Generatie, high-throughput screening en biobanking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiale sferoïden

Dit protocol beschrijft een workflow voor het genereren, onderhouden en optisch analyseren van cardiale sferoïden. Deze cardiale sferoïden zijn essentieel om de leemte in de huidige in vitro ziektemodellen op te vullen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om next-generation, high-throughput screening en functionele opslag van cardiale sferoïden te creëren.

Begin met het toevoegen van één milliliter per vierkante centimeter steriele hartloslatingsoplossing aan elke put van een kweekplaat met confluente door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Bevestig het loslaten van cellen door witte en ronde cellen te observeren onder 4x vergroting van een helderveldmicroscoop.

Gebruik een pipet van vijf milliliter om de cellen mechanisch te scheiden door ze te spoelen met twee milliliter warm basaal medium om een enkele celsuspensie te bereiden. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende drie minuten op 300 g. Zuig vervolgens het supernatant op en resuspensie de cellen in één milliliter hiPSC-CM-replatingmedia.

Gebruik een pipetpunt van 1.000 microliter om de celpellet te dissociëren. Na drie of vier mengsels, als de oplossing homogeen lijkt, laadt u deze in een cassette om de cellen te tellen en brengt u de juiste hoeveelheid cellen in 100 microliter replatingmedium over naar elke put van een ultralage aanhechting, ronde bodem, 96-putplaat. Plaats de cardiale sferoïdenplaat op een orbitale schudder in de couveuse bij 70 tpm met een temperatuur van 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, 21% zuurstof en 90% vochtigheid gedurende 24 uur.

Om sferoïde ruptuur te voorkomen, zuigt u slechts 50 microliter medium uit elke put en voegt u de eerste 48 uur 100 microliter RPMI plus B27-medium per put toe. Zuig vervolgens 100 microliter van het medium uit elke put en voeg 100 microliter van het rijpingsmedium per put toe. Houd de cellen in het rijpingsmedium en ververs het medium om de twee tot drie dagen.

Plaats de sferoïde plaat gedurende 10 minuten op ijs voor het voorkoelen voordat u de plaat gedurende drie minuten op 70 g centrifugeert. Verwijder het medium totdat er 50 microliter in de put overblijft. Voeg vervolgens 200 microliter ijskoud hiPSC vriesmedium per put toe.

Sluit de plaat af met een plaatafdichtingsfolie. Om de siliconen mal voor te bereiden, mengt u de componenten van de siliciumelastomeerkit in een verhouding van 10 op 1 en voegt u de oplossing toe in het onderste deel van de putplaat. De-bubbel de oplossing met behulp van een vacuümpomp gedurende 15 tot 20 minuten.

Plaats de vorm in een oven en laat deze acht uur lang uitharden bij 60 graden Celsius om een semi-flexibel elastomeer te verkrijgen dat van de plaat wordt gepeld. Plaats de verzegelde plaat voorzichtig in een siliconen mal en zorg voor een gelijkmatige warmte-uitwisseling tussen de putplaat en de vriezer. Vries de plaat minimaal vier uur in op 80 graden Celsius in de voorbereide siliconenvorm voordat u de plaat overbrengt naar een tank met vloeibare stikstof of een vriezer van 150 graden Celsius voor langdurige opslag.

Om een snelle ontdooiing van cardiale sferoïden te garanderen, verzamelt u één celplaat met cardiale sferoïden tegelijk uit de vloeibare stikstof en plaatst u deze gedurende 15 minuten in de couveuse bij 37 graden Celsius, met 5% koolstofdioxide, 21% zuurstof en 90% vochtigheid. Verwijder de afdichtingsfilm van de plaat en zuig 150 microliter van elke put op voordat u 200 microliter van een warm basaal medium aan elke put toevoegt. Centrifugeer de plaat gedurende drie minuten op 70 g en herhaal de warme basale medium was.

Als u klaar bent, verwijdert u 150 microliter van het medium en voegt u 200 microliter cardiomyocyten toe aan het ontdooien van het medium in elke put. Herhaal vervolgens de RPMI-wassing zoals vermeld tijdens het genereren van cardiale sferoïden, gevolgd door het onderhouden van de cellen in de rijpingsmedia. Na een week van de kweek zijn de ontdooide hartsferoïden optimaal voor calciumverwerking van optische beeldvorming.

Zuig 150 microliter van elke put op. Behandel de ontdooide hartsferoïden met 100 microliter Cal-520 AM calciumkleurstofmedium per put in donkere omstandigheden en incubeer de plaat gedurende 60 minuten. Bereid een calciumacquisitie- en analysesysteem voor door de microscoop aan te drijven en ervoor te zorgen dat de omgevingscontroleoptie is ingeschakeld.

Pas de afmetingen van de camera en het diafragma aan om het achtergrondgebied te minimaliseren. Om het calciumsignaal te meten, met behulp van een laser van 488 nanometer, stelt u het contrast in op een zwarte achtergrond met een helder groen signaal tijdens de calciumafgifte. Neem een video op met een consistente stream van 2 tot 10 pieken binnen 10 seconden.

Neem een video van 10 seconden op en scan over de 96-putplaat, eerst naar links en vervolgens zigzaggend naar beneden om de hele plaat te bedekken. Na het verkrijgen van de calciumtransiënten, analyseert u de gegevens met behulp van fluorescentiesporenanalysesoftware. De cardiale sferoïden kregen op dag één na het zaaien een 3D-structuur, die tot zes weken kon worden gekweekt.

De meerderheid van de drie weken oude cardiale sferoïden drukte regelmatige sarcomeerorganisatie uit met alfa-actinine en troponine T. Hoge niveaus van alfa-actinine op dag nul en drie weken oude cardiale sferoïden wezen op een constante en zeer zuivere cellulaire samenstelling tijdens het kweken. Een verhoogde expressie van de cardiale genen, desmosomen en mitochondriën werden waargenomen in sferoïden dan hiPSC-CMs gekweekt in 2D gedurende 90 dagen. Het slagpercentage van cardiale sferoïden was vergelijkbaar in de eerste drie weken na de generatie en daalde aanzienlijk in week zes als gevolg van verslechtering van de cardiale sferoïden.

Het slagpercentage was aanzienlijk verminderd in week drie in vergelijking met en daalde in week zes als gevolg van verslechtering. Calciumtransiënte parameters wezen op een hogere piekwaarde in week twee, terwijl de stijgingstijd, vervaltijd en de calciumtransiënte duur bij 90% van het verval significant waren toegenomen in week drie, wat aantoont dat hiPSC-CM-afgeleide sferoïden functioneel optimaal waren in week twee en drie na generatie. De sferoïde grootte nam toe met het aantal cellen dat werd gebruikt voor het zaaien.

In grotere omvang, oude sferoïden, was het kloppen aanzienlijk hoger. Een vergelijkbare en significant hogere slagsnelheid werd getoond door 5k, 10k en 20k sferoïden in vergelijking met 2,5k sferoïden. Cryopreservatie had geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen in de cardiale sferoïden.

Vergelijkbare expressie van sarcomerische eiwitten in de ontdooide en verse leeftijdsgematchte sferoïden duidde op cryopreservatie-efficiëntie. Er was geen significante verandering in de slagsnelheid van ontdooide of verse cardiale sferoïden. Er werden geen significante veranderingen waargenomen in stijgingstijd, vervaltijd en de CTD90 van ontdooid of vers CS. Naast ziektemodellering en high-throughput medicijnscreenings, kunnen deze sferoïden ook worden gebruikt voor bioreactoren van extracellulaire blaasjesproductie en extracellulaire blaasje-gerelateerde therapieën.

Ook kan de biobanking van deze sferoïden worden gebruikt als een nieuwe cardiomyocytenvoorziening voor regeneratieve strategieën. Accumulerend bewijs suggereert dat biobanken van patiënt-afgeleide stamcelmodellen voor cystische fibrose, kanker en cardiale sferoïden een groot potentieel hebben voor het ontrafelen van moleculaire mechanismen voor medicijnscreenings en voor gepersonaliseerde geneeskunde.