Een fluorescerende intravitale beeldvormingsbenadering om door belasting geïnduceerde calciumsignaleringsdynamiek in osteocyten van muizen te bestuderen

Dit protocol biedt een manier om ingebedde osteocyten in vivo te observeren, wat een belangrijke vooruitgang betekent in de studie van botmechanobiologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om gebeurtenissen op cellulair en moleculair niveau in osteocyten in vivo te observeren, waardoor hun oorspronkelijke 3D-ruimtelijke opstelling, bloedstroom en endocriene omstandigheden behouden blijven en de beperkingen worden overwonnen die doorgaans worden opgelegd door in vitro cellulaire experimenten. Deze techniek is ontworpen voor fundamenteel wetenschappelijk onderzoek in muismodellen. Ze strekken zich nog niet uit tot therapie of diagnose, maar bieden wel de mogelijkheid voor inzichten die de volgende generatie botbehandelingen definiëren.

[Verteller] Maak om te beginnen een scalpelincisie door de dermis tussen het tweede en derde middenvoetsbeentje, beginnend bij het distale uiteinde en proximaal langs de lengte van de botten. Open met een tang de operatieplaats door de huid naar de mediale of laterale randen te trekken. Snijd de strekpezen opnieuw met een rechte Vannas-schaar om het derde middenvoetsbeentje bloot te leggen. Steek de middelste draaipuntpen van het middenvoetsbeentje in de kleine ruimte aan het distale uiteinde waar het derde middenvoetsbeentje het proximale vingerkootje ontmoet. Beweeg vervolgens de pen proximaal totdat deze op de middelste as van het derde middenvoetsbeentje rust. Wees extra voorzichtig om een directe interface tussen het bot en de pin te garanderen, met uitsluiting van spieren en fascia. Houd de enkel vast met een tang en plaats de voet in het met DPBS gevulde waterbad. Zet de poot op zijn plaats met de laadbeugel en sluit de beugel aan op de loadcellen van de actuator. Pak de opstelling van het laadapparaat voorzichtig op met de muis en plaats deze op het microscoopplatform. Begin met het objectief met lage vergroting in de epifluorescentiemodus om de middendiafyse van het bot te lokaliseren en te centreren. Nadat een interessegebied is gevonden, schakelt u over naar een hogere vergroting van het wateronderdompelingsobjectief en schakelt u de optiek over naar twee fotonen. Stel de pixeldichtheid in met behulp van de instellingen voor de controle van het Galvo/Resonantiegebied. Om verbleking van foto's te voorkomen, verlaagt u het vermogen met behulp van de energieregelingsoptie en verhoogt u de PMT-versterking in de bedieningsinstellingen van de Galvo/Resonance-scanner. Identificeer het oppervlak van het bot in twee fotonmodi door te zoeken naar de fibreuze periosteum autofluorescentie in het groene kanaal dat een banddoorlaatfilter gebruikt met een gecentreerd op 525 nanometer. Als er tijdens het laden een zichtbare beweging van het bot is, selecteert u een ander interessegebied in de Y- of Z-richting om er zeker van te zijn dat het zich direct boven de middelste draaipuntpen bevindt. Als de beweging aanhoudt, past u de chirurgische positie van de pin handmatig aan onder het derde middenvoetsbeentje. Voer Z-stackbeeldvorming uit met belasting volgens het experimentele ontwerp om de morfometrische signaleringsgebeurtenissen vast te leggen, en vervolgens T-serie beeldvorming met belasting om de door dynamische belasting geïnduceerde signaleringsgebeurtenissen vast te leggen. Een enkel vlak twee fotonbeeld van metatarsale osteocyten die GCaMp6f in vivo tot expressie brengen, wordt hier getoond. Endogene expressie van calciumreporterconstructies zorgt voor een fluorescerend doelwit zonder dat incubatie nodig is. In deze figuur wordt een 3D Z-projectie van osteocyten in vivo vastgelegd, vastgelegd met twee fotonenmicroscopie, weergegeven. De transversale snede in het XY-vlak en een sagittale snede tonen de diepte van de Z-stapel. De representatieve afbeelding toont een voorbeeld van een tijdsverloop van het GCaMp6f fluorescerende signaal van een ingebedde osteocyt. In rust worden lage luidruchtige fluctuaties vertoond. Bij belasting nemen de calciumfluctuaties toe in grootte en regelmaat, vaak in lijn met de toegepaste belasting.

Deze methode maakt de weg vrij voor onderzoekers om functionele vragen over osteocyt-mechanobiologie in vivo te beantwoorden die voorheen alleen in vitro of ex vivo mogelijk waren.