Een darm-op-een-chip-model om de darmmicrobioom-zenuwstelsel-as te bestuderen

Dit protocol is belangrijk omdat het voor het eerst een effect van een bacteriesoort op cellen van het enterische zenuwstelsel kan bestuderen. Omdat het enterische zenuwstelsel niet gemakkelijk toegankelijk is, maakt dit model het mogelijk om het effect van het darmmicrobioom op cellen van het enterische zenuwstelsel te bestuderen. In de toekomst kan dit model worden gebruikt om te zien hoe het darmmicrobioom van zieke patiënten cellen uit het enterische zenuwstelsel beïnvloedt, bijvoorbeeld bij de ziekte van Parkinson.

Een mogelijk toekomstig doel zou zijn om dit model te verbinden met andere organ-on-chip-modellen om een model te bouwen dat representatief is voor de darm-hersenas. De visuele demonstratie van deze techniek is van cruciaal belang, aangezien het protocol vele stappen omvat en elke stap cruciaal is voor deze succesvolle realisatie van dit model. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Catherine Sedrani, een promovenda van het System Ecology Laboratory.

Draai om te beginnen de schroeven vast, zet de boven- en onderkant van de klem vast en breng het gecoate en gedroogde onderste polycarbonaatdeksel over van de vierkante petrischaal naar de bovenkant van de klembasis door de vier schroeven op de hoek van het deksel vast te houden. Gebruik een steriel pincet om de pakking van de epitheelkamer te plaatsen met het membraan naar boven gericht op het deksel van polycarbonaat. Lijn de pakking en het deksel uit met schroeven en zorg ervoor dat de hoekinlaat- en uitlaatpoorten zijn uitgelijnd met de pakkingopeningen.

Plaats de sandwichpakking bovenop de collageenpakking met de bovenkant naar boven gericht. En plaats vervolgens het bovenste polycarbonaat deksel op de sandwichpakking. Zorg ervoor dat de weerhaken op het klemdeksel zijn uitgelijnd met de inlaat- en uitlaatopening van de membraanassemblages en dat de schroeven van het onderste deksel op de opening van het bovendeksel passen.

Om het apparaat te sluiten, plaatst u het klemdeksel op het polycarbonaat deksel en sluit u de vergrendelingen. Voor het aanzuigen van de slangleidingen steekt u de beluchtingsnaalden met filters in het septum van elke in- en uitstroomfles. Steek met een schoon steriel pincet de naalden van 120 millimeter in de serumflessen van 250 millimeter en de naalden van 80 millimeter in de serumflessen van 15 millimeter.

Steek de naalden van 40 millimeter aan het einde van elke slanglijn in een uitstroomserumfles. De naalden van 40 millimeter van de epitheliale en neuronale slanglijnen zijn verbonden met dezelfde uitstroomfles voor het weggooien van medium. De bacteriële buisleiding gaat naar de tweede uitstroomfles.

Steek de leidingen van de pompslang in de pompcassettes. Stel de peristaltische pomp in om media van de instroom naar de uitstroomfles te leiden met een snelheid van vijf RPM en druk op de startknop om de pomp te starten. Zorg ervoor dat de driewegafsluitkranen van de slangleidingen allemaal open zijn.

Zodra het medium in de uitstroomflessen valt, moet u ervoor zorgen dat er geen lekken of luchtbellen aanwezig zijn in de slangleidingen en aansluitpunten. Wanneer alle slangleidingen in de uitstroomflessen vallen, stelt u het debiet in op twee RPM om het eerste apparaat aan te sluiten. Om een leiding aan te sluiten, sluit u de driewegafsluiters, te beginnen met de uitstroomzijde.

Koppel de korte slang los van de vrouwelijke lokconnector en bevestig deze aan de uitlaatpoort van het apparaat door de slang over de weerhaak te duwen. Voor een veilige, lekvrije verbinding duwt u de slang helemaal naar beneden over de connector en zorgt u ervoor dat deze contact maakt met het deksel. Open de kraan zodra een lijn volledig op het apparaat is aangesloten.

Stel het debiet van de pomp in op twee RPM en verhoog de pompsnelheid tot maximaal 2.5 RPM om lekkages als gevolg van drukopbouw te voorkomen. Laat de pomp de kamers vullen. Verlaag de pompsnelheid tot 0.5 RPM zodra alle kamers zijn gevuld met het celkweekmedium en er geen luchtbellen in het apparaat achterblijven.

Voor de epitheelcellen maakt u de Caco-2-cellen los van de kolf met behulp van trypsine-EDTA. Suspendeer ze opnieuw in RPMI 1640 plus 10%FBS en tel ze in een Neubauer-celteller met behulp van de trypanblauwe uitsluitingstest. Centrifugeer de suspensie van Caco-2-cellen gedurende drie minuten bij 300 G en gooi het supernatans weg om de resterende trips in EDTA te verwijderen.

Resuspendeer de Caco-2-cellen in RPMI 1640 plus 10%FBS om een suspensie van 0,35 miljoen cellen per milliliter te verkrijgen. Breng 1,5 milliliter van de Caco-2-celsuspensie over in een steriele spuit van twee milliliter en verwijder eventuele resterende luchtbellen in de spuit. Sluit de driewegafsluiters op de slang van zowel de bacteriële als de neuronale kamer en koppel de slang los van de pomp door de cassettes met de betreffende slang van de rotor te verwijderen.

Open de dop van de kraan van de instroomslang die naar de epitheelkamer leidt en draai aan de klep om de mediumstroom van het apparaat naar de open connector om te leiden. Laat het medium stromen totdat er een druppel van het medium verschijnt aan het open uiteinde van de afsluiter. Steek de spuit met epitheelcellen in de open connector met behulp van de druppelverbindingsmethode om te voorkomen dat er luchtbellen binnenkomen tijdens het inbrengen.

Draai aan de klep van de kraan om de stroom van het medium uit de instroomfles te stoppen en om de stroom van de aangesloten spuit naar het oorspronkelijke apparaat mogelijk te maken. Koppel de epitheelkamer los van de pomp en druk langzaam op de spuit om de epitheelkamer te inoculeren met 1,5 milliliter celsuspensie. Sluit de klep van de uitstroomkraan en koppel de spuit los.

Sluit het open uiteinde van de kraan met de dop en houd de kamer minimaal twee uur gesloten. Inoculeer in de tussentijd de neuronale cellen. Nadat u het apparaat uit de couveuse hebt gehaald en de slangleidingen hebt verwijderd, opent u langzaam de klem en verwijdert u het deksel.

Verwijder voorzichtig het bovenste deksel van polycarbonaat. Vang het medium op in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter en plaats het op ijs. Verwijder voorzichtig de sandwichpakking en verzamel de media uit de epitheelkamer zonder de cellaag aan te raken.

Plaats de sandwichpakking in een vierkante petrischaal en voeg steriele 0,9% natriumchloride en wateroplossing toe aan de bacteriële kamer totdat de kamer volledig bedekt is. Verwijder langzaam de collageenpakking terwijl u de media uit de neuronale kamer verzamelt. Nadat u de media in een microcentrifugebuis hebt overgebracht, plaatst u de buisjes op ijs.

Plaats de collageenpakking in een vierkante schaal en voeg voorzichtig een paar milliliter PBS toe aan de Caco-2-laag totdat de cellaag volledig bedekt is. Plaats het onderste deksel van polycarbonaat in een vierkante petrischaal en voeg voorzichtig ongeveer twee milliliter PBS toe aan de neuronale cellen, zodat ze niet uitdrogen tijdens het bemonsteringsproces. Centrifugeer de mediabuis gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Nadat u de supernatanten van elke buis in een nieuwe microcentrifugebuis hebt overgebracht, plaatst u deze onmiddellijk op droogijs. Het aantal CFU's werd beoordeeld voor twee verschillende initiële apparaatconfiguraties. L.reuteri werd samen met Caco-2 en L.reuteri gekweekt in het menselijke microbiële overspraakapparaat.

In beide opstellingen verschilden de CFU-tellingen significant van het HuMix-inoculum en de geoogste cellen, wat wijst op de groei van de bacteriële cellen in het oorspronkelijke apparaat. Om te evalueren of het kweken van de enterische neuronen in het apparaat het celfenotype verandert, werd hun grove morfologie waargenomen met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop. De oprichting van een confluent neuronaal netwerk gaf aan dat de cellen goed waren gehecht aan het polycarbonaatdeksel van het gecoate apparaat.

De rand tussen het confluente neuronale netwerk en de door pakking afgebakende spiraal was duidelijk zichtbaar. Het potentieel van neurohumus ligt in het beantwoorden van vragen die voorheen moeilijk te beantwoorden waren, met betrekking tot de interacties tussen het menselijke darmmicrobioom en het enterische zenuwstelsel vanwege het ontbreken van een representatief model.