Erytrocytenbezinkingssnelheid: een door fysica aangedreven karakterisering in een medische context

Dit protocol stemt de metingen van de bezinkingssnelheid van erytrocyten af op het nieuwste fysieke model en biedt een robuustere analyse van de test. Dit protocol maakt een nauwkeuriger en systematischer gebruik van de bezinkingssnelheid van erytrocyten mogelijk, maar biedt ook de conventionele waarden. We hebben eerder aangetoond dat deze techniek bijzonder relevant is voor aandoeningen met een lage bezinkingssnelheid van erytrocyten.

Het kan worden gebruikt voor diagnostische screenings voor neuroacanthocytose syndromen. Om te beginnen, verzamel het bloed in standaard 9-milliliter EDTA-buizen en het serum in standaard 9-milliliter serumbuizen. Voor een optimale verdichting van de verpakte erytrocyten, centrifugeer de bloedmonsters gedurende ten minste zeven minuten bij 3.000 g en zuig het supernatant op.

Bereid nu mengsels van autoloog plasma en serum met bepaalde verhoudingen. Voeg bijvoorbeeld bij het bereiden van 2,5 milliliter van het 25% tot 75% plasmaserummengsel 0,625 milliliter plasma toe aan 1,875 milliliter serum. Resuspendeer de pellet in PBS of de gewenste suspensievloeistof en meng voorzichtig na het toevoegen van het supernatant voor het wassen.

Herhaal dit driemaal en voer de laatste wasbeurt uit met de gewenste suspensievloeistof. Extraheer het vereiste volume van verpakte cellen. Verwerk de verpakte cellen als een zeer viskeuze vloeistof voor een monster van 4 milliliter bij een hematocriet van 45% Suspensie 1,8 milliliter verpakte cellen binnen 2,2 milliliter van het plasmaserummengsel of een andere gewenste vloeistof.

Om de vereiste hoeveelheid monster voor hematocrietbepaling te extraheren, bouwt u de microhematocrietcapillairen door de onderste punt in de vloeistof onder te dompelen. Wanneer de vereiste hoeveelheid monster in de buis stijgt met capillaire zuigkracht, bedek dan de opening om de stroom te stoppen. Sluit vervolgens de haarvaten af met afdichtingswas, plaats ze in de microhematocrietcentrifuge en laat ze vijf minuten op 15.000 g draaien, volgens de instructies van de fabrikant.

Lees het hematocrietniveau op het capillair en schrijf het op ter referentie. Om nu de sedimentatie van het monster vast te leggen, plaatst u een stabiele camera voor de houder waar de ESR-buizen in rust worden gelaten en gebruikt u een witte, verlichte achtergrond voor een beter contrast. Gebruik lege Westergren-buizen zonder markeringen en stel de focus en het gezichtsveld van de camera in om de hoogste resolutie te verkrijgen waar de monsters worden geplaatst.

Zorg ervoor dat de randen van de afbeeldingen in verticale en horizontale richting zijn uitgelijnd. Maak vervolgens een foto van een geschaalde buis om de pixelresolutie te extraheren. Stel de licht- en belichtingstijd van de camera in op een witte achtergrond, maar geen verzadiging.

Vul de onderste container van de Westergren-buis met het volume van de monsters dat overeenkomt met de instructies van de fabrikant en plaats ze in de onderste container, zoals aangegeven door de fabrikant. Zodra de eerste buis klaar is, plaatst u deze in de houder en start u de camera-opname. Het opnemen van één foto per minuut geeft meestal een goede resolutie van de ESR kinetische curve.

Bereid de volgende monsters voor en plaats ze. Zorg ervoor dat u niet voor een monster staat wanneer een foto wordt gemaakt. Om na het opnemen de ESR-curve te extraheren met behulp van de MATLAB-code, selecteert u een interessegebied waar slechts één buis zichtbaar is, het deel dat zich onder de laagste positie van de erytrocytencelvrije plasma-interface bevindt, maar in het monster.

Noteer de waarden van X, Y, W en H en gebruik deze waarden in het MATLAB-script. Zet het interessegebied van de RGB-afbeelding om in een grijswaardenafbeelding of -matrix. Meestal is het combineren van de drie kleurkanalen zeer efficiënt met een duidelijke achtergrond.

Binariseer vervolgens de afbeelding. Voor een gezond monster geeft het gebruik van de ARC2-drempel meestal een consistent resultaat. Voor monsters met een hoge hematocriet of met enige hemolyse is het misschien beter om het handmatig aan te passen of een andere automatische methode te gebruiken, afhankelijk van het exacte contrast dat wordt verkregen tussen de verschillende fasen in de buis.

Verkrijg het gemiddelde van de pixelwaarden van GR langs de horizontale richting. Deze stap minimaliseert de ruis en maakt efficiënt het gemiddelde van de mogelijke interface-onregelmatigheden. Voordat u de variaties berekent, moet u de curve gladstrijken met een voortschrijdend gemiddelde, vooral als de buizen enkele horizontale markeringen bevatten.

Identificeer vervolgens de interfacepositie als het punt met de hoogste intensiteitsvariatie en herhaal dit voor elke afbeelding en elk monster. Gebruik voor elk voorbeeld geschikte software om de posities van de interface in de loop van de tijd op te slaan in een geschikt formaat dat past bij het fysieke model. Met behulp van een geschikte software, die de hematocriet en de beginhoogte van de bloedkolom kent, vindt u de waarden van de vertragingstijd, de dimensieloze tijd en de uiteindelijke verpakte volumefractie van de erytrocyten, die de som van kwadratische restafwijkingen voor het fysieke model minimaliseren.

Zodra de kwantitatieve curve uit de afbeelding is geëxtraheerd, slaat u de fysieke parameters van het monster op. Traditionele ESR-waarden van 30 minuten, een uur of twee uur kunnen nog steeds uit de curve worden gehaald ter referentie. De sedimentatiesnelheid neemt af met toenemende hematocriet of initiële volumefracties.

Sedimentatie van erytrocyten wordt langzamer wanneer de concentratie van fibrinogeen afneemt. Variatie van de geëxtraheerde maximale sedimentatiesnelheid als functie van het monster hematocriet en waarden verkregen voor de dimensieloze tijd, de uiteindelijke verpakte volumefractie van de erytrocyt en de vertragingstijd, wordt weergegeven. Het kan worden gezien dat de correctie de algehele afhankelijkheid van de initiële hematocriet wegneemt, evenals het grootste deel van de gegevensdispersie.

Karakteristieke waarden van de geëxtraheerde parameters voor verschillende fibrinogeenconcentraties worden weergegeven. De initiële sedimentatiesnelheid aan het begin van het sedimentatieproces neemt toe met een toename van de fibrinogeenconcentratie. De dimensieloze karakteristieke tijd van sedimentatie neemt af met toenemende fibrinogeenconcentratie.

De uiteindelijke volumefractie van gesedimenteerde erytrocyten is bijna onafhankelijk van de fibrinogeenconcentratie. De vertragingstijd neemt af met toenemende fibrinogeenconcentratie, wat aangeeft dat sterkere aantrekkelijke interacties de herschikking van initiële erytrocytenstructuren versnellen die leiden tot de oprichting van vloeistofkanalen. Een van de kritieke punten met betrekking tot de beeldacquisitie is om een uniforme heldere achtergrond te hebben, toch?

Vermijd uitgesproken schaduwen rond de buizen. De techniek kan worden gebruikt voor de karakterisering van andere ziekten die verband houden met een lagere bezinkingssnelheid van erytrocyten, zoals sikkelcelanemie of chronische bergziekte.