In vitro Methode om op geslacht gebaseerde verschillen in conjunctivale bekercellen te bestuderen

Door de functie van de bekercel in de primaire cultuur te bestuderen, krijgen we waardevolle inzichten in de mechanismen achter de op geslacht gebaseerde verschillen in de gezondheid van het oogoppervlak. We hebben de reeds gevestigde conjunctivale bekercel primaire kweekmethode aangepast door hormonen en oestrogene stoffen uit het systeem te verwijderen, waardoor een nauwkeurigere controle van de geslachtshormoonspiegels mogelijk wordt. Deze wijziging verbetert de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van onze bevindingen.

De intracellulaire calciummeting is een methode om de functie van de bekercel onder verschillende stimuli en de intracellulaire signaalroutes die door elke stimulus worden geactiveerd, te bestuderen. De techniek kan worden uitgebreid tot de ontwikkeling van geneesmiddelen voor aandoeningen van het oogoppervlak, zoals oogallergie, droge ogen of conjunctivitis. Deze techniek vergemakkelijkt het screenen van het effect van verschillende moleculen op bekercellen onder specifieke hormoonspiegels.

Mensen die nieuw zijn met deze techniek hebben vaak moeite met het scheiden van bindvliesweefsel van bindweefsel. Ons advies is om goed te letten op de textuur en materiaaleigenschappen van het weefsel. Het bindvlies moet elastisch en semi-transparant zijn, terwijl het bindweefsel meestal lichter van kleur en katoenvezelachtig is.

Hak om te beginnen met een steriel scalpel het menselijke bindvliesweefsel in blokjes van een millimeter. Zaai in een plaat met zes putjes vier stukken in elk putje met één millimeter compleet RPMI-medium. Zorg ervoor dat u de stukken aan de plaat verankert.

Incubeer de weefselstukken bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 95% lucht. Ververs het kweekmedium om de dag. Verwijder na 72 uur na het zaaien de weefselplug en ga door met incuberen totdat de bekercellen 70 tot 80% samenvloeiing bereiken.

Spoel vervolgens de cellen met PBS en voeg 0,05% trypsine EDTA toe om de cellen los te maken van de onderkant van de plaat. Observeer de celloslating onder een microscoop. En zodra de cellen loskomen, voeg je een volledig RPMI-medium toe om de trypsine te deactiveren.

Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 150 g en resuspendeer de pellet in fenolroodvrij RPMI-medium. Vervolgens zaait de celsuspensie opnieuw in op een kweekschaal met glazen bodem voor intracellulaire calciumconcentratiemeting. Voeg voor het laden van Fura-2 AM Krebs-Ringer-bicarbonaatbuffer met 0.5% HEPES, 0.5% BSA en 0.5 micromolair Fura-2 AM, acht micromolair pluronzuur F127 en 250 micromolair sulfinpyrazon toe aan de glazen bodemschaal met bekercellen.

Incubeer de cellen gedurende een uur bij 37 graden Celsius en bescherm ze tegen licht. Was de cellen na incubatie met Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer die 250 micromolair sulfinpyrazon bevat. Voor het meten van de intracellulaire calciumconcentratie plaatst u de schaal met cellen geladen met Fura-2 onder de microscoop.

Voeg vervolgens een vergroting van 200 keer toe. Zoek een representatief veld met 20 tot 50 cellen. Teken met behulp van de functie uit de vrije hand een omtrek rond elke cel om deze te onderscheiden van de achtergrondfluorescentie en wacht tot de software automatisch de achtergrondfluorescentie van de meting aftrekt.

Klik op de knop Experiment starten en wacht acht tot 15 seconden om de basiscalciumspiegels in de cellen te bepalen. Voeg vervolgens voorzichtig de cholinerge agonist carbachol toe en blijf ten minste 120 seconden meten of totdat de calciumspiegels zijn teruggekeerd naar de uitgangswaarde. Bereken met behulp van de verandering in de maximale intracellulaire calciumconcentratie het gemiddelde basale calciumgehalte in elke cel vanaf de eerste acht tot 15 seconden van de metingen.

Verwijder cellen met een gemiddeld basaal calciumgehalte gelijk aan of hoger dan 500 nanomolair uit de dataset. Bereken vervolgens de maximale intracellulaire calciumconcentratie voor elke cel. Trek vervolgens de basale calciumspiegelwaarde af van de maximaal gemeten intracellulaire concentratie voor dezelfde cel.

Bereken ten slotte het gemiddelde van de verandering in de maximale intracellulaire calciumconcentratie voor alle cellen in een schaaltje. De zuiverheid van menselijke conjunctivale bekercellen werd bevestigd via immunofluorescerende kleuring, waarbij gebruik werd gemaakt van antilichamen die specifiek zijn voor de kelkcelmarkers, cytokeratine en Helix pomatia lectine 1. De resultaten van de Fura-2 AM-test toonden geen significante verschillen tussen cellen die waren geïncubeerd in fenolroodvrij RPMI met 1% BSA en volledig RPMI-medium.

Er werd echter een significante toename van de intracellulaire calciumrespons op carbachol waargenomen bij vergelijking van de geavanceerde RPMI-mediumgroep met de volledige RPMI-mediumgroep. Het belangrijkste is om een primaire menselijke bekercelkweek met voldoende celdichtheid te verkrijgen. Zorg er tijdens de groei voor dat de weefselstukjes aan de kweekplaat blijven plakken voor een effectieve uitgroei.

De onderzoekers zouden de betrokkenheid van specifieke routes kunnen onderzoeken door verschillende remmers, gericht op receptoren of signaalmoleculen op de cellen toe te passen vóór de stimulatie. De andere parameters die indicatief zijn voor de functie van de bekercel, zoals mucinesecretie en deactivering van mitogeen-geactiveerde proteïnekinasen, kunnen ook worden beoordeeld. De aanvullende metingen geven een uitgebreid inzicht in de reactie van de bekercellen op verschillende stimuli.