Het ontcijferen van het moleculaire mechanisme en de functie van porievormende toxines met behulp van Leishmania major

Het mechanisme van resistentie tegen poriënvormende toxines is slecht begrepen. Ons protocol maakt functie en mechanisme mogelijk om poriën te vormen toxines met behulp van Leishmania major, een genetisch verhandelbaar en fysiologisch relevant systeem. Het belangrijkste voordeel van de cytotoxiciteitstest is het vergelijken van de levensvatbaarheid van meerdere fenotypen op eencellig niveau in een medium-throughput assay wanneer deze in realtime wordt uitgedaagd met toxines.

Membraanverstorende middelen zoals amfotericine B zijn eerstelijnstherapieën voor Leishmania. Deze test maakt de identificatie mogelijk van middelen die amfotericine B en/of nieuwe membraanbeschadigende middelen versterken. Deze test geeft inzicht in gebieden zoals reparatierespons en signaleringsroutes met betrekking tot reparatiereacties.

Deze test kan worden toegepast op protozoën zoals Trypanosoma en Naegleria fowleri. Mensen vinden het moeilijk om de toxine seriële verdunningsreeks te begrijpen. Dus het beste advies dat ik kan geven is om een schema van de seriële verdunningsreeks te tekenen voordat je het experiment opzet.

Reserveer om te beginnen 0,5 milliliter verwerkte promastigoten in een aparte buis als niet-gekleurde controle. Voeg twee milligram per milliliter propidiumjodide, of PI, toe tot een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter aan de resterende promastigoten. Vortex gedurende drie seconden.

Voeg verwerkte promastigoten toe aan elke put van een V-bodem, 96-well plaat of Marsh-buizen en plaats de plaat of het buizenrek op het ijs in een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van het bekijken. Voeg 100 microliter testbuffer met propidiumjodide toe aan elke controle zonder toxine. Controleer of het besturingselement correct is toegevoegd door buizen met een totaal volume van 200 microliter die donkerder van kleur lijken, visueel te identificeren.

Voeg het volume toxine toe aan de hoogste verdunning. Verdun vervolgens het toxine serieel. Pipetteer minstens acht keer op en neer om mengen te garanderen.

Begin bij de laagste toxineconcentratie en voeg snel 100 microliter toxine toe aan de juiste rij en ga door totdat al het toxine aan de cellen is toegevoegd. Sluit de plaat af met afdichtingstape. Na 30 minuten incuberen bij 37 graden Celsius, verpak en transporteer de plaat naar de flowcytometer.

Voor data-acquisitie begint u met het instellen van de flowcytometer en acquisitiesoftware volgens de instructies van de fabrikant en per faciliteitsbeleid. Stel met behulp van het niet-gekleurde L.major promastigote-monster de poorten in voor voorwaartse en zijwaartse spreiding en de initiële fluorescerende parameters op basis van de gekozen kleurstoffen. Stel met behulp van enkelgekleurde bedieningselementen de poorten in voor de levensvatbaarheidskleurstof en eventuele fluorescerend gelabelde toxines.

Monitor voorwaartse spreiding versus tijd voor microclogs en verkrijg meer dan 10.000 gated events voor elk monster op de cytometer. Voor data-analyse, gate totale eencellige L.major promastigoten door gating op voorwaartse en zijwaartse spreiding en tijd indien nodig. Gebruik hoogte of gebied zoals aanbevolen voor de flowcytometer.

Identificeer en gate dode cellen als PI hoog. Organiseer de dosis-responscurve in Excel voor analyse. Bepaal het gemiddelde percentage PI hoog voor elke voorwaarde tussen de twee technische replica's.

Neem toxineconcentratie en gemiddelde procentspecifieke lysis op, samen met experimentele details en / of ruwe procent PI-hoge berekeningen. Label nog vier kolommen als Gemodelleerd, Restanten, Parameters en Parameterwaarden. Controleer of de eerste kolommen overeenkomen met de experimentele parameters, de toxineconcentratie en procentspecifieke lyse.

Initialiseer de parameters L, k en c door de waarden in de kolom Parameterwaarden in te voeren. Maak in de kolom Gemodelleerd het logistieke model. Bereken in de kolom Restanten het kwadraat van het verschil tussen het gemodelleerde getal en de werkelijke specifieke lysis.

Tel in de kolom Parameterwaarden naast SOM alle waarden in de kolom Restanten op. Initialiseer in de kolom Parameterwaarden naast LC50 de vergelijking om de LC50 te berekenen op basis van de bepaalde waarden. Open de oplosser op het tabblad Gegevens.

Selecteer het ingestelde doel als de cel die de som van de berekende resten bevat. Stel het in op Min. Wijzig de variabele cellen voor de parameterwaarden L, k en c.

Voor negatieve k-waarden wijzigt u vergelijkingen door negatieve één van k te berekenen om k in positief te veranderen. Gebruik de GRG Nonlinear Solving-methode en klik op Oplossen. Controleer de curve en dat de LC50 automatisch wordt berekend.

Controleer de pasvorm door zowel procentspecifieke lyse als modellering tegen toxineconcentratie grafisch te plotten. De sfingolipide-deficiënte SPT2 knock-out promastigoten waren gevoelig voor SLO in zowel serumvrije M199 als Tyrode's buffer. Wild type en SPT2 add-back promastigoten waren resistent tegen SLO in serumvrije M199, maar hadden minder dan 20% specifieke lysis in de buffer van Tyrode.

De SPT2 knock-out promastigoten waren ongeveer acht keer gevoeliger voor SLO in de buffer van Tyrode dan in M199. Deze gegevens tonen aan dat de toxinegevoeligheid kan variëren op basis van de gebruikte buffer. Een band van 120 kilodalton werd waargenomen voor fosfo-MEK in de L.major promastigoten.

Voor totale MEK werden banden van ongeveer 120 kilodalton en 55 kilodalton waargenomen, die consistent zijn met de maten van respectievelijk MRK1 en LmxMKK. Fosfo-ERK detecteerde vergelijkbare banden, terwijl de ERK-antilichaamkleuring niet robuust was in deze test. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is het zorgen voor de juiste behandeling van het toxine.

Leishmania kan worden gebruikt als een genetisch handelbaar model om plasmamembraanreparatie te bestuderen, wat nieuwe inzichten biedt in membraanherstelmechanica tijdens Leishmania-bacterie-interactie in zandvlieg midgut.