Modellering van menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro in 2D-structuur
16 september 2022
Het huidige protocol verklaart de generatie van een 2D-monolaag van cerebellaire cellen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het onderzoeken van de vroege stadia van cerebellaire ontwikkeling.
Deze methode kan helpen bij het bestuderen van de vroege ontwikkeling van cerebellen bij de mens en hoe deze kan worden veranderd bij neuropsychiatrische aandoeningen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is het genereren van ontwikkelingsmatig vroege menselijke cerebellaire cellen in een 2D-laagstructuur zonder ingewikkelde stappen uit te voeren. Het is ook kostenefficiënt.
Het maken van pull pipetten kan in het begin lastig zijn, maar met oefening en tijd wordt het gemakkelijker om de pipetten te trekken op een manier die gemakkelijker zal zijn om mee te werken. Begin de experimentele voorbereiding door een Pasteur-pipet van 22,9 centimeter ongeveer twee centimeter onder de nek te trekken, boven de bunsenbrander om twee glazen pipetten te maken. De dunnere kant zal ongeveer vier centimeter korter zijn dan de andere.
Buig de uiteinden van de getrokken kant op de vlam om een gladde R te creëren, plaats vervolgens de getrokken pipetten in autoclaafhulzen en steriliseer ze in een autoclaaf. Voeg op dag nul een milliliter cerebellair differentiatiemedium aangevuld met 10 micromolaire Y-27632 en SB-431542 toe aan elk putje van een zes-well ultra-low attachment, of ULA, plaat, en plaats het in de incubator totdat de opgetilde kolonies klaar zijn om aan de putten te worden toegevoegd. Reinig de gedifferentieerde cellen met een getrokken glazen pipet.
Aspirateer het medium en voeg een millimeter iPSC passaging oplossing toe voor elke 35 millimeter schotel. Na drie minuten incubatie bij 37 graden Celsius, aspirateer het medium en voeg twee millimeter cerebellair differentiatiemedium toe aangevuld met 10 micromolaire Y-27632 en SB-431542 Onder 4x vergroting van een omgekeerde microscoop met doorgelaten licht, til de kolonies op met behulp van de gebogen rand van de getrokken glazen pipet. Zodra elke kolonie is opgeheven, brengt u voorzichtig alle kolonies over naar één put van de zes-well ULA-plaat met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter.
Herhaal dit proces voor elke iPSC-plaat en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Voeg op dag twee FGF2 toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van 50 nanogram per milliliter aan te passen. Verander op dag zeven een derde van het medium door een milliliter verbruikt medium aan te zuigen en te vervangen door een milliliter vers cerebellair differentiatiemedium.
Incubeer de embryoïde lichamen gedurende zeven dagen. Draai op dag 14 de plaat om alle embryoïde lichamen in het midden van de plaat te verzamelen. Kantel vervolgens de plaat en zuig al het gebruikte medium aan met behulp van een pijptter van 1000 microliter vanaf de rand.
Naarmate de gemiddelde hoeveelheid afneemt, legt u de plaat langzaam plat en blijft u aspirateren, waardoor er voldoende medium overblijft om te voorkomen dat de embryoïde lichamen eruit worden getrokken. Voeg vervolgens drie milliliter vers cerebellair differentiatiemedium toe, aangevuld met 10 micromolaire Y-27632. Breng vervolgens de embryoïde lichamen over met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter naar een poly-L-ornithine laminin-gecoate schaal.
Op dag 15 aspirateer het medium en vervang het door vers cerebellair differentiatiemedium. Op dag nul werden iPSC-kolonies gereinigd en opgetild in cerebellair differentiatiemedium met SB-431542 en Y-27632 en werden ze in ultralage bevestigingsplaten geplaatst voor het genereren van embryoïde lichamen. De toevoeging van FGF2 op dag twee en een verandering van 1/3 medium op dag zeven resulteerde in embryoïde lichamen die op de 14e dag vergroting vertoonden.
Cellen begonnen op de 15e dag uit de embryoïde lichamen langs het gecoate oppervlak naar buiten te migreren. De volledige verandering van het medium naar cerebellair rijpingsmedium vanaf de 21e dag resulteerde in een monolaag van cellen met neuronale morfologie en complexiteit tegen de 35e dag. De genexpressieanalyse op dag 35 onthulde dat de cellen vroege cerebellaire voorlopermarkers tot expressie brengen, zoals glutamaterge voorlopers, ATOH1, GABAerge voorlopers, PTF1 alfa en de Purkinje-voorlopercelmarkers KIRREL2 en SKOR2.
Daarnaast werd ook de expressie van rhombic lip marker OTX2 en meestal anterieur neuron specifiek SIX3 waargenomen. De immunofluorescente etikettering van de cellen die op de 35e dag werden geoogst, toonde positieve kleuring voor de cerebellummarkers EN2 en PTF1 alfa, de neuronale marker bètatutuline III en de proliferatiemarker KI67. Nucleaire kleuring met 4'6-diamidino-2-fenylindool, of DAPI, toonde celkernen.
Voor een succesvolle differentiatie is het cruciaal om te beginnen met gezonde en ongedifferentieerde iPSC-kolonies en reagentia te gebruiken die zo vers mogelijk gereconstitueerd zijn.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de creatie van een 2D monolaag van cerebellaire cellen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), gericht op het onderzoeken van vroege cerebellaire ontwikkeling. Dit systeem maakt het mogelijk om mechanismen te onderzoeken die mogelijk betrokken zijn bij neuropsychiatrische stoornissen.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Cerebellaire Ontwikkeling
- Stamceldonderzoek
- Neuropsychiatrische Stoornissen
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen kunnen differentiëren in verschillende celtypen, inclusief cerebellaire neuronen.
- Het begrijpen van cerebellaire ontwikkeling is essentieel voor inzichten in ontwikkelingsstoornissen.
- Deze methode vereenvoudigt de generatie van cerebellaire cellen zonder complexe procedures.
- De kosteneffectiviteit van de methode maakt bredere toegang tot deze onderzoeksaanpak mogelijk.
Doel van het Onderzoek
- Om de vroege stadia van menselijke cerebellaire ontwikkeling te onderzoeken.
- Om veranderingen in de ontwikkeling te bestuderen die gerelateerd zijn aan neuropsychiatrische aandoeningen.
- Om een methodologie te bieden voor het produceren van cerebellaire cellen voor onderzoeksdoeleinden.
Gebruikte Methoden
- De primaire methode omvat celkweektechnieken om een 2D laag van cerebellaire cellen uit iPSC's te produceren.
- Het biologische model omvat cerebellaire voorlopers gegenereerd uit iPSC's, beginnend met gezonde ongedifferentieerde kolonies.
- Belangrijke experimentele stappen omvatten mediumvoorbereiding, kolonieoverdracht en getimede mediumverversingen op gespecificeerde dagen.
- Kritische fasen lopen van differentiatie geïnitieerd op Dag 0 tot maturatie beoordeeld op Dag 35.
Belangrijkste Resultaten
- Cellen vertoonden neuronaal-achtige morfologie en drukten belangrijke cerebellaire voorlopermarkers uit tegen Dag 35.
- Positieve immunofluorescente kleuring bevestigde de aanwezigheid van essentiële neuronale en cerebellaire markers.
- Cellen toonden migratie- en differentiatiekenmerken, wat onderstrept hun potentieel voor het modelleren van cerebellaire activiteit.
Conclusies
- De studie maakt de generatie van cerebellaire cellen uit iPSC's mogelijk voor gedetailleerde ontwikkelings- en pathologische studies.
- Deze aanpak biedt inzichten in cerebellaire ontwikkeling en de links ervan met neuropsychiatrische stoornissen.
- Het begrijpen van deze processen kan leiden tot innovaties in therapeutische strategieën voor gerelateerde aandoeningen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Modeling human cerebellar development in a 2D monolayer format enables pharmaceutical R&D teams to interrogate early neurodevelopmental mechanisms relevant to neuropsychiatric disease. This system provides a scalable, reproducible platform for studying molecular and cellular events underlying cerebellar differentiation, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The approach facilitates translational continuity from discovery biology to preclinical research for disorders with cerebellar involvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental pathways implicated in neurodevelopmental disorders.
- Supports functional validation of candidate targets in a human-relevant neuronal context.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling disease-relevant cell types and stages.
- Provides a platform for comparative analysis of gene expression and neuronal differentiation markers.
Screening & Assay Development
- Generates standardized 2D monolayer cultures suitable for high-content imaging and quantitative assays.
- Enables reproducible assessment of neuronal morphology and marker expression for assay development.
- Supports screening of compounds affecting cerebellar differentiation, neurite outgrowth, or synaptic connectivity.
- Provides a scalable system for downstream gene expression and physiological studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling for neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
- Enables investigation of molecular mechanisms underlying cerebellar dysfunction in translational studies.
- Supports risk-adjusted advancement of targets and pathways with human cellular evidence.
- Facilitates biomarker discovery and validation in a developmentally relevant context.
Pipeline & Workflow Integration
This 2D cerebellar differentiation protocol bridges early discovery and preclinical research by providing a human cell-based system for hypothesis testing and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of cerebellar development and disease mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables measurement of gene expression, neuronal markers, and morphological features for comparative analysis.
- Translational Research: Provides continuity for biomarker alignment and disease modeling in neurodevelopmental disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse R&D applications across neuroscience portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental research.
- Operational Value: Standardizes differentiation protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing early human-relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for neuropsychiatric indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, neuronal differentiation, and immunofluorescence analysis.
- Needs access to cell culture infrastructure, imaging systems, and molecular biology tools.
- Demands rigorous standardization of reagents and protocols for cross-team reproducibility.
- May require adaptation for different iPSC lines or disease-specific genetic backgrounds.
- Dependent on the quality of starting iPSC colonies and freshly prepared reagents for optimal outcomes.
