Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

Dit protocol biedt een methode om de functie van darmstamcellen te bestuderen in een manipuleerbare omgeving met lagere kosten in de tijd dan diermodellen. Organoïde cultuur maakt de studie van stamcelfunctie in een immuunvrije omgeving mogelijk. Dit maakt het mogelijk om de effecten van een specifieke oorzaak te lokaliseren, zoals de knock-out van claudin-7.

Het begrijpen van de mechanismen van stamcelfunctie kan licht werpen op nieuwe therapeutische doelen voor slopende ziekten zoals inflammatoire darmaandoeningen en colorectale kanker. Om de isolatie van coloncrypten van de geëuthanaseerde muis te beginnen, maakt u een incisie van ongeveer twee centimeter langs de middellijn van de muis. Speld vervolgens de huid terug om de buik bloot te leggen.

Snijd de dikke darm net onder het coecum van de proximale kant en boven het rectum van de distale kant om de dikke darm te isoleren. Verwijder vervolgens het vetweefsel dat aan de dikke darm is bevestigd met behulp van een tang. Nadat u uitwerpselen uit de geïsoleerde dikke darm hebt geduwd met het platte uiteinde van de tang, snijdt u het weefsel in de lengterichting open.

Was het weefsel 10 tot 15 keer met koude PBS door het weefsel in PBS rond te draaien tussen wasbeurten door met een tang. Snijd vervolgens met een schone, scherpe schaar het weefsel in kleine stukjes van ongeveer drie tot vijf millimeter. Nadat u de dikke darm van een andere geëuthanaseerde muis hebt geïsoleerd, combineert u alle weefselstukken in een centrifugebuis van 50 milliliter met koude epitheliale dissociatiemedia en incubeert u de darmweefselstukken in epitheliale dissociatiemedia gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius met zacht schommelen.

Laat na incubatie de weefselfragmenten naar de bodem van de buis zakken. Eenmaal gevestigd, gooit u de epitheliale dissociatiemedia weg zonder de weefselfragmenten te verstoren. Herhaal het proces bij het wassen van het weefsel 10 tot 15 keer met koude PBS.

Gooi zoveel mogelijk PBS weg tijdens de laatste wasbeurt. Voeg vervolgens koude crypte dissociatiemedia toe aan de gewassen darmweefselstukken in een buis van 50 milliliter en schud gedurende vijf tot 10 minuten met de hand. Filter onder de celkweekkap de media die het weefsel bevatten met een 70-micron nylon celzeef in een verse centrifugebuis van 50 milliliter.

Na filtratie centrifugeert u de buis gedurende 10 minuten op 200 G bij kamertemperatuur, gevolgd door het weggooien van het supernatant zonder de gepelletiseerde crypten te verstoren. Resuspendeer de pellet in drie tot vier milliliter koude PBS. Pipetteer 10 microliter van de crypte suspensie in een lijn op een microscoopglaasje.

Tel met behulp van de microscoop het aantal volle, lange crypten om de crypteconcentratie te schatten en bereken het juiste volume crypten dat nodig is om 10 crypten per microliter in een 96-well plaat te plaatsen. Centrifugeer een geschikt volume geïsoleerde crypten in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter bij 200 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het supernatant met een pipet van 1.000 microliter zonder de gepelletiseerde crypten te verstoren.

Voeg vervolgens 100 microliter gelmatrix toe aan de gepelletiseerde crypten zonder luchtbellen te introduceren. Wacht één tot twee minuten totdat de gelmatrix gedeeltelijk is gestold. Vervolgens werd plaat 10 microliter van de gelmatrix gemengd met de crypten in elke put van een voorverwarmde 96-well kweekplaat om een koepelvorm te vormen.

Wacht 10 tot 20 minuten voordat de gelmatrix volledig is ingesteld door de plaat in een incubator te plaatsen op 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. Voeg ten slotte 100 microliter van de vers bereide werkoplossing van L-WRN-media aangevuld met antibiotica toe aan elke put en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Om de organoïden te oogsten, verwijdert u oude media uit de putten door vacuümafzuiging toe te passen en fixeert u de organoïden gedurende een uur met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens 4% paraformaldehyde uit de putten door vacuümafzuiging en behandel de organoïden met 100 microliter van 30% sucrose per put bij vier graden Celsius. Verwijder na 24 uur 30% sucrose uit de putten door vacuümafzuiging voordat u 10 microliter PBS aan elke put toevoegt. Gebruik een pipetpunt om voorzichtig de bodem van de put te krassen om de koepelbevattende organoïden te dissociëren.

Verwijder vervolgens de PBS met de gedissocieerde organoïden uit de put met een pipet en breng deze over in een gelabelde plastic mal die voor 90% is gevuld met een optimale snijtemperatuur, of OCT, verbinding. Ga door met het proces totdat alle organoïden uit alle putten zijn verwijderd. Voeg 2-methylbutaan toe aan een roestvrijstalen Dewar-kolf met droogijskorrels, genoeg om de pellets te bedekken.

Flash-freeze het organoïde bevattende OCT-blok door het gestaag boven het 2-methylbutaan te houden. Bewaar ten slotte het organoïde-bevattende OCT-blok bij min 80 graden Celsius totdat het klaar is om te worden doorgesneden. De representatieve afbeelding benadrukt de succesvolle groei van colonoïden uit normale crypten die claudine-7 bevatten.

De crypten met claudin-7 begonnen op dag twee sferoïden te vormen, begonnen op dag vijf te ontluiken en bleven groeien en ontluiken totdat ze op dag negen werden geoogst. Daarentegen slaagden crypten zonder claudin-7 er niet in om goede colonoïden te vormen. Na behandeling met 4-hydroxytamoxifen gedurende twee tot drie dagen verschenen de claudine-7 knock-outcrypten als cirkelvormige klonten cellen.

In tegenstelling tot de controle groeiden de crypten niet uit tot gezonde sferoïden. Immunofluorescentiekleuring voor claudine-7 in de geoogste controle en de voorwaardelijke knock-out organoïden bevestigden de succesvolle knock-out van claudine-7 in cultuur. De controlekolonoïden vertoonden op dag negen zeer weinig apoptotisch signaal.

Claudin-7 knock-out colonoïden vertoonden echter tegelijkertijd een hoge apoptose. Zorg voor gedeeltelijke stolling voorafgaand aan de beplating. Plating vóór gedeeltelijke stolling zal ervoor zorgen dat de gelmatrix zich verspreidt en de koepel niet wordt gevormd, wat de overleving en groei van de crypten beïnvloedt.

Dit protocol kan worden gebruikt voor het ontdekken van geneesmiddelen, het bestuderen van cellulaire communicatie, medicijnmetabolisme, levensvatbaarheid, proliferatie en het ontwikkelen van patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandeling. De oprichting van organoïde cultuur heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van ziekten en gepersonaliseerde geneeskunde.