Een muismodel van enkel-subtalaire gewrichtsinstabiliteit

De succesvolle oprichting van het ASCJ-onvermogenmuismodel breidt een eenvoudig diermodel voor enkelonvermogen uit en biedt een nieuw concept voor de studie van de klinische voetziekten. We hebben een diermodel opgesteld dat beter aansluit bij de werkelijke klinische situatie, dat kan worden gebruikt voor verder onderzoek naar de diagnose en behandeling van voetziekten. Onderwerp de muizen een week voor het experiment aan evenwichtsbalk- en looptraining, waarbij je van het ene uiteinde van een evenwichtsbalk of U-vormige pijp naar het andere gaat, zonder te stoppen.

Na het verdoven en verwijderen van het haar op het enkelgewricht van de rechter achterpoten van de muis, desinfecteert u de blootgestelde huid met een jodiumuitstrijkje. Breng de muis over naar de operatiekamer voor microchirurgie met behulp van een steriel operatiekussen. Maak voor de transversale cervicale en anterieure talofibulaire ligamentgroepen een schuine neerwaartse longitudinale incisie van zeven millimeter met een scalpel op de huid boven het rechter enkelgewricht.

En sonde met een microscopisch kleine rechte pincet aan de voorkant van het enkelgewricht. Zorg voor de blootstelling van het voorste talofibulaire ligament aan de onderrand van het taluslichaam en het kuitbeen en snijd het voorzichtig door met een scalpel. Scheid de lange en korte fibulaire pezen en de extensor digitorum longus-pezen.

Leg het cervicale ligament bloot en snijd het door met een scalpel. Maak voor de transversale cervicale ligament plus deltoïde ligamentgroep een verticale incisie van acht millimeter op de mediale huid van het rechterenkelgewricht en scheid de DL botweg van de mediale malleolus om deze door te snijden. Knip vervolgens het cervicale ligament door zoals eerder aangetoond.

Voer voor de schijngroep een schijnoperatie uit aan het rechter enkelgewricht. Na het spoelen van de incisie met steriele normale zoutoplossing, hecht u deze met 5-0 chirurgisch nylondraad, gevolgd door het desinfecteren van de gehechte incisie met een jodiumwattenstaafje. Zodra de zwelling van het hoekgewricht twee weken na de operatie is verminderd, oefent u de muizen elke dag een uur in de roterende vermoeidheidsmachine van de muis.

Klem voor de evenwichtsbalktest een cirkelvormige houten balk aan het ene uiteinde onder een hoek van 15 graden vast met een fotostatiefclip en plaats het andere uiteinde op een werkoppervlak dat is aangesloten op een gesloten cassette. Voer een week voor de operatie een evenwichtsbalktraining uit om ervoor te zorgen dat de muizen soepel van het ene uiteinde van de balk naar het andere gaan. Beschouw een muis als geslaagd voor de test wanneer deze twee keer in 60 seconden door de straal gaat zonder te pauzeren.

Spuit na elke proef de evenwichtsbalk in met 75% alcohol om te voorkomen dat de restgeur van de vorige muis de volgende muis aantast. Voer de evenwichtsbalktest uit en noteer de gemiddelde tijd dat elke muis de evenwichtsbalk twee keer achter elkaar passeert. En het aantal keren dat de rechter achterpoot van de balk glijdt, als afhankelijke variabelen.

Voor voetafdrukanalyse plaatst u een U-vormig plastic kanaal op de experimentele tafel en sluit u het ene uiteinde van het plastic kanaal aan op een gesloten cassette. Leg een gewoon pigmentpapier plat in het kanaal. Houd vervolgens de muis met beide handen vast en schilder de voor- en achterpoten gelijkmatig met niet-giftig rood en groen pigment.

Plaats nu de geverfde muis aan het ene uiteinde van het kanaal en laat deze naar het andere uiteinde van de cassette gaan. Neem het gepigmenteerde papier met de voetafdrukken, markeer het en laat het drogen in een geventileerde en schaduwrijke ruimte. Spuit het U-vormige plastic kanaal in met 75% alcohol nadat elke muis is gepasseerd, om te voorkomen dat de restgeur van de vorige muis de volgende muis aantast.

Selecteer drie opeenvolgende duidelijke muisvoetafdrukken op elk papier. Meet met een liniaal de staplengte van de voetafdruk van de rechtervoet van de muis, met de stapbreedte tussen de linker- en rechtervoetafdruk. Gebruik een microscopisch pincet en schaar om overtollig zacht weefsel rond de enkelmonsters te verwijderen.

Plaats vervolgens de monsters in een centrifugebuis met een 10% EDTA-ontkalkingsoplossing en markeer de verschillende groepen. Plaats vervolgens de centrifugebuis op een schudtafel om te ontkalken. Ververs de ontkalkingsoplossing eenmaal per dag en bepaal de ontkalking van de monsters.

Na een maand ontkalking de monsters uitdrogen met gradiëntalcohol en vervolgens acht uur N-butanol gebruiken voor het opruimen. Dompel ten slotte de geklaarde monsters onder in paraffine in een coronale positie om in te bedden. Breng de monsters voor het snijden ongeveer 10 minuten over van de koelkast met vier graden Celsius naar een vriezer van min 20 graden Celsius, om het snijden van de volledige vlakken te vergemakkelijken.

Bevestig de monsters op de microtoom en snijd ze in een dikte van zes micrometer. Gebruik tegelijkertijd een microscoop om te observeren of de monsters op het verwachte niveau zijn gesneden, zodat een injectiespuitnaald gemakkelijk in het botweefsel kan worden doorgedrongen. Nadat u twee of drie volledige paraffinesecties achter elkaar hebt gesneden, brengt u ze over naar de tabletmachine, ingesteld op 40 graden Celsius, voor volledige expansie.

Verwijder vervolgens de paraffinesecties met een glasplaatje. Markeer ten slotte de dia's met groepen en nummers. Om de intacte ASCJ-voegstructuur onder een microscoop te observeren.

Plaats de secties gedurende 40 tot 50 minuten in een incubator op 60 graden Celsius. Ontdoe de secties vervolgens driemaal van was met xyleen, zoals beschreven in het manuscript. Plaats de gewaxte delen tweemaal gedurende drie minuten in 100% ethanol, gevolgd door 90% en 80% ethanol gedurende elk vijf minuten.

Was de secties vervolgens gedurende vijf minuten met dubbel gedestilleerd water. Nadat u een minuut in hematoxyline hebt geweekt, wast u de secties met dubbel gedestilleerd water totdat ze kleurloos worden. Week de secties 30 seconden in 1% zure ethanoldifferentiatieoplossing en was ze met dubbel gedestilleerd water.

Zodra de secties zijn gekleurd met 1% ammoniakoplossing en gewassen met dubbel gedestilleerd water, kleurt u de monsters gedurende één minuut met eosinekleuringsoplossing. En zet ze dan in 95% en 100% ethanol achter elkaar gedurende één minuut elk. Behandel ten slotte de secties gedurende één minuut met xyleen vier.

Laat de secties aan de lucht drogen en bedek ze met een afdekglaasje, nadat u een druppel neutrale hars op de preparaten op de objectglaasjes hebt geplakt. Maak vervolgens foto's met een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop in een helder veld bij vijf en 20X. Week de met hematoxyline en ammoniak bevlekte secties gedurende twee minuten in 0,05%fast green.

Gevolgd door het weken van de secties in 1% azijnzuuroplossing gedurende 30 seconden en 0,1% safranine gedurende vijf minuten. Verwerk de objectglaasjes vervolgens met ethanol en xyleen zoals eerder gedemonstreerd. Maak foto's met een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop in een helder veld bij 5X en 20X.

Na drie dagen, acht weken en 12 weken operatie duurde het voor de doorgesneden ligamentengroepen aanzienlijk langer om door de evenwichtsbalk te gaan dan de schijngroep. Vóór de operatie was de staplengte van de rechter achtervoet vergelijkbaar tussen de drie muizengroepen. 12 weken na de operatie was de staplengte echter korter in de ligamentsgesneden groep dan in de schijngroep.

Vóór de operatie is de thermische nociceptieresponstijd van de voeten van de muizen tijdens activiteit vergelijkbaar tussen de drie groepen muizen. Na de operatie vertoonden de muizen in de ligament-doorgesneden groep langere responstijden in vergelijking met de schijngroep. De ASCJ van de rechter achtervoet in doorgesneden ligamentgroepen vertoonde ruwe oppervlakken, ophoping van osteofyten, degeneratieve veranderingen.

En een significant hogere botvolumefractie dan de schijngroep. De kraakbeenlaag van de ASCJ in de ligamentsgesneden groep vertoonde discontinuïteit en een verminderd aantal chondrocyten. Ook waren de scores van Malkin en Osteoarthritis Research Society International van de muizen met ligamentamputatie significant hoger dan de schijngroep.

Het type twee collageen in de ASCJ-gewrichtskraakbeenlaag van de rechterachtervoet van de schijngroep was uniformer en hoger dan dat van de twee groepen muizen met doorgesneden ligamenten. Deze studie kan worden gebruikt voor de diagnose en de behandelingen voor enkelinstabiliteit, en biedt een experimentele referentie voor de klinische behandelingen van deze ziekte.