteverhouding van de strip kleiner is dan één. Draai de schroeven van de grepen vast door een koppel van 20 centinewtonmeter toe te passen met behulp van een koppelschroevendraaier. Voeg PBS toe aan het verwarmingsbad totdat het monster is ondergedompeld.

Scheur de loadcel en begin met het registreren van de globale kracht- en verplaatsingsmetingen van de loadcel en de actuator van de trektester. Maak het monster recht door een voorrek van 0,05 newton toe te passen om de speling in het monster te verwijderen. Voer 10 cycli van voorconditionering uit, tot 10% spanning, op basis van de meterlengtemeting door de actuator na het aanbrengen van voorrek.

Start de uniaxiale trektest totdat het monster volledig faalt tijdens het opnemen van een video van de vervorming van het monster met de hogesnelheidscamera. Stop na een storing met het registreren van de globale kracht- en verplaatsingsmetingen. Open de Z-stacks verkregen tijdens multifotonenmicroscopie, of MPM, met SHG in afbeelding J en maak maximale intensiteitsprojecties, of MIPs, van elke Z-stack.

Analyseer elke MIP met de open source MATLAB-gebaseerde vezeloriëntatieanalysetool om de oriëntatiehoek van de individuele collageenvezels in de tegels te meten. Gebruik een andere MATLAB-gebaseerde tool, FibLab, om een Gaussische verdeling aan te passen aan het histogram van de hoekverdeling. Haal uit de Gaussische verdelingsplot de structurele parameters zoals de overheersende vezelhoek, de modus van de verdeling, de standaardafwijking van de vezelhoekverdeling en de anisotrope fractie.

Voer visuele inspectie uit op de camerabeelden om het frame te identificeren waarin breukinitiatie optreedt. Identificeer visueel de breuklocatie. Voer de digitale beeldcorrelatie, DIC, analyse uit met MATLAB-gebaseerde software ncorr met behulp van de camerabeelden die zijn opgenomen tijdens de trekproef.

Selecteer het laatste frame voor het laatste uitrekken tot de fout als referentieafbeelding. Voor de huidige afbeeldingen selecteert u ll-afbeeldingen vanaf het begin van het laatste uitrekken tot het laatste frame vóór het frame waarin de breukinitiatie plaatsvond. Selecteer het monsteroppervlak als de interesseregio of ROI.

Sluit de gebieden uit die zich in de buurt van de klemmen bevinden. Voer DIC uit door de subsetradius van de parameter in te stellen op 30 pixels, de subsetafstand op drie pixels, de iteratie-cutoff op 50, de norm van de verschilvectorafsnijding op 10 op de macht van vijf, de rekstraal op vijf en de autopropagatiestap op vijf. Uit de DIC-analyse met ncorr haalt u de Green-LaGrange- of Eulerian-stamverdelingen van de ROI op.

Gebruik deze stamverdelingen om de gemiddelde Green-LaGrange-stam van het gehele oppervlak van het plaquemonster te berekenen bij het laatste frame vóór de breuk. Bereken de Green-LaGrange-stam op de breuklocatie. Maak met behulp van de natuurlijke oriëntatiepunten in het testmonster een overlay van de referentieafbeelding en de tegelscan om de breuklocatie op de tegelscan te identificeren.

Identificeer de MPM-SHG-tegel waar de breuk is opgetreden. Als de breuk zich niet in een tegel bevindt die is gescand met de MPM-SHG, identificeert u de tegel die zich het dichtst bij de breuklocatie bevindt. Verkrijg de structurele parameters die te vinden zijn op de tegel waar de breuk is opgetreden.

Een vers en intact plaquemonster met weinig tot geen scheuren en macrocalcificaties wordt hier getoond. Plaquemonsters kunnen worden opgehaald uit gebieden waar deze scheuren en verkalkingen niet voorkomen. SHG-beeldvorming en beeldnabewerking bieden MIPs van elke afgebeelde tegel.

Verdere nabewerking door vezeldetectie levert vezeloriëntatiehistogrammen op waaruit collageenstructuurparameters kunnen worden geëxtraheerd. Bovendien worden kleurenkaarten met de lokale structurele collageenparameters over het hele plaquemonster verkregen voor visuele analyse. Uit deze testmonsters werd een grote intrasamplevariatie in de structurele collageenparameters waargenomen.

De breukinitiatie en voortplanting in een plaqueweefselmonster tijdens de trekproef worden hier gedemonstreerd. Digitale beeldcorrelatieanalyse biedt lokale weefselvervormingskaarten, zoals de Green-LaGrange-stamkaarten. Uit deze stamkaarten werd een grote intrasamplevariatie in de lokale stammen waargenomen.

Zodra de breuklocatie is geïdentificeerd op de camera-opnames, kan deze worden toegewezen aan het referentiecamerabeeld en de microscopietegelscan. Dit biedt de MPM-SHG-tegel waar de breuk plaatsvond en de structurele parameters die bij deze tegel te vinden zijn. Het verkrijgen van vezelige weefselmonsters die vrij zijn van verkalkingen en groot genoeg zijn voor mechanische tests, kan een uitdagende taak zijn voor zwaar verkalkte plaques.

Zodra een mechanisch of structureel kenmerk is geïdentificeerd als voorspeller van fibreus plaqueweefselfalen, zal een in vivo beeldvormingssysteem dat deze functie meet, het mogelijk maken om het risico op plaqueruptuur bij patiënten te voorspellen.