Het volgen van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel met behulp van luciferase-getransduceerde menselijke T-cellen

Met deze methode kunnen gebruikers eenvoudig T-cellen in vivo volgen om de kinetiek van homing te evalueren en de persistentie van T-cellen te controleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het op meerdere tijdstippen op hetzelfde dier kan worden herhaald zonder dat er offers nodig zijn in flowcytometrie of immunohistochemie. Deze techniek kan ook worden aangepast voor het volgen van andere soorten immuuncellen.

Om 293T-cellen te kweken, bereidt u een liter DMEM voor door 110 milliliter warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 11 milliliter penicilline-streptomycine toe te voegen. Ontdooi vijf maal 10 tot de zesde 293T-cellen en breng ze over in een T175-kolf met DMEM. Splits de cellen één tot 10 om de drie dagen gedurende zes dagen voordat de cellen meer dan 90% confluent worden.

Breng voor transfectie 1,5 milliliter media over naar twee buizen van 50 milliliter met behulp van een pipet. Voeg aan één buis 10 microgram VSVG-plasmide, 20 microgram gag pol en 20 microgram klikkever rode TDtomato of CBRTDR luciferaseplasmide toe en meng. Voeg 100 microliter DNA in vitro transfectiereagens toe aan een andere buis en meng.

Incubeer beide buizen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng de media die het DNA in vitro transfectiereagens bevatten druppelsgewijs over naar de buis met de DNA-plasmiden en meng voorzichtig met een pipet. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Maak tijdens de incubatie de 293T-cellen los door vijf tot 10 milliliter 0,05% trypsine toe te voegen. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u 10 milliliter media toe en centrifugeert u gedurende vijf minuten op 800 G. Resuspendeer de cellen in 1,5 milliliter media.

Voeg de media met het DNA in vitro transfectiereagens en de DNA-plasmiden toe aan de 293T-cellen en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Breng na incubatie de suspensie over in een T175-kolf. Voeg 18 milliliter media toe en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius.

Zuig de media de volgende dag voorzichtig op met een glazen pipet zonder de cellen los te maken en vervang deze door 18 milliliter verse media. Nogmaals, incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Verwijder de volgende dag het virale supernatant met behulp van een pipet op ijs en centrifugeer gedurende vijf minuten op 800 G om de cellen en het puin te pelleteren.

Filter het virale supernatant met een filter van 0,22 micron en plaats het onmiddellijk op ijs. Voeg voor in vitro activering van menselijke T-cellen 10 milliliter PBS met 0,1% runderserumalbumine of BSA en twee millimolaire EDTA toe aan een steriele buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens om de kralen te wassen kralen toe aan een buis en plaats de buis in een magnetisch rek.

Verwijder na twee minuten de PBS uit de buis. Voeg na het bereiden van DMEM gewassen kralen en interleukine-2 of IL-2 toe aan een uiteindelijke concentratie van 30 internationale eenheden per milliliter. Tel de T-cellen met behulp van een hemocytometer en Trypan-blauwe vlek.

Voeg na het tellen het gewenste aantal T-cellen toe aan de media en keer de buis voorzichtig om om te mengen. Plaat 2,5 milliliter media met twee miljoen T-cellen, kralen en IL-2 in elke put van een 24-well weefselkweekplaat. Kweek bij 37 graden Celsius in bevochtigd 5% koolstofdioxide.

Onderzoek de T-cellen onder een 20X-doelstelling elke dag gedurende drie dagen om te bepalen wanneer te transduceren met luciferase. Voeg vervolgens, om een RetroNectine-plaat te bereiden, twee milliliter van 20 microgram per milliliter RetroNectin in PBS toe aan een put van een onbehandelde zesputplaat en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Zuig de RetroNectin aan zonder krassen op de bodem van de plaat en voeg drie milliliter 2% BSA in PBS per put toe aan de plaat met zes putjes.

Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, voor spinoculatie, zuig de BSA op en was de putjes eenmaal met drie milliliter PBS. Ga door of vervang door verse PBS en laat de plaat een nacht afgedekt bij vier graden Celsius.

Voeg de volgende dag twee milliliter CBRTDR luciferase viraal supernatant per put toe en centrifugeer op 1.240 G gedurende 90 minuten bij 32 graden Celsius. Voor transductie, na het tellen van de T-cellen, zuigt u het virale supernatant op en plaatst u twee miljoen T-cellen per put in zes milliliter DMEM met 30 internationale eenheden per milliliter menselijk IL-2. Onderzoek de T-cellen gedurende twee dagen.

Wanneer de cellen bijna samenvloeien, spoelt u ze voorzichtig van de bodem van de plaat met behulp van een pipet en brengt u elk putje over in een aparte T75-kolf. Voeg negen milliliter media toe voor een totaal volume van 15 milliliter per kolf. Voeg de volgende dag 15 milliliter media toe en bevestig succesvolle transductie door flowcytometrie uit te voeren.

Na het verdoven van de muis, met behulp van een naald van 26 gauge, injecteert u 20 miljoen T-cellen retroorbitaal in 100 microliter media. Dien 1.000 eenheden recombinant IL-2 subcutaan toe om de overleving van T-cellen in vivo te ondersteunen. Dien vervolgens het bispecifieke antilichaam retroorbitaal of intraperitoneaal toe.

Voor in vivo beeldvorming, dien 100 microliter van drie milligram D-luciferine toe door retroorbitale injectie met een naald van 26 gauge in een verdoofde muis. Om beelden vast te leggen, plaatst u de muis in de lichtdichte kamer van de imager, zodat de flank met de xenograft naar boven naar de camera is gericht. Selecteer met behulp van het bedieningspaneel voor acquisitie lichtgevende, foto- en overlay.

Stel de belichtingstijd in op automatisch, het binning op medium en f-stop op één en verkrijg afbeeldingen. Stel na de eerste afbeelding de belichtingstijd zo in dat deze overeenkomt met de automatisch berekende belichtingstijd voor de eerste afbeelding, zodat volgende afbeeldingen rechtstreeks kunnen worden vergeleken. Maak een andere reeks afbeeldingen met de muis in rugligging om de aanwezigheid van T-cellen in de longen te evalueren.

Gewapende T-cellen smokkelden sneller naar de tumor dan ongewapende T-cellen, waardoor de longen twee dagen eerder werden verlaten. Kwantificering van T-celinfiltratie in tumoren in de loop van de tijd werd gemeten door bioluminescentie en uitgedrukt als totale koppels of uitstraling per pixel geïntegreerd over de tumorcontour. T-celhandel kon gedurende 28 dagen na injectie van de luciferase-getransduceerde T-cellen worden gevolgd, waardoor T-cel homing en persistentie tijdens de behandeling konden worden gevolgd.

T-celhandel in HER2-positieve menselijke borstkankerpatiënt-afgeleide xenografts in DKO-muizen wordt getoond. Behandeling met het HER2 bispecifieke antilichaam met een niet-gedempt FC had geen effect op de tumorgroei in vergelijking met een gecontroleerd bispecifiek antilichaam. Daarentegen was behandeling met HER2 bispecifiek antilichaam met N297A-mutatie alleen of in combinatie met een K322A-mutatie in staat om de tumorgroei volledig te stoppen.

Voor groepen met de uitschakelingsmutaties bereikte het T-cel luminescentiesignaal een hogere piek op dag drie na de injectie en bleef het op een hoger niveau in vergelijking met het gecontroleerde bispecifieke antilichaam en het niet-gesilenceerde HER2 bispecifieke antilichaam. Muizen met neuroblastoom patiënt-afgeleide xenografts toonden uitputting van Ly6C-positieve macrofagen significant verhoogde T-cel homing aan tumoren, wat resulteerde in verminderde tumorgroei en verlengde overleving. Het effect was meer uitgesproken bij osteosarcoom patiënt-afgeleide xenografts.

Onder bispecifieke antilichamen gericht op het tumorantigeen STEAP1 resulteerde het IGGL SCFV-formaat in significant meer T-celinfiltratie op dag zes na de eerste dosis T-cellen die aanhield gedurende de duur van de behandeling. Dergelijke waarnemingen werden niet voorspeld door in vitro cytotoxiciteitstests. Na het volgen van T-cellen in vivo, kunnen gebruikers nog steeds immunohistochemie uitvoeren om specifieker te bepalen waar de T-cellen zich in de tumor of andere normale weefsels bevinden.