CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Het produceren van genetisch gemodificeerde muizen en het analyseren van hun fenotype stelt ons in staat om specifieke genfuncties in detail te begrijpen, in vivo. Tal van belangrijke bevindingen zijn ontdekt met behulp van gen-gemodificeerde diermodellen. De methode die we hier beschrijven, stelt lang DNA in staat om stamcellen te implanteren met een aanvaardbare efficiëntie voor zonder medicijnselectie.

De techniek is niet alleen gunstig voor de basislevenswetenschap, maar de bevindingen zullen ook worden geïmplementeerd in toegepaste wetenschappen zoals medische wetenschap en dierwetenschappen. Dr. Chihiro Emori, een assistent-professor, en Dr. Manabu Ozawa, een universitair hoofddocent van mijn laboratorium, demonstreren de procedure. Na het bereiden van de embryonale fibroblast van de muis, bereidt u de met gelatine bedekte celkweekschaal zoals beschreven in het manuscript en incubeert u deze gedurende twee uur in een vochtige incubator.

Verwijder de gelatine-oplossing, was de schaal twee keer met PBS en bewaar deze op kamertemperatuur tot gebruik. Ontdooi mitotisch geïnactiveerde bevroren MEF-voorraad met behulp van een waterbad getemperd op 37 graden Celsius gedurende één minuut. Leg de MEF een dag voor het zaaien van ESC op een met gelatine bedekte schaal van 60 millimeter.

Ontdooi een bevroren ESC-voorraadbuis zoals eerder getoond en plaats één keer 10 tot de vijfde SER's op een schaal van 60 millimeter met voorgezaaide MEF. Voeg vervolgens vier milliliter ESC-cultuurmedium toe en incubeer het gerecht totdat de ESC 50 tot 70% samenvloeiing bereikt. Na het wassen van de gekweekte ESC met vier milliliter PBS, verteer ze met 800 microliter 0,25% trypsine EDTA-oplossing gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Zodra het trypsine is geïnactiveerd met één milliliter ESCM, voegt u een milliliter vers ESCM toe aan de cellen, brengt u het medium over in een buis en pelleteert u de cellen door centrifugering bij 280 G gedurende vijf minuten. Na resuspendatie van de cellen in één milliliter vers ESCM, telt u de celconcentratie met behulp van een celteller met trypanblauwe kleuring. Na één keer 10 naar de vijfde SER's te hebben overgebracht naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter en ze driemaal te hebben gewassen met PBS door centrifugatie, resuspenseer je de ESC-pellet in 12 microliter Cas9 RNP DNA-mengsel en meng je goed door zacht pipetteren om borrelen te voorkomen.

Serveer vervolgens de gesuspendeerde ESC voor elektroporatie. Kweek vervolgens de geëlektropoeerde SER's in een schaal van 60 millimeter met vier milliliter ECSM met mitotisch geïnactiveerde MEF en blijf het medium dagelijks veranderen. Drie tot vijf dagen na de elektroporatie, was de SER's met vier milliliter PBS en verteer ze vervolgens met 800 microliter van 0,25% trypsine EDTA en kweek in een vochtige incubator.

Voeg daarna twee milliliter ESCM toe om de trypsinevertering te stoppen. Zodra het celmengsel is gepelletiseerd, resuspenseert u de pellet in één milliliter verse ESCM en telt u de celconcentratie met behulp van een celteller met trypanblauwe kleuring. Passeer de SER's op één keer 10 naar de derde cellen per schaal van 60 millimeter met ESCM en feeder MEF.

Zorg ervoor dat u het medium verwisselt totdat de kolonie oppakt. Voeg vijf tot zeven dagen na de eerste passage, zodra de ESCM is geaspireerd uit het ESC-cultuurgerecht, vier milliliter PBS toe. Pak met behulp van een pipet van 20 microliter enkele ESC-kolonies op met vijf microliter PBS onder een stereomicroscoop.

Plaats de afzonderlijke kolonies in een putje van een ronde bodemplaat met 96 putten met 15 microliter 0,25% trypsine EDTA-oplossing. Na het incuberen van de 96-well plaat, stop trypsine spijsvertering door 80 microliter ESCM toe te voegen en ESC-kolonies in enkele cellen te dissociëren door te pipetteren. Breng voor PCR-genotypering 40 microliter ESC-suspensie over op een gelatinegecoate, feedervrije plaat met 96 putten met 50 microliter ESCM per put.

Om de bevroren ESC-voorraad te maken, brengt u de resterende 60 microliter ESC-suspensie over in een put van een met gelatine beklede 24-wellsplaat met 500 microliter ESCM en feeder MEF. Stock individuele ESC-klonen gekweekt in de 24-well plaat totdat ze 60 tot 80% confluency bereiken en individuele ESC-klonen herstellen door trypsinisatie, zoals eerder aangetoond. Na het verkrijgen van de celpellet door centrifugatie, resuspenseer je de in 500 microliter celbevriezingsmedium om de cellen te bevriezen bij min 80 graden Celsius.

Voor PCR-genotypering kweekt u ESC-klonen zoals eerder aangetoond en verwijdert u ESCM uit elke put door aspiratie voordat u het tweemaal met 100 microliter PBS wast. Voeg na het aanzuigen van de PBS 100 microliter lysisbuffer met proteïnase K toe en meng goed. Breng het ESC-lysaat nu over op een nieuwe buis van 1,5 milliliter en bewaar het minstens een uur in een warmtekamer bij 65 graden Celsius.

Zodra het genomische DNA is opgelost in 20 microliter DNase-vrij water, bepaalt u de zuiverheid en concentratie van DNA met behulp van een spectrofotometer. Na het uitvoeren van genomische PCR met behulp van locus-specifieke primersets om het doelgebied te versterken, controleert u de volgorde en kiest u de ESC-klonen met de gewenste knock-in-sequenties. Na het paren van de met hormonen behandelde vrouwtjes met de ICR-mannetjes en het verzamelen van de eileider, plaatst u de verzamelde eileiders in FHM-druppels en herstelt u de embryo's van het tweecellige of viercellige stadium door de eileider met FHM te spoelen met behulp van een spoelnaald die in het infundibulum is ingebracht.

Was de verzamelde embryo's door ze met een mondpipet in verschillende verse FHM-druppels te verplaatsen. Kweek de embryo's in 50 microliter KSOM-druppels op een celkweekschaal van 35 millimeter bedekt met minerale olie zoals eerder aangetoond gedurende één dag totdat het achtcellige of morulastadium is bereikt. Bereid glazen pipetten voor het vasthouden van de embryo's en ESC-injectie met behulp van een trekker en microforge.

Nadat u een holdingpipet met FHM hebt geïntegreerd in een capillaire houder die is aangesloten op een micro-injector, plaatst u deze aan de linkerkant van de micromanipulator. Sluit een injectiepipet aan op een andere microinjector en plaats deze aan de rechterkant. Lijn de twee pipetten recht uit in het gezichtsveld van de microscoop.

Maak druppels van vijf microliter van 12% polyvinylpyrrolidon en vijf microliter druppels FHM op hetzelfde deksel van een schaal van 60 millimeter, naast elkaar. Bedek de druppels met minerale olie. Breng de embryo's over in vijf microliter FHM-druppel en voeg één tot vijf microliter van de ESC-suspensie toe aan de embryobevattende FHM-druppel.

Zodra de injectiepipet is gewassen met polyvinylpyrrolidon, verplaatst u de injectiepipet naar de druppel met de embryo's en SER's. Kies drie individuele ESC-doubletten die net klaar zijn met hun celdeling in de injectiepipet. Houd met behulp van de holdingpipet een embryo met acht cellen of morulastadium vast dat de verdichting door aspiratie heeft voltooid en maak een gat in de zona pellucida met een piëzo-elektrische puls.

Verwijder de zescellige ESC in de zona pellucida en trek de pipet uit de embryo's. Was de ESC-geïnjecteerde embryo's met verschillende KSOM-druppels voorzichtig met behulp van een mondpipet en incubeer ze in een nieuwe KSOM-druppel van 50 microliter bedekt met minerale olie, zoals eerder aangetoond, totdat de embryo's zich ontwikkelden tot het blastocyststadium. Een PCR-amplicon van grootte specifiek voor het knock-in doel wordt verkregen en 9 van de 22 klonen vertoonden een knock-in-specifieke band.

Deze resultaten zijn efficiënt en reproduceerbaar voor gen knock-in zonder medicijnselecties. Het oppakken van de optimale grootte van ESC-kolonies is vrij belangrijk voor deze procedure. Vermijd het selecteren van kolonies die te groot of te klein zijn.

CRISPR Cas9-gemedieerde directe genoombewerking met behulp van een zygote zou toepasbaar zijn voor het maken van eenvoudige gen knock-out muizen. Dit CRISPR Cas9-gemedieerde ESC-gentargetingprotocol vergemakkelijkt de productie van verschillende genetisch gemodificeerde muizen voor toekomstige analyse in de biowetenschappen.