Een muismodel voor de overgang van Streptococcus pneumoniae van kolonisator naar pathogeen bij virale co-infectie vat leeftijdsverergerde ziekte samen

Deze methode beschrijft een nieuw muismodel voor het bestuderen van de overgang van pneumokokken van een asymptomatische kolonisator naar een ziekteverwekkende ziekteverwekker tijdens virale infectie. Het bootst beter na wat er bij mensen gebeurt. Dit model kan een belangrijk hulpmiddel zijn voor het identificeren van potentiële therapeutische doelen tegen de secundaire pneumokokkenpneumonie bij gevoelige gastheren.

Dit model reproduceert de gevoeligheid van veroudering. Daarom kan het worden gebruikt om te begrijpen welke aspecten van de gastheer defect raken met de leeftijd en ons in staat stellen om behandelingsopties op maat te maken voor kwetsbare oudere gastheren. Het kweken van pneumokokkenbiofilm is een uitdaging omdat de verschillende stammen verschillende hoeveelheden tijd in beslag nemen.

Mijn advies is om te proberen de biofilm te kweken voordat je de dierstudie uitvoert. Zodra de H292-cellen 100% confluent zijn, wast u de cellen driemaal met PBS. Voeg vervolgens 250 microliter 4% paraformaldehyde per put toe om de cellen te fixeren en incuber gedurende een uur op ijs of 's nachts bij vier graden Celsius.

Strake streptococcus pneumoniae stam van belang op bloed agar plaat en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag ent u de bacteriën van de plaat in verse, chemisch gedefinieerde media of CDM plus Oxyrase door de bacteriën van de plaat te wassen door een milliliter van het CDM plus Oxyrase toe te voegen en de bacteriekolonies voorzichtig op te tillen met behulp van de zijkant van een pipetpunt van één milliliter, waarbij u voorzichtig bent om de agar niet te schrapen. Verdun de bacteriecultuur in CDM plus Oxyrase tot een start-OD 600 van 0,05.

Laat de bacteriën vervolgens groeien in een losjes afgedekte conische buis van 50 milliliter bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat OD van 0,2 is bereikt. Vervolgens vortex de bacteriële kweekbuis. Zaai 0,5 milliliter van de cultuur op de vaste H292-cellen en voeg nog eens 0,5 milliliter CDM plus Oxyrase-medium per put toe.

Voeg CDM plus Oxyrase toe aan de controleputten zonder bacteriën. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 34 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang elke 12 uur, na het eerste zaaien, voorzichtig de 0,5 milliliter van het medium door vers CDM plus Oxyrase.

Pas op dat u de vorming van biofilm niet verstoort. Controleer de onderkant van de plaat op biofilm en zoek naar toenemende bewolking naarmate de tijd vordert als gevolg van biofilmgroei. Verwijder na 48 uur het supernatant en was de biofilm tweemaal met één milliliter PBS.

Suspendeerde vervolgens de biofilm in één milliliter vers CDM en pipet krachtig op en neer om de biofilm op te tillen. Voeg voor elke bacteriestam de cultuur uit alle putten samen in een buis van 50 milliliter. Meng goed door de strak afgedekte buis een paar keer voorzichtig op en neer te kantelen.

Voeg vervolgens 40% glycerol en CDM toe bij gelijke volumes om een bacteriële suspensie te bereiken met een eindconcentratie van 20% glycerol. Aliquot een milliliter in een microcentrifugebuis, flash bevriest op droogijs en bespaart bij min 80 graden Celsius. Ontdooi de biofilm gekweekte aliquots op ijs en draai op 1.700 G gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg zonder de pellet te verstoren. Was de pellet vervolgens door deze opnieuw te laten zweven in één milliliter PBS en draai hem opnieuw. Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in het volume dat nodig is om de gewenste concentratie te bereiken.

Ent de C57 zwarte zes mannelijke muis intranasaal met vijf maal 10 tot de zesde kolonievormende eenheden of CFU door vijf microliter van het verdunde entmateriaal in elke naris te pipetteren. Houd de muis na inenting stevig vast en stabiliseer het hoofd totdat het volume wordt ingeademd. Zodra het virus is ontdooid, verdunt u het virus in PBS tot de gewenste concentratie.

Plaats oftalmisch glijmiddel op de ogen van de muis voorafgaand aan de anesthesie. Infecteer de verdoofde muis onmiddellijk met 50 microliter van 20 plaquevormende eenheden, of PFU, van influenza A-virus of IAV intratracheaal door een stomp pincet te gebruiken om de tong uit de mond te trekken en het volume vloeistof door de luchtpijp te pipetteren. Na herstel intranasaal 10 microliter 200 PFU IAV intranasaal enten met behulp van de eerder beschreven inentingsmethode.

Voor het verzamelen van longen, met behulp van een dissectieschaar, knipt u de zijkanten van de blootgestelde ribbenkast en trekt u de ribben voorzichtig omhoog naar de kop van de muis om het hart bloot te leggen. Steek een naald van 25 gauge bevestigd aan een 10 milliliter spuit voorgevuld met PBS in de rechter ventrikel en begin langzaam te persen. Zoek naar bleken van de longen als een indicator van succesvolle perfusie.

Spoel langzaam om te voorkomen dat het longweefsel breekt. Til het hart op met een tang en maak een snee om de longen en het hart te scheiden. Eenmaal gescheiden, pak alle lobben van de long op met een tang en spoel in een schaal met steriele PBS om eventueel achtergebleven bloed te verwijderen.

Hak in een petrischaaltje de long in kleine stukjes en meng goed. Verwijder de helft van het longmengsel om de bacteriële CFU of virale PFU te bepalen en plaats deze in een ronde bodembuis van 15 milliliter voorgevuld met 0,5 milliliter PBS voor homogenisatie. Verwijder de andere helft van de long voor flowcytometrie en plaats deze in een niet-weefselkweek behandelde 24-well plaat met elke put voorgevuld met 0,5 milliliter RP10.

Laat op kamertemperatuur staan tot de verwerking. Om het verzamelde weefsel te homogeniseren, reinigt u de homogenisatorsonde door deze in 70% ethanol te plaatsen en de homogenisator gedurende 30 seconden op 60% vermogen in te schakelen. Herhaal deze stap gedurende 10 seconden in steriel water.

Homogeniseer elk weefsel gedurende één minuut. Voor het opsommen van bacteriële nummers, plaat seriële verdunningen op bloed agar platen. Om de totale CFU te berekenen, gebruikt u 10 microliter om te platen en noteer u het uiteindelijke volume in milliliter voor elk monster.

Plaats de nasopharynxmonsters op bloedagarplaten aangevuld met drie microgram per milliliter gentamycine om de groei van S pneumoniae te selecteren en tegelijkertijd de groei van andere micro-organismen te remmen. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg voor flowcytometrie 500 microliter verteringsbuffer toe aan elke put van een 24-putplaat met een longmonster.

Incubeer de plaat gedurende 45 minuten tot een uur. Beweeg vervolgens met behulp van een P-1000 micropipet de verteerde longen en plaats ze op het filter. Gebruik vervolgens de zuiger van een spuit van drie milliliter om het monster te pureren.

Biofilmgroei S.pneumoniae inoculum resulteert in een consistente pneumokokkenwagen beperkt tot de nasopharynx terwijl systematische verspreiding wordt vermeden. De ziektepresentatie bij S pneumoniae IAV co-geïnfecteerde muizen was afhankelijk van de bacteriestam. Hoewel er geen significant verschil was in bacteriële aantallen van de nasopharynx tussen een van de stammen, verspreidden S pneumoniae, TIGR4 en D39, maar niet EF3030 zich 48 uur na IAV-infectie naar de longen.

40% van de muizen geïnfecteerd met S pneumoniae TIGR4 vertoonde bacteriële verspreiding naar de longen en daarvan werd de helft bacteremic. Muizen geïnfecteerd met S pneumoniae D39 vertoonden 100% verspreiding naar de longen en de helft daarvan ervoer bacteriëmie. Bij het volgen van de totale overleving, ongeacht de bacteriestam, was de overlevingskans van mede-geïnfecteerde muizen significant lager dan de muizen die afzonderlijk werden uitgedaagd met S pneumoniae.

Dit model werd ook gebruikt om de aanwezigheid van verschillende immuuncellen in de longen na IAV-infectie te beoordelen. De bacteriestammen D39 en TIGR4 veroorzaakten een significante toename boven de uitgangswaarde in de instroom van inflammatoire immuuncellen uit de circulatie, zoals neutrofielen en monocyten, terwijl EF3030 dat niet deed. IAV-infectie alleen veroorzaakte een significante toename boven de uitgangswaarde in de instroom van immuuncellen zoals NK-cellen en gammadelta T-cellen.

Deze antivirale reacties waren significant afgestompt bij muizen intranasaal geïnfecteerd met S pneumoniae voorafgaand aan virale challenge. Bij enkelvoudig geïnfecteerde muizen varieerden de virale titers niet tussen de jonge en oudere cohorten. Oude muizen vertoonden eerdere en aanzienlijk ernstigere ziekteverschijnselen en stierven sneller, binnen 24 uur, terwijl de jonge controles de infectie beter overleefden.

Door transport en ziekte in verschillende stappen te scheiden, kunnen we zowel de immuunrespons als de bacteriële en of virale factoren onderzoeken die belangrijk zijn in verschillende fasen van ziekteprogressie. We hopen dat dit model door andere laboratoria zal worden aangepast om andere polymicrobiële interacties en interacties met gastheerpathogenen te bestuderen tijdens verschillende fasen van ziekteprogressie en tussen de verschillende gastheren.