Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Het algemene doel van dit protocol is om een geoptimaliseerde methode te presenteren voor hepatocytenisolatie bij muizen na gedeeltelijke hepatectomie zonder de noodzaak van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. We zien meestal een groot percentage lipide-beladen hepatocyten tijdens vroege regeneratie. Die steatotische hepatocyten die meestal verloren gaan bij dichtheidsgradiëntcentrifugatie vanwege de lage dichtheid, worden met dit protocol behouden.

Om de perfusieapparatuur voor te bereiden, sluit u een 26 gauge IUI-canule aan op het uitlaatuiteinde van de slang met behulp van een Luer-vergrendelingsconnector. Spoel vervolgens de slang door en steek het inlaatuiteinde van de buis in de voorverwarmde perfusiebufferbuis in het waterbad. Primeer het met warme perfusiebuffer bij een pompsnelheid van drie milliliter per minuut.

Voordat u doorgaat met de operatie, moet u ervoor zorgen dat de muis voldoende wordt verdoofd. Reinig vervolgens de buik met een chirurgische scruboplossing en 70% ethanol. Snijd vervolgens de hechtingen om de middellijnincisie te heropenen die eerder is gemaakt voor de gedeeltelijke hepatectomie en trek de wondranden voorzichtig uit elkaar.

Als de hepatectomie ouder is dan 24 tot 48 uur, verwijder dan de hechting en knip de huid met een schaar of een scalpel. Gebruik een oprolmechanisme of eenvoudige clips om de buik open te houden. De buikholte moet zoveel mogelijk worden blootgesteld om de toegang en visualisatie te optimaliseren.

Bevestig een 5-0 polypropyleen hechting aan het borstbeen. Trek er craniaal aan en bevestig het in deze positie. Beweeg de darmen naar rechts met behulp van steriele wattenstaafjes om de poortader en de vena cava te onthullen.

Gebruik een natte doek om de darmen vast te houden. Plaats een zwaar voorwerp van ongeveer twee centimeter hoog, zoals een metalen gewichtsring, naast de achterpoten van de muis. Plaats vervolgens de slang met de aangesloten 26 gauge IUI-canule op het object en plaats de naald voorzichtig bovenop de vena cava.

Pas de lengte van de slang naar wens aan. Breng de collagenase-stockoplossing over in de voorverwarmde verteringsbufferbuis. Bereid 10 tot 20 milliliter verteringsbuffer per dier voor.

Zet de pomp aan nadat u de pompsnelheid hebt ingesteld op drie milliliter per minuut. Gooi de eerste twee tot drie milliliter van de voorverwarmde perfusiebuffer weg zodra de buffer de naald bereikt. Om cannulatie van de inferieure vena cava uit te voeren, gebruikt u een steriel wattenstaafje om de vena cava voorzichtig caudaal onder de punctie te trekken, zodat de geleverde spanning het inbrengen van de canule in de ader vergemakkelijkt.

Steek de 26 gauge IUI-canule onder een ondiepe hoek in de inferieure vena cava onder de nier terwijl de buffer door de naald loopt. Zorg ervoor dat de naald naar boven wijst. Zoek naar bloed in de flitskamer van de katheter wanneer de naald het lumen binnenkomt.

Verplaats de naald nog eens twee tot drie millimeter om ervoor te zorgen dat de punt van de katheter in de ader komt. Schuif de plastic katheter over de naald en nog eens vijf millimeter in de vena cava. Verwijder de naald langzaam en heel voorzichtig.

Zoek na twee tot drie seconden naar witte vlekken in de lever of zwelling van de poortader, wat aangeeft dat de perfusiebuffer door de lever stroomt en vanuit de centrale ader de leverlobben binnendringt. Wacht tot de poortader zichtbaar opzwelt binnen één tot twee seconden na de vorming van witte vlekken op het leveroppervlak. Knip de poortader met een schaar zo distaal mogelijk van de lever hilus.

Verhoog de stroomsnelheid tot vier tot zeven milliliter per minuut, afhankelijk van het gewicht van het dier, de levergrootte en de omvang van de initiële hepatectomie. Klem de poortader vast met een pincet of een vaatklem gedurende zeven tot 10 seconden. Zorg ervoor dat er geen vloeistof doorheen gaat.

Voer na ongeveer 30 seconden een tweede klem uit en zorg ervoor dat de lever opzwelt en ontspant. Blijf het dier drie tot vier minuten spoelen en observeer de heldere buffer die uit de poortader stroomt. Klem de poortader drie tot vier seconden vast voordat de spijsverteringsbuffer de lever bereikt.

Zorg ervoor dat de lever ontspant bij het loslaten van de klem en dat de perfusievloeistof helder blijft. Zodra de spijsverteringsbuffer de lever bereikt, klemt u de poortader opnieuw vast. De lever mag niet ontspannen na het loslaten van de klem.

Verwerk gedurende ongeveer vier minuten met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut. Naarmate de spijsvertering vordert, moet u letten op tekenen dat de lever begint op te zwellen en kleine transparante secties op het oppervlak van de lever. Merk op dat de lever de textuur van een nat stuk doek aanneemt en bijna drassig lijkt.

Onderzoek de consistentie door het voorzichtig aan te raken met een vochtig, steriel wattenstaafje. Ga door met de perfusie totdat een duidelijk verschil in de oppervlaktestructuur van de lever kan worden waargenomen. Merk op dat de lever een zeer lichte kleur en een bruisend uiterlijk aanneemt, wat aangeeft dat de Glisson-capsule zich scheidt van het parenchym.

Stop de spijsvertering zodra de lever deze eigenschappen heeft verworven. Verwijder de naald voordat de lucht in de lever komt. Pak het centrale bindweefsel tussen de lobben vast met een tang en til het iets omhoog met behulp van het als ankerpunt.

Knip alle verbindingen van de lever met andere organen en verwijder de galblaas. Verwijder de lever voorzichtig uit de buikholte. Wees voorzichtig, want het zal in dit stadium dun en fragiel zijn.

Plaats de lever in de ijskoude conserveringsbuffer. Breng de lever over in een petrischaaltje van 10 centimeter en voeg 10 milliliter ijskoude Williams'Medium E.Rupture de Glisson-capsule met een pincet met fijne punt toe op een paar plaatsen langs het leveroppervlak. Pak een centraal deel vast met twee pincetten.

Trek ze langzaam uit elkaar, laat de capsule scheuren zonder de hepatocyten te beschadigen en laat de cellen los door de capsule voorzichtig te schudden. Filter vijf milliliter leverpulp door een 100 micrometer celzeef in een buis van 50 milliliter. Spoel het filter af met 10 milliliter vers ijskoud medium en filter de resterende vijf milliliter pulp door de celzeef.

Draai het extract op 50 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Zuig het grootste deel van het supernatant op, waardoor er één milliliter overblijft om de cellen te resuspenderen door de buis voorzichtig rond te draaien. Voeg 40 milliliter koude Williams'E Medium toe en herhaal de stap drie keer.

Ga verder met de isolatie van hepatocyten zoals beschreven in het tekstmanuscript. Na 70% hepatectomie bij muizen was de uiteindelijke hepatocytenopbrengst ongeveer 10 tot 15 x 10 tot de 6e met 78% gemiddelde uiteindelijke levensvatbaarheid. Terwijl na verlengde 86% hepatectomie, de hepatocytenopbrengst vier tot negen x 10 tot de 6e was met 65% gemiddelde levensvatbaarheid.

Na partiële hepatectomie vertonen hepatocyten een verhoogde celgrootte in vergelijking met normale levers die overeenkomt met een verhoogd lipidegehalte. Verhoogd lipidegehalte werd waargenomen in muizenhepatocyten 24 uur na partiële hepatectomie, gezien als een toename van granulariteit of direct waargenomen door de aanwezigheid van lipideblaasjes in vergrote hepatocyten. Tijdens het gebruik van de klassieke dichtheidsgradiëntzuiveringsmethode gingen grote vette hepatocyten verloren in het supernatant en alleen kleinere magere hepatocyten werden verzameld in de celpellet.

Met het verbeterde protocol gingen de met lipiden gevulde hepatocyten niet verloren en werden alle hepatocyten gepelletiseerd. Het herhaaldelijk klemmen vergemakkelijkt het spoelproces. Daarmee wordt de lever optimaal gezuiverd van resterende bloedbestanddelen die de spijsverteringsenzymen zouden kunnen remmen.