Name: IDG-SW3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Leer een 3D-celkweekprotocol voor IDG-SW3-cellen in een extracellulaire matrix met collageen. Deze methode verbetert beeldvorming van dendrietvorming en genexpressie tijdens osteogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Lynda F. Bonewald voor het schenken van de IDG-SW3-cellijn. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82070902, 82100935 en 81700778) en het Shanghai "Science and Technology Innovation" Sailing Project (21YF1442000).

Dit protocol is geschikt voor het kweken van cellen in vier putjes met platen met 24 putjes. Bij de bereiding van meerdere monsters of platen moeten de hoeveelheden van de reagentia dienovereenkomstig worden verhoogd.
1. Bereiding van het collageen I-mengsel
OPMERKING: Collageen I en basaalmembraanmatrixgel snel bij kamertemperatuur. Daarom moet collageen op ijs (2 °C tot 8 °C) worden behandeld. Alle gebruikte tips en tubes moeten worden voorgekoeld, tenzij anders aangegeven. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een veiligheidskap.
<ol><li>Leg alle reagentia en centrifugebuisjes op ijs.</li>
	<li>Pipetteer langzaam 0,48 ml collageen I (5 mg/ml) en 0,1 ml 10x minimum essential medium (MEM) (met fenolrood) in een steriele centrifugebuis van 15 ml die op ijs wordt bewaard. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Gebruik volgens het kleurenpalet van de fenolroodindicator een geschikt volume van 7,5% (w/v) NaHCO3 (ongeveer 0,2 ml) om de fenolroodindicator op oranje te zetten, wat aangeeft dat de pH-waarde tussen 7,0 en 7,4 ligt. OPMERKING: Afhankelijk van de pH van het medium wordt een volume NaHCO3 gebruikt om de pH op ongeveer 7,0-7,4 te brengen. Bovendien wordt NaOH gebruikt voor pH-neutralisatie.</li>
	<li>Breng het uiteindelijke volume van het mengsel op 1 ml door een geschikt volume ddH2O toe te voegen. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren om het gebruik voor te bereiden. OPMERKING: Het uiteindelijke volume van ddH2O is afhankelijk van de hoeveelheid NaHCO 3 of NaOH die in stap1.3 wordt gebruikt.</li>
</ol>2. Bereiding van het cel-matrixmengsel
<ol><li>Pipetteer langzaam 0,9 ml basale membraanmatrix in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml op het ijs.</li>
	<li>Kweek de IDG-SW3-cellen in een T25-kolf met 4 ml compleet medium (alfa-MEM met 10% foetaal runderserum [FBS]) aangevuld met 50 E/ml INF-γ bij 33 °C.</li>
	<li>Zodra de IDG-SW3-cellen 90% confluentie hebben bereikt, verwijdert u het medium en wast u de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4 gedurende het hele protocol) met een pipet. Vergist de cellen met 0,5 ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bij 37 °C gedurende 30 s.</li>
	<li>Inactiveer de trypsine door 3,5 ml compleet medium toe te voegen (alfa-MEM met 10% foetaal runderserum [FBS]). Breng de celsuspensie van 4 ml over in een centrifugebuis van 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 1 ml van het volledige medium op ijs.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en pas de uiteindelijke celdichtheid met het volledige medium aan tot 4 × 105 cellen/ml. Voeg 0,1 ml van de bereide celsuspensie toe aan 0,9 ml van de extracellulaire matrix uit stap 2.1. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren. OPMERKING: Als een celvrije controle nodig is, voeg dan 0,1 ml van het volledige medium toe aan 0,9 ml extracellulaire matrix als negatieve controle.</li>
</ol>3. Het cel-gelmengsel plateren
<ol><li>Meng voorzichtig de twee mengsels uit stap 2.6 en stap 1.4 goed tot 2 ml door op en neer te pipetteren op het ijs. Pipetteer 0,5 ml van het uiteindelijke mengsel in elk putje (vier putjes van een bord met 24 putjes). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C om een cel-gelmengsel te vormen.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml osteogeen medium (compleet medium met 50 μg/ml ascorbinezuur en 4 mM β-glycerofosfaat, ook bekend als osteogeen inductiemedium)4 toe aan het cel-gelmengsel in elk putje om de osteogene differentiatie bij 37 °C te starten. Beschouw dit als dag 0.</li>
	<li>Vervang om de 2 dagen de helft van het medium door vers osteogeen medium dat op 37 °C wordt gehouden. Ga door met kweken gedurende 35 dagen.</li>
</ol>4. Identificatie van de levensvatbaarheid van de cellen en cellulaire dendrieten met behulp van een confocale microscoop
<ol><li>Cel kleuring OPMERKING: Calceïne-acetoxymethylester (calceïne AM) is een celpermeente kleurstof die kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te bepalen. Ethidium homodimeer-I (EthD-1) passeert het membraan van intacte/levensvatbare cellen niet9. Calceïne AM/EthD-1 kan dus worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen en cellulaire dendrieten te identificeren.<ol><li>Haal op dag 1 en dag 7 van de kweek de calceïne AM-voorraadoplossing (4 mM in DMSO) en EthD-1 voorraadoplossing (2 mM in DMSO/H2O 1:4 [v/v]) uit de vriezer en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur. OPMERKING: De gemineraliseerde matrix heeft een sterk autofluorescentiesignaal, dus het pre-osteocytstadium zonder Dmp1-expressie binnen 7 dagen na kweek4 is geschikter voor de observatie van celkleuring.</li>
		<li>Voeg 4 μL van de 2 mM EthD-1 stockoplossing en 5 μL van de 4 mM calceïne AM-stockoplossing toe aan 2 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) en meng goed. Dit geeft ongeveer 2 μM calceïne AM en 4 μM EthD-1 als werkende oplossingen.</li>
		<li>Pipetteer 0,5 ml van de werkoplossing in de putjes in de plaat met 24 putjes. Incubeer gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur om de cel-gelmatrix te kleuren.</li>
		<li>Voeg na incubatie ongeveer 0,5 ml verse D-PBS toe aan een nieuw kweekschaaltje met glazen bodem van 35 mm. Dek de schaal af om besmetting of uitdroging van de monsters te voorkomen.</li>
		<li>Breng met een pincet met elleboogpunt de gekleurde celgelmatrix van stap 4.1.3 voorzichtig over in het kweekschaaltje van 35 mm uit stap 4.1.4. Voorkom beschadiging of afschuiving van de cel-gelmatrix.</li>
		<li>Bekijk de gelabelde cellen onder een laser confocale fluorescentiemicroscoop.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscoop aftasten set<ol><li>Plaats de 35 mm schotel op de tafel. Selecteer de gebieden van de cel-gelmatrix die door het oculair moeten worden gescand met behulp van een 10x objectief. Objectieven met een hogere vergroting worden niet aanbevolen vanwege de grootte van de verlengde dendrieten.</li>
		<li>Selecteer de optische filters. Calceïne kan als groen worden bekeken met een standaard fluoresceïnebanddoorlaatfilter en EthD-1 kan als rood worden bekeken met filters voor propidiumjodide of Texas Red-kleurstof. Selecteer de "lijnmodus" voor scannen en stel het "gaatje" in op 2 μm.</li>
		<li>Selecteer een gegevensdiepte van 8 bits gegevensdiepte en een afbeeldingsresolutie van 1.024 pixels x 1.024 pixels.</li>
		<li>Beeld met behulp van sequentiële lijnscanning met de optimale laser- en detectorinstellingen (houd een minimale laserenergie aan om mogelijke fotobleken te voorkomen). OPMERKING: De optimale instelling van de detector hangt af van de uiteindelijke fluorescentiesignalen.</li>
	</ol></li>
	<li>Het verzamelen van een "z-stack" van afbeeldingen<ol><li>Definieer volgens het groene kanaalsignaal de boven- en onderposities van de cel-gelmatrix die moet worden gescand door scherp te stellen door het monster terwijl u continu scant, .</li>
		<li>Zodra de boven- en onderkant van het monster zijn opgegeven, selecteert u het gewenste scanframe. Begin met scannen. Het voorbeeld wordt van boven naar beneden gescand met de geselecteerde instellingen uit stap 4.2, waardoor een galerij met afbeeldingen wordt gegenereerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificatie van de levensvatbaarheid van de cel.<ol><li>Selecteer een segment uit stap 4.3. De groene en rode kanalen geven respectievelijk levende en dode cellen aan.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificatie van celdendrieten.<ol><li>Selecteer het enkele groene kanaal om 3D-reconstructies te genereren met de beeldacquisitiesoftware. De diepte-informatie wordt weergegeven als een reeks regenboog pseudokleurenbeelden. De dendrieten aan de onderkant van de gel worden in rood weergegeven, terwijl die aan de bovenkant in blauw worden weergegeven.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Uiterlijk identificeren met behulp van een stereomicroscoop
<ol><li>Verwijder op dag 1, dag 7, dag 21 en dag 35 van de kweek het kweekmedium en was de gels in de plaat twee keer met D-PBS. Voeg 0,5 ml 4% (v/v) paraformaldehyde in D-PBS toe aan het putje om de cel-gelmatrix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de plaat te fixeren.</li>
	<li>Verwijder het paraformaldehyde in het putje en was de cel-gelmatrix nog twee keer met D-PBS in de plaat. Laat 0,5 ml D-PBS in elk putje achter voor beeldvorming.</li>
	<li>Plaats de plaat op de tafel en selecteer de optimale positie door het oculair met behulp van een 0.5x objectief. Beeld het volledige veldbeeld van de cel-gelmatrix in de plaat afzonderlijk met behulp van "automatische belichting" onder het heldere veld.</li>
</ol>6. Identificatie van minerale afzetting met een XRF-test
<ol><li>Controleer op dag 35 van de kweek of de vloeibare stikstof voldoende is. Start het XRF-systeem. Open de monsterkamer en breng de gels met een pincet met elleboogpunt over van de plaat naar het midden van de monstertrap van het instrument. Sluit de monsterkamer en wacht 30 minuten om het instrument te laten afkoelen voor gebruik.</li>
	<li>Stel de "Belichtingstijd" in op 35 ms, het "Spectrumbereik" op 0-40 keV en de "Elektrische stroom" op 770 μA voor acquisitie-instellingen.</li>
	<li>Kies drie tot vijf scanlocaties voor analyse door de monsterfase te verplaatsen.</li>
	<li>Selecteer de elementen (Ca en P) voor detectie. Start de detectie en exporteer de resultaten. OPMERKING: Ca en P zijn de meest voorkomende elementen in hydroxyapatiet.</li>
</ol>7. Identificatie van functionele genexpressie
<ol><li>Verwijder op dag 1, dag 7, dag 21, dag 28 en dag 35 van de kweek het kweekmedium en was de celgelmatrix twee keer met ijskoude D-PBS in de plaat.</li>
	<li>Breng de gels met een pincet met elleboogpunt over van de plaat naar een buis van 2,0 ml (afhankelijk van de kweektijd zal de cel-gelmatrix geleidelijk krimpen tot ongeveer 0,1 ml op dag 35). Zorg ervoor dat er één gel in één tube wordt gedaan. Voeg 1 ml fenolchloroform en twee steriele roestvrijstalen klopparels (4 mm, als lyseermatrix) toe aan elk buisje. Plaats de buisjes symmetrisch in de voorgekoelde monstergleuf van de mechanische klophomogenisator.</li>
	<li>Stel het kloppen in op een frequentie van 55 Hz en een amplitude van 1 cm in elke 1 minuut mechanisch kloppen met een pauze van 10 s, met in totaal zes cycli. Begin met het kloppen van de kralen.</li>
	<li>Haal het totale RNA uit de cel-gelmatrix met behulp van de fenol-chloroform-isoamylachohol-methode. Omgekeerd transcriberen van 2 μg totaal RNA naar cDNA met willekeurige hexameerprimers.</li>
	<li>Ontwerp primers gericht op β-actine, Pdpn, Dmp1, Sost en Fgf23 voor real-time PCR (tabel 2). β-Actine is het huishoudgen dat wordt gebruikt voor normalisatie. De genen Pdpn10 en Dmp1 11 komen voornamelijk tot expressie in pre-osteocyten en gemineraliseerde osteocyten, terwijl Sost12 en Fgf23 13 voornamelijk tot expressie komen in volwassen osteocyten.</li>
	<li>Plaats de buis op een thermocycler met het verwarmde deksel ingesteld op 105 °C en voer PCR-amplificatie uit met behulp van de volgende PCR-cyclusinstellingen: 95 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 30 s gedurende 35 cycli met een eerste denaturatiestap bij 95 °C gedurende 5 minuten en een laatste uitbreidingsstap bij 60 °C gedurende 30 s. Analyseer de vouwveranderingen met de ΔΔCt-methode.</li>
</ol>

<ol><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte%3A+An+endocrine+cell+...+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271(2021).</li>
<li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoid-mimicking+dense+collagen%2Fchitosan+hybrid+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li>
<li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11%2FPodoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin%2C+a+novel+BMP+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li>
<li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een kritiek punt in dit protocol is dat stap 1 en stap 2 op ijs moeten worden uitgevoerd om spontane stolling te voorkomen. Bij deze methode was de uiteindelijke concentratie collageen I 1,2 mg/ml. Er moet dus een optimaal ddH2O-volume worden berekend om overeen te komen met de verschillende collagenen van verschillende fabrikanten.
In vivo omvat osteocytogenese een polaire beweging van osteoblasten van het oppervlak naar het binnenste van trabeculair bot1...

Osteocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen die zijn afgeleid van osteoblasten 1,2. Zodra de osteoblast door de osteoïde is begraven, ondergaat deze osteocytogenese en brengt het Pdpn-gen tot expressie om preosteocyten te vormen, het Dmp1-gen om de osteoïde te mineraliseren en de Sost- en Fgf23-genen om te functioneren als een volwassen osteocyt in botweefsel3. Hier wordt een 3D-kweeksysteem geïntroduceerd om dendrietextensie en markergenexpressie in het osteocytogeneseproces te identificeren.
IDG-SW3-cellen zijn een onsterfelijke primaire cellijn afgeleid van transgene muizen en kunnen osteoblasten uitbreiden of repliceren tot late osteocytendifferentiatie wanneer ze in verschillende media worden gekweekt4. Vergeleken met MLO-A5, MLO-Y4 en andere cellijnen is het waarschijnlijker dat het expressieprofiel van functionele eiwitten, het vermogen om calciumzoutafzetting uit te voeren en de reacties op verschillende hormonen in IDG-SW3-cellen hetzelfde zijn als die van primaire osteocyten in het botweefsel4.
In vergelijking met 2D-systemen zijn 3D-kweeksystemen beter in staat om de in vivo cellulaire groeiomgeving na te bootsen, inclusief de nutriëntengradiënt, de lage mechanische stijfheid en het omringende mechanische bereik (tabel 1). De meeste van de voorgaande methoden voor het kweken van osteoblastische cellen in een 3D-systeem gebruikten collageen I als de unieke component in formuleringen 4,5,6, omdat collageen I-vezels dienen als de plaats van calcium- en fosforafzetting. Een onmisbaar bestanddeel in de osteoïde, de extracellulaire matrix, bevat echter een grote groep cellulaire factoren die cellulaire groei, adhesie en migratie bevorderen 7,8 en is transparant en handig voor beeldvormingsobservatie. Dit protocol gebruikt dus Matrigel (hierna te noemen basale membraanmatrix) als secundaire component voor de osteocytogenesestudie.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>Corning, NY, USA</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>7,5% (w/v) Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>homogenizer</td><td>BiHeng&nbsp; Biotechnology, Shanghai, China</td><td>SKSI</td><td></td></tr><tr><td>laser confocal fluorescence microscopy</td><td>Carl&nbsp;Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Cell Imaging kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>Corning, NY, USA</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10X), no glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21430079</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.FS</td><td></td></tr><tr><td>stereo microscope</td><td>Carl&nbsp;Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Zeiss Axio ZOOM.V16</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>X-ray fluorescence</td><td>EDAX, USA</td><td>EAGLE III</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

idg-sw3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Osteocyten worden beschouwd als niet-proliferatieve cellen die terminaal gedifferentieerd zijn van osteoblasten. Osteoblasten ingebed in de extracellulaire matrix van het bot (osteoïde) brengen het Pdpn-gen tot expressie om cellulaire dendrieten te vormen en te transformeren in pre-osteocyten. Later brengen preosteocyten het Dmp1-gen tot expressie om matrixmineralisatie te bevorderen en daardoor te transformeren in volwassen osteocyten. Dit proces wordt osteocytogenese genoemd. IDG-SW3 is een bekende cellijn voor in vitro studies van osteocytogenese. Veel eerdere methoden hebben collageen I gebruikt als het belangrijkste of het enige onderdeel van de kweekmatrix. Naast collageen I bevat de osteoïde echter ook een grondsubstantie, die een belangrijk onderdeel is bij het bevorderen van celgroei, hechting en migratie. Bovendien is de matrixstof transparant, wat de transparantie van de collageen I-gevormde gel verhoogt en zo helpt bij het verkennen van dendrietvorming door middel van beeldvormingstechnieken. Dit artikel beschrijft dus een protocol om een 3D-gel tot stand te brengen met behulp van een extracellulaire matrix samen met collageen I voor IDG-SW3-overleving. In dit werk werden dendrietvorming en genexpressie geanalyseerd tijdens osteocytogenese. Na 7 dagen osteogene kweek werd een uitgebreid dendrietennetwerk duidelijk waargenomen onder een fluorescentie confocale microscoop. Real-time PCR toonde aan dat de mRNA-niveaus van Pdpn en Dmp1 gedurende 3 weken voortdurend toenamen. In week 4 onthulde de stereomicroscoop een ondoorzichtige gel gevuld met minerale deeltjes, in overeenstemming met de röntgenfluorescentie (XRF)-test. Deze resultaten geven aan dat deze kweekmatrix met succes de overgang van osteoblasten naar volwassen osteocyten vergemakkelijkt.

Na het kleuren van levende/dode cellen werden de cellen gevisualiseerd met behulp van een confocale lasermicroscoop. Alle cellen waren calceïne AM-positief (groene kleur) en er waren bijna geen EthD-1-positieve cellen (rode kleur) in het veld, wat aangeeft dat het gelsysteem dat met deze methode wordt gemaakt zeer geschikt is voor osteocytogenese (Figuur 1A, links). Om de ruimtelijke verdeling van de cellen beter te kunnen bepalen, werd gekozen voor een pseudokleurenafbeelding om de celdendr...

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van IDG-SW3-cellen in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix.

IDG-SW3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

We hebben een protocol uitgewerkt om een 3D-systeem op te zetten met behulp van extracellulaire metriek samen met collageen voor het analyseren van vorming en genexpressie door middel van osteogenese. Extracellulaire metriek kan de transparantie van de collageen-éénvormgel vergroten en het is geschikt voor het onderzoeken van de dendrietvorming voor beeldvormingstechnieken. Om te beginnen pipetteer je langzaam 0,9 milliliter basaalmembraanmatrix in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter op ijs en houd je deze opzij.Verwijder vervolgens een T25-flosdraad van IDG SW3-gekweekte cellen in vier mililiter compleet medium aangevuld met interferon-gamma uit de incubator. Was na het verwijderen van het kweekmedium de cellen met PBS pH 7.4 met een pipet. Probeer vervolgens de cellen met 0,5 milliliter 0,25% trypsine EDTA bij 37 graden Celsius gedurende 30 seconden.Inactiveer trypsine door 3,5 milliliter compleet medium toe te voegen. Breng vier milliliter van het Celsius-pensioen over in een centrifugebuis van 15 milliliter. Draai de celsuspensie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius bij 300 G af.Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u het celpalet in één milliliter van het volledige medium op ijs. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en pas de uiteindelijke celdichtheid met het volledige medium aan tot vier keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Voeg 0,1 milliliter van de bereide celsuspensie toe aan de 0,9 milliliter van de extracellulaire matrix die op ijs wordt bewaard.Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren. Meng voorzichtig een milliliter van het celmatrixmengsel en een milliliter van het eerder bereide collageen door op en neer te pipetteren op het ijs. Pipetteer 0,5 milliliter van het uiteindelijke mengsel in elk putje van een plaat met 24 putjes en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius om een celgelmengsel te vormen.Voeg na incubatie 0,5 milliliter osteogeen medium toe aan het celgelmengsel in elk putje. Om de osteogene differentiatie te starten bij 37 graden Celsius, beschouw dit als dag nul. Vervang om de twee dagen de helft van het medium door vers osteogeen medium en ga door met kweken gedurende 35 dagen.Haal de calciumoplossingen AM en ethidium one uit de vriezer en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur. Voeg vier microliter van de twee millimolaire ethidium één stockoplossing en vijf microliter van de vier millimolaire calcium AM-voorraadoplossing toe aan twee milliliter DPBS en meng goed om twee micromolair calcium AM en vier micromolair ethidium één als werkoplossing te krijgen. Om celkleuring uit te voeren op dag één en dag zeven van de kweek, pipetteer je 0,5 milliliter van de werkoplossing in de putjes van de plaat met 24 putjes en incubeer je gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur om de celgelmatrix te kleuren.Voeg ongeveer 0,5 milliliter verse DPBS toe aan een nieuwe 35 millimeter glazen bodemkweekschaal en dek de schaal af om besmetting of uitdroging van de monsters te voorkomen. Breng met behulp van een pincet met elleboogpunt de gekleurde celgelmatrix voorzichtig over in de DPBS-bevattende kweekschaal zonder de celgelmatrix te beschadigen of te verschuiven. Bekijk de gelabelde cellen onder een laser confocale fluorescentiemicroscoop.Plaats het kweekschaaltje met de gelmatrix met gekleurde cellen op de microscooptafel. Selecteer de gebieden van de celgelmatrix die door het oculair moeten worden gescand met behulp van een 10x-objectief. Om de microscoop in te stellen, selecteert u de optische filters.Bekijk calcium als groen met een standaard fluorescerend banddoorlaatfilter en ethidium als rood met filters voor propidiumjodide of Texaanse rode kleurstof. Selecteer de lijnmodus om te scannen en klik vervolgens op de acquisitiemodus om de luchtige eenheden in te stellen op één au. Selecteer 8-bits gegevensdiepte en een afbeeldingsresolutie van 1024 bij 1024 pixels.Selecteer vervolgens de regelstap en stel de scansnelheid in op vijf. Om de Z-stapel afbeeldingen te verzamelen, definieert u de boven- en onderposities van de celgelmatrix die moet worden gescand door scherp te stellen door het monster terwijl u continu scant volgens het groene kanaalsignaal. Zodra de boven- en onderkant van het monster zijn opgegeven, selecteert u het gewenste scanframe en begint u met scannen.Het voorbeeld wordt van boven naar beneden gescand en de geselecteerde instellingen genereren een galerij met afbeeldingen. Als u de levensvatbare cellen wilt identificeren, selecteert u één afbeeldingssegment. De groene en rode kanalen duiden respectievelijk op levende en dode cellen.Om de celdendriet te identificeren, selecteert u het enkele groene kanaal om 3D-reconstructies te genereren met de beeldacquisitiesoftware, een reeks regenboog pseudo-kleurenafbeeldingen geeft de diepte-informatie aan. De dendrieten aan de onderkant worden in het rood weergegeven, terwijl die aan de bovenkant in blauw worden weergegeven. Verwijder op verschillende kweekdagen het kweekmedium en was de gels in de plaat twee keer met DPBS.Voeg 0,5 milliliter of 4% paraformaldehyde in DPBS toe aan het putje om de celgelmatrix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de plaat te fixeren. Verwijder het paraformaldehyde in het putje en was de celgelmatrix nog twee keer met DPBS in de plaat, zoals eerder gedemonstreerd, en laat 0,5 milliliter DPBS in elk putje achter voor beeldvorming. Plaats de plaat op de stereomicroscooptafel en selecteer de optimale positie door het oculair met behulp van een 0.5x objectief.Afbeelding, het volledige veldbeeld van de celgelmatrix in de plaat afzonderlijk met behulp van automatische belichting onder het heldere veld. Controleer op dag 35 van de teelt het gehalte aan vloeibare stikstof en start het XRF-systeem. Open de monsterkamer en breng de gels met een pincet met elleboogpunt over van de plaat naar het midden van de monstertrap van het instrument.Sluit de monsterkamer en wacht 30 minuten om het instrument te laten afkoelen voor gebruik. Stel de belichtingstijd in op 35 milliseconden. Het spectrum reikt tot nul tot 40 kilo elektronvolt en de elektrische stroom tot 770 microampère voor acquisitie ingesteld.Verplaats de monsterfase en kies drie tot vijf scanlocaties voor analyse. Selecteer de elementen calcium en fosfor. Start de detectie en exporteer de resultaten.Op verschillende teeltdagen. Was de verwijderde celgelmatrix van het kweekmedium twee keer met ijskoude DPBS, zoals eerder is aangetoond. Haal het totale RNA uit de celgelmatrix met behulp van de fenolchloroformisoamyalcoholmethode.Transcribeer vervolgens twee microgram totaal RNA naar CDNA met willekeurige hexameerprimers. Plaats de buis op een thermocycler en voer PCR-amplificatie uit. Analyseer na PCR de vouwveranderingen met de twee delta CT-methode.De kleuring van levende dode cellen, gevisualiseerd onder een confocale lasermicroscoop, toonde aan dat alle cellen calcium AM-positief waren en bijna geen ethidium één-positieve cellen, wat aangeeft dat het gelsysteem zeer geschikt is voor osteocytogenese. De cellulaire dendrieten breidden zich geleidelijk uit tot een netwerk in het osteogene medium op dag zeven. Een pseudo-kleurenafbeelding van de dag zeven-cultuur toont de celandroïden op verschillende diepten aan de onderkant en aan de bovenkant van de gel.Volledige veldbeelden van de gel met cellen en gel zonder cellen in een plaat met 24 putjes op de aangegeven tijdstippen worden afgebeeld. De transparantie van de gelmatrix bleef afnemen totdat deze op dag 35 ondoorzichtig werd, in tegenstelling tot de celvrije gelmatrix. Het XRF-spectrum van de ondoorzichtige gel op dag 35 gaf aan dat de gel volledig gevuld was met calcium- en fosforafzettingen.De expressie van verschillende markergenen geanalyseerd door real-time PCR toonde aan dat de mRNA-niveaus van podoplanine en dentine matrix-eiwit één voortdurend toenamen van dag één tot dag 21 en het mRNA-niveau daalde na dag 21. De mRNA-niveaus van fibroblastgroeifactor 23 en sclerostine namen voortdurend toe tijdens alle stadia. Collageen één en de basale membraan metriek gel snel en kamertemperatuur.Daarom moeten alle gebruikte tips en tubes voorgekoeld zijn, tenzij anders aangegeven. Men kan alle interessante gebeurtenissen tijdens osteogenese waarnemen door middel van beeldvormingstechnieken. Het is gemakkelijker om de werking van het molecuul te lokaliseren tijdens de vorming en verlenging van dendrieten.

idg-sw3-cell-culture-in-a-three-dimensional-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Het weefsel-specifieke extracellulaire matrix (ECM) is een sleutelmediator van celfunctie. Dit artikel beschrijft werkwijzen voor het synthetiseren van zuiver ECM afgeleide schuimen en microdragers die stabiel in cultuur zonder de noodzaak voor chemische verknoping voor toepassingen in geavanceerde 3D in vitro celkweekmodellen of pro-regeneratieve bioscaffolds.

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van de factoren van de pro - en anti - migratory op cel migratie binnen een driedimensionale fibrine-matrix.

Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Hier laten we zien hoe epitheelcellen gekweekt met fibroblasten in het nanovezelige membraangebaseerde tweelaagse systeem stabiel kunnen hechten aan en groeien op het membraan.

Het opzetten van een driedimensionale cocultuurmodule van epitheelcellen met behulp van nanovezelmembranen

Leer een 3D-celkweekprotocol voor IDG-SW3-cellen in een extracellulaire matrix met collageen. Deze methode verbetert beeldvorming van dendrietvorming en genexpressie tijdens osteogenese.

IDG-SW3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix

Meer video's verkennen