Name: Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Leer hoe u toxiciteiten van CD19-gerichte CAR-T-celtherapie evalueert met een patiënt-afgeleid xenograftmuismodel van acute lymfoblastische leukemie. Dit model biedt een klinisch relevant platform voor het verbeteren van behandelstrategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R-pijplijn (SSK), het Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) en de Predolin Foundation (R.L.S.). Daarnaast willen we de medewerkers van Mayo Clinic NMR Core Facility bedanken. Figuur 1 is gemaakt in BioRender.com

Dit protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board (IRB), Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) en Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) van Mayo Clinic.
OPMERKING: Alle materialen die worden gebruikt om met muizen te werken, moeten steriel zijn.
1. Injectie van busulfan op NSG-muizen
<ol><li>Verkrijg mannelijke, 8-12 weken oude, immuungecompromitteerde, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) muizen en weeg ze vóór de injectie. OPMERKING: Voor statistische significantie wordt aanbevolen om ten minste vijf muizen per groep te gebruiken en dit experiment ten minste eenmaal nogmaals te herhalen met vrouwelijke muizen.</li>
	<li>Bereid busulfan voor intraperitoneale (i.p.) injectie. Gebruik een insulinespuit van 1 ml en vul de spuit langzaam en voorzichtig met precies 30 mg / kg busulfan, gevolgd door i.p-injectie op de muizen, en plaats ze terug in de kooi.</li>
</ol>2. Injectie van ALLE patiënt-afgeleide blasten (CD19+) op de NSG-muizen
OPMERKING: Dit protocol volgt de richtlijnen van het Institutional Biosafety Committee van Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).
<ol><li>Verzamel primaire leukemische blasten uit het perifere bloed van patiënten met recidiverende en refractaire ALL.</li>
	<li>Bereid doelcellen voor op intraveneuze (i.v.) injectie.<ol><li>Tel CD19+ doelcellen met behulp van een hemocytometer en registreer het uiteindelijke volume en de uiteindelijke concentratie van cellen. OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van cellen te bepalen, wordt het sterk aanbevolen om trypan blue te gebruiken tijdens het tellen van de cellen.</li>
		<li>Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Resuspendeer de celpellet in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 50 × 106 cellen / ml in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats op ijs.</li>
		<li>Vingervortex de 1,5 ml microcentrifugebuis met de doelcellen totdat de cellen volledig gehomogeniseerd zijn.</li>
		<li>Gebruik een insulinespuit van 1 ml en vul de spuit langzaam en voorzichtig met precies 100 μL van de voorbereide doelcellen en veeg met de spuit om bubbels te verwijderen. OPMERKING: Het volume van 100 μL zal 5 × 106 cellen aan elke muis toedienen.</li>
		<li>Plaats de muizen onder warm licht gedurende 5-10 minuten. Zodra de staartader gezwollen raakt en beter zichtbaar is voor het blote oog, plaatst u de muizen in een geschikte opsluitings- / fixatiekamer.</li>
		<li>Veeg de staart van de muis af met een alcoholdoekje. Injecteer de doelcellen rechtstreeks in de staartader (i.v.) en plaats de muis terug in de kooi. Na de inenting van de doelcellen, controleer de muizen dagelijks of zoals aanbevolen door de lokale dierethische commissie.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tumor engraftment beoordeling
<ol><li>Vanaf 6 weken na de doelcelinjectie, beoordeelt u tumortransplantatie met behulp van flowcytometrie om de expressie van CD19 + -cellen in het perifere bloed te meten.</li>
	<li>Perifere bloedtest om CD19+ expansie te beoordelen<ol><li>Onttrek bloed uit de muizen 6-8 weken na CART19-celinjectie. OPMERKING: Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om bloed op te nemen. Voor dit protocol is submandibulaire bloedafname de voorkeursmethode.</li>
		<li>Verdoof de muis met isofluraan in een inductiekamer met 5% isofluraan. Zodra anesthesie is bereikt, handhaaft u 1-3% isofluraan geïnhaleerd door een neuskegel. OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om oogzalf aan te brengen om droge ogen te voorkomen.</li>
		<li>Verwijder de muis uit de kamer en houd de muis vast met de niet-dominante hand door de losse huid over de nek te grijpen. Prik de ader door met een lancet iets achter de onderkaak. OPMERKING: Alleen de punt van de naald (1-2 mm) is nodig om de ader binnen te gaan.</li>
		<li>Terwijl het bloed druipt, verzamelt u ten minste 50 μL in een met heparine gecoate buis en mengt u goed door de buis meerdere keren op en neer te keren. Breng 30 μL bloed over in een polystyreenbuis met ronde bodem van 5 ml. OPMERKING: Draai voor het resterende bloed de buis gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 17.000 × g naar beneden. Breng het serum (bovennatuurlijke laag) over in een schone en gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar deze bij −80 °C (voor gebruik in de cytokinetest).</li>
		<li>Voeg 2 ml lysisbuffer (10x op ammoniumchloride gebaseerde lyseerbuffer verdund tot 1x met nucleasevrij water) toe aan de 5 ml ronde bodembuis met het bloed. Meng heel goed door de buis te vortexen. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om een goede lysis van de rode bloedcellen te garanderen.</li>
		<li>Voeg 2 ml stroombuffer toe (PBS, 0,2 g/l kaliumchloride, 0,2 g/l kaliumfosfaatmonobasisch, 8 g/l natriumchloride en 1,15 g/l natriumfosfaatdibasisch met 2% foetaal runderserum en 1% natriumazide).</li>
		<li>Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 300 × g bij 4 °C. Decanteer het supernatant en voeg 2 ml stroombuffer toe. Herhaal deze wasstap 2x.</li>
		<li>Decanteer voorzichtig de inhoud van de buis. Observeer de kleine hoeveelheid vloeistof met een pellet die in de buis achterblijft. Voeg 100 μL debietbuffer toe en resuspensie zeer goed.</li>
		<li>Breng alle resterende vloeistof in de 5 ml stroombuis over in een plaat met 96 putten. Zorg ervoor dat elk monster correct is geëtiketteerd. Voeg 100 μL debietbuffer toe aan de overeenkomstige putten en centrifugeer de 96-putplaat bij 650 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Beoordeel de uitbreiding van de CD19+ doelcellen door middel van flowcytometrie (figuur 2).<ol><li>Bereid een hoofdmengsel met 0,3 μl levend/dode vlek, 0,13 μg (2,5 μl) antimenselijk CD19-antilichaam, 0,06 μg (2,5 μl) antimenselijk CD45-antilichaam, 5 μg (2,5 μl) antimuis-CD45 en 42,2 μl stroombuffer voor een totaal van 50 μl per monster. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 min.</li>
		<li>Wassen met 150 μL stroombuffer gevolgd door centrifugeren bij 650 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Decanteer het supernatant en resuspensie van de pellet in 195 μL stroombuffer en 5 μL telparels.</li>
		<li>Verkrijg op een flowcytometer om het niveau van CD19+ celexpressie te bepalen. Voor gating- en analysedoeleinden moet eerst de populatie van belang (CD19+) worden gegate op basis van de voorwaartse versus zijwaartse spreidingskenmerken, gevolgd door een enkele gatingpopulatie en vervolgens levende cellen. Zodra de levende cellen zijn omheind, beoordeelt u de menselijke CD45 versus muis CD45-populatie en van de menselijke populatie, gaten de CD19 + -doelpopulatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificeren om de hoeveelheid aanwezig in 70 μL te bepalen en vervolgens uit te drukken in cellen / μL met behulp van vergelijking (1): Absoluut CD19+ celgetal = ([CD19+ cellen/telkralen] × aantal telparels binnen 5 μL)/70 OPMERKING: Herhaal de perifere bloedtest om de 5 dagen om de CD19+ celexpansie te beoordelen. Verzamel niet meer dan 200 μL bloed cumulatief om de 2 weken in overeenstemming met de richtlijnen van de lokale ethische commissie voor dieren. Zodra de muizen een ziektelast van ≥10 cellen / μL hebben bereikt, randomiseert u naar CART19-cellen of controlegroepen (sectie 4).</li>
</ol>4. Toediening van CART19-cellen in vivo
<ol><li>Bereiding van CART19-cellen (~Dag 80): OPMERKING: De generatie van CART19-cellen is eerder gepubliceerd 27,30,31. Deze procedure moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast niveau 2+ met behulp van aseptische techniek en persoonlijke beschermingsmiddelen.<ol><li>Ontdooi de CART19-cellen in een waterbadcontainer (37 °C). Was vervolgens de cellen in warm T-celmedium (TCM) om het dimethylsulfoxide te verwijderen. OPMERKING: TCM is gemaakt van 10% humaan AB-serum (v / v), 1% penicilline-streptomycine-glutamine (v / v) en serumvrij hematopoietisch celmedium27,30.</li>
		<li>Centrifugeer de CART19-cellen gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 300 × g en resuspensie in warme TCM tot een eindconcentratie van 2 × 106 cellen/ml. Laat de CART-cellen 's nachts rusten in een incubator (37 °C, 5% CO2) maar niet langer dan 16 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Toediening van CART19-cellen via i.v.-injectie (dag ~80)<ol><li>Tel de CART19-cellen en draai gedurende 8 minuten bij 4 °C terug bij 300 × g .</li>
		<li>Resuspendeer de CART19-cellen met 10 ml PBS en draai gedurende 8 minuten bij 4 °C terug bij 300 × g .</li>
		<li>Resuspendeer de CART19-cellen tot een eindconcentratie van 40 × 106 cellen / ml met PBS, breng de cellen over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats ze op ijs.</li>
		<li>Voer CART19-celstaartaderinjecties uit (zoals hierboven beschreven) door 100 μL geresuspendeerde cellen i.v. te injecteren. OPMERKING: Een volume van 100 μL zal 4 × 106 cellen aan elke muis toedienen. Neem een groep onbehandelde muizen op als negatieve controle.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Beoordeling van CART19 celgeassocieerde toxiciteiten
<ol><li>Na toediening van CART19-cellen, controleer de muizen 2x per dag om eventuele veranderingen in hun welzijn te beoordelen, zoals motorische zwakte, gebogen lichaam en verlies van lichaamsgewicht. OPMERKING: Al deze fysieke veranderingen correleren met CRS-symptomen in dit model28.</li>
	<li>Zodra de muizen motorische zwakte en gewichtsvermindering beginnen te ontwikkelen (10-20% reductie ten opzichte van de uitgangswaarde), verzamelt u perifeer bloed om de tumorlast te analyseren en serumisolatie voor cytokines uit te voeren volgens de methodologie beschreven in sectie 3 (figuur 3).</li>
	<li>Bewaar de serummicrocentrifugebuizen bij −80 °C en gebruik de sera om de chemokines en cytokines te analyseren met behulp van een multiplextest (figuur 4). OPMERKING: Als de muizen tekenen van verlamming van de achterpoten vertonen, stervende of lusteloos lijken en het gewichtsverlies > 20% van hun lichaamsgewicht is tot het punt dat hun vermogen om voedsel en / of water te bereiken beperkt, dan zullen ze worden onderworpen aan euthanasie.</li>
</ol>6. MRI-beeldvorming
OPMERKING: Een preklinische (voor kleine dieren) MRI-scanner met een verticale boringsmagneet werd gebruikt voor in vivo magnetische resonantie en beeldacquisitie32,33.
<ol><li>Meng 120 μL Gadolinium + 880 μL zoutoplossing en laad in een insulinespuit van 1 ml. Injecteer 100 μL in elke muis (i.p.). OPMERKING: Gadolinium moet 15-20 minuten voor aanvang van het experiment worden geïnjecteerd.</li>
	<li>Verdoof de muis met isofluraan (2-3%) in een inductiekamer gedurende 10-15 minuten. OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om oogheelkundige zalf aan te brengen om droge ogen te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de ruggengraat van de muis op de met knaagdieren compatibele wiegsonde. Ga vervolgens verder met het positioneren van de muis door zijn tanden op de bijtbalk te haken.</li>
	<li>Trek de kop van de muis in de 25 mm volumespoel en stel de neuskegel aan die is vastgemaakt aan het isofluraananesthesiesysteem. Draai de knop van de bijtbalk vast om de positie te behouden voor de duur van de scan. OPMERKING: Als u een contrastversterkte MRI-scan uitvoert, zorg er dan voor dat het gadolinium (in dit geval) of contrastmiddel ten minste 10 minuten voordat u het apparaat in de boormagneet plaatst, wordt geïnjecteerd. Gedurende de tijd van de beeldvorming worden de muizen verdoofd door de inademing van 2-3% isofluraan in de lucht via de neuskegel en wordt hun ademhalingsfrequentie tegelijkertijd gecontroleerd.</li>
	<li>Gebruik voor de ademhalingsbeoordeling een ademhalings- / ademhalingsbewakingsapparaat. OPMERKING: Het is belangrijk om ook de lichaamstemperatuur te beoordelen om mogelijke onderkoeling als gevolg van langdurige blootstelling aan anesthesie te voorkomen. Het wordt aanbevolen om warmtekussens te gebruiken om de lichaamstemperatuur te regelen.<ol><li>Bevestig de ademmonitorsonde dicht bij het diafragma en zet deze vast met chirurgische tape. Houd de ademhalingssnelheid tussen 20-60 ademhalingen per minuut, zodat de toestand van de muis stabiel is. OPMERKING: Deze snelheid biedt stabielere MRI-beelden en voorkomt bewegingsartefacten in het verkregen beeld. Als de ademhalingsfrequentie hoger is dan het bereik van 20-60 ademhalingen per minuut, verhoog dan de concentratie isofluraan. Als de ademhalingsfrequentie minder dan 20 ademhalingen per minuut is, is de anesthesie te diep; Daarom moet de concentratie worden verlaagd.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de dierensonde in de kleine boring in het verticaal verticaal gedragen MRI-systeem voor kleine dieren. Pas het hoofd van het dier in het midden van de spoel aan. Bevestig het apparaat met het slot zodat het rechtop kan staan en sluit het instrument aan op de computer.</li>
	<li>Open en gebruik de software (bijv. Paravision) om de scanposities en soorten scans in te stellen. Bepaal de optimale axiale en sagittale posities terwijl u ze consistent houdt voor alle experimentele groepen. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de verwerving van een testscan als referentie te gebruiken voorafgaand aan de daadwerkelijke MRI-scans van volledige lengte.</li>
	<li>Ga verder met de MRI-gegevensverzameling (zoals eerder beschreven32,34,35,36). Verkrijg zowel T1-gewogen als T2-gewogen MRI-beelden met behulp van de hieronder genoemde voorgestelde instelling.<ol><li>Gebruik voor T1-gewogen MRI-beelden de T1-gewogen multislice multiecho (MSME)-sequentie met een herhalingstijd (TR) van 300 ms, een echotijd (TE) van 9,5 ms, een gezichtsveld (FOV) van 4 cm x 2 cm x 2 cm en een matrix van 192 x 96 x 96.</li>
		<li>Gebruik voor T2-gewogen MRI-beelden een Multislice Multiecho (MSME)-sequentie met een TR van 300 ms, een TE van 9,5 ms, een FOV van 4 cm x 2 cm x 2 cm en een matrix van 192 x 96 x 96.</li>
	</ol></li>
	<li>Zodra de scans zijn voltooid, verwijdert u de sonde uit de boring. Trek de muis voorzichtig uit door de tanden van de bijtbalk te verwijderen. Houd het dier in een aparte kooi in de gaten totdat het volledig bij bewustzijn is en weer voldoende motoriek heeft.</li>
	<li>Gebruik na de extractie van gegevens uit de software analysesoftware voor de kwantificering en 3D-volumeweergave (figuur 4) van de hyperintensiteitsgebieden. OPMERKING: Indien mogelijk wordt het sterk aangemoedigd om twee afzonderlijke geblindeerde waarnemers te hebben voor de gegevensanalyse.</li>
</ol>

S.S.K. is een uitvinder van patenten op het gebied van CAR-immunotherapie die in licentie zijn gegeven aan Novartis (via een overeenkomst tussen Mayo Clinic, University of Pennsylvania en Novartis) en aan Mettaforge (via Mayo Clinic). R.L.S. en S.S.K. zijn uitvinders van patenten op het gebied van CAR-immunotherapie die in licentie zijn gegeven aan Humanigen. S.S.K. ontvangt onderzoeksfinanciering van Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs en Lentigen.

In dit rapport is een methodologie beschreven om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen met behulp van een ALL PDX-model. Meer specifiek probeert dit model twee levensbedreigende toxiciteiten na te bootsen, CRS en NI, die patiënten vaak ervaren na de infusie van CART-cellen. Het vat vele kenmerken van CART-toxiciteiten samen die in de kliniek zijn waargenomen: gewichtsverlies, motorische disfunctie, neuro-inflammatie, inflammatoire cytokine- en chemokineproductie en de infiltratie van verschillende effectorcel...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

Chimere antigeenreceptor T (CART) celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van kankerimmunotherapie. Het heeft bewezen succesvol te zijn bij de behandeling van recidiverende / refractaire acute lymfatische leukemie (ALL), grootcellig B-cellymfoom, mantelcellymfoom, folliculair lymfoom en multipel myeloom 1,2,3,4,5,6,7, wat leidt tot recente FDA-goedkeuringen. Ondanks het aanvankelijke succes in klinische onderzoeken, resulteert behandeling met CART-celtherapie in toxiciteiten die vaak ernstig en soms dodelijk zijn. De meest voorkomende toxiciteiten na CART-celtherapie zijn de ontwikkeling van CRS en NI, ook wel immuuneffectorcelgeassocieerd neurotoxiciteitssyndroom (ICANS) genoemd8,9. CRS wordt veroorzaakt door de overactivatie en massale expansie van CART-cellen in vivo, wat leidt tot de daaropvolgende secretie van meerdere inflammatoire cytokines, waaronder interferon-γ, tumornecrosefactor-α, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine-6 (IL-6). Dit resulteert in hypotensie, hoge koorts, capillair leksyndroom, respiratoire insufficiëntie, multi-orgaanfalen en in sommige gevallen de dood10,11. CRS ontwikkelt zich in 50-100% van de gevallen na CART19 celtherapie11,12,13. ICANS is een andere unieke bijwerking geassocieerd met CART-celtherapie en wordt gekenmerkt door gegeneraliseerd hersenoedeem, verwarring, obtundatie, afasie, motorische zwakte en af en toe aanvallen 9,14. Elke graad van ICANS komt voor bij maximaal 70% van de patiënten, en graad 3-4 wordt gemeld bij 20-30% van de patiënten 5,10,15,16. Over het algemeen komen CRS en ICANS vaak voor en kunnen ze fataal zijn.
Het beheer van ICANS na CART-celtherapie is een uitdaging. De meeste patiënten met ICANS ervaren ook CRS17, dat vaak kan worden behandeld met de IL-6-receptorantagonist tocilizumab of steroïden18. Een eerder rapport toonde aan dat vroege interventie met tocilizumab de snelheid van ernstige CRS verminderde, maar geen invloed had op de incidentie of ernst van ICANS19. Momenteel is er geen effectieve behandeling of profylactisch middel voor ICANS, en het is cruciaal om preventieve strategieën te onderzoeken20.
Myeloïde cellen en bijbehorende cytokines/chemokines worden beschouwd als de belangrijkste aanjagers van de ontwikkeling van CRS en ICANS21. Terwijl CRS direct gerelateerd is aan de extreme verhoging van cytokines en T-celexpansie, is de pathofysiologie van ICANS grotendeels onbekend22,23. Daarom is het noodzakelijk om een muismodel op te stellen dat deze toxiciteiten na CART-celtherapie samenvat om de mechanismen te bestuderen en preventieve strategieën te ontwikkelen.
Er zijn meerdere preklinische diermodellen die momenteel worden gebruikt om de werkzaamheid van CART-cellen te bestuderen, te optimaliseren en te valideren, en om hun bijbehorende toxiciteiten te controleren. Deze omvatten syngene, xenograft, immunocompetente transgene, gehumaniseerde transgene en patiënt-afgeleide xenograftmuizen, naast primatenmodellen. Elk van deze modellen heeft echter nadelen en sommige weerspiegelen niet de werkelijke werkzaamheid of veiligheidsproblemen van CART-cellen24,25. Daarom is het noodzakelijk om zorgvuldig het beste model te kiezen voor de beoogde doelen van het onderzoek.
Dit artikel beoogt de methodologie te beschrijven die wordt gebruikt om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten, CRS en NI te beoordelen, met behulp van een ALL patient-derived xenograft (PDX) in vivo model (Figuur 1). In het bijzonder worden in de hier beschreven methoden CART19-cellen gebruikt die in het laboratorium van de auteurs zijn gegenereerd volgens eerder beschreven protocollen. Kortom, menselijke T-cellen worden geïsoleerd uit gezonde donor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) via een dichtheidsgradiënttechniek, gestimuleerd met CD3 / CD28-kralen op dag 0 en lentiviraal getransduceerd op dag 1 met CARs samengesteld uit een CD19-gericht enkelvoudig keten variabel fragment gefuseerd met 4-1BB- en CD3ζ-signaleringsdomeinen. Deze CART-cellen worden vervolgens uitgebreid, ont-beaded op dag 6 en gecryopreserveerd op dag 8 26,27,28,29,30. Zoals eerder beschreven, worden muizen onderworpen aan een lymfodepleterende behandeling, gevolgd door de toediening van van de patiënt afgeleide leukemische blasten (ALL)28. Eerst wordt tumortransplantatie geverifieerd via submandibulaire bloedafname. Na het vaststellen van een geschikte tumorlast worden CART19-cellen toegediend aan de muizen. Vervolgens worden de muizen dagelijks gewogen om het welzijn te beoordelen. Beeldvorming van magnetische resonantie van kleine dieren (MRI) wordt uitgevoerd om NI te beoordelen, samen met staartbloedingen om T-celexpansie en cytokine / chemokineproductie te beoordelen. De hieronder beschreven technieken worden ten zeerste aanbevolen om te worden gebruikt als een model om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten in een PDX-model te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;APC Anti-Human CD19</td><td>Biolegend</td><td>302211</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pad</td><td>Wecol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 14.0 software</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>N/A</td><td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td></tr><tr><td>Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td>Topical ophtalmic gel om oogdroogheid te voorkomen</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution&nbsp;</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Rode bloedcellen lysing buffer</td></tr><tr><td>BD Micro-Fin IV insulin syringes</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-Human CD45</td><td>Biolegend</td><td>304032</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance II 7 Tesla&nbsp;</td><td>Bruker Biospin</td><td>N/A</td><td>MRI-apparaat</td></tr><tr><td>Busulfan (NSC-750)</td><td>Selleckchem</td><td>S1692</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolute counting beads</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>flow cytometer</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ERT Control/Gating Module&nbsp;</td><td>SA Instruments</td><td>Model 1030</td><td>Klein Dier Monitoring Ademhalings- en Gating Systeem</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Bright-Line</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Liquid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Microvette 500 Lithium heparin</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>Bloedopnamebuis</td></tr><tr><td>MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel</td><td>Millipore Sigma</td><td>HCYTMAG-60K-PX38</td><td>Immunologie Multiplex Assay om cytokines en chemokines te identificeren</td></tr><tr><td>Omniscan</td><td>Ge Healthcare Inc.</td><td>0407-0690-10</td><td>Gadolinium-gebaseerd contrastmiddel</td></tr><tr><td>Pd Anti-Mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom Polysterene Test tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Surgical Blade</td><td>Bard-Parker</td><td>371215</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van chimere antigeenreceptor t-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Chimere antigeenreceptor T (CART) celtherapie is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor de behandeling van meerdere soorten CD19 + maligniteiten, wat heeft geleid tot de recente FDA-goedkeuring van verschillende CD19-gerichte CART (CART19) celtherapieën. CART-celtherapie wordt echter geassocieerd met een unieke reeks toxiciteiten die hun eigen morbiditeit en mortaliteit met zich meebrengen. Dit omvat cytokine release syndrome (CRS) en neuro-inflammatie (NI). Het gebruik van preklinische muismodellen is cruciaal geweest in het onderzoek en de ontwikkeling van CART-technologie voor het beoordelen van zowel CART-werkzaamheid als CART-toxiciteit. De beschikbare preklinische modellen om deze adoptieve cellulaire immunotherapie te testen omvatten syngene, xenograft, transgene en gehumaniseerde muismodellen. Er is geen enkel model dat naadloos het menselijk immuunsysteem weerspiegelt, en elk model heeft sterke en zwakke punten. Dit methodedocument heeft tot doel een van de patiënt afgeleid xenograftmodel te beschrijven met behulp van leukemische blasten van patiënten met acute lymfatische leukemie als een strategie om CART19-geassocieerde toxiciteiten, CRS en NI te beoordelen. Van dit model is aangetoond dat het CART19-geassocieerde toxiciteiten en therapeutische werkzaamheid zoals gezien in de kliniek samenvat.

Het doel van dit protocol is om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen met behulp van een PDX-muizenmodel van tumorcellen van patiënten met ALL (figuur 1). Ten eerste kregen NSG-muizen i.p. injecties met busulfan (30 mg/kg) met als doel ze immunosuppressief te maken en CART-celtransplantatiete vergemakkelijken 28. De volgende dag ontvingen ze ~5 × 106 PBMC's (i.v.) afkomstig van ALLE patiënten. De muizen werden gedurende ~ 13 weken gecontroleerd ...

Hier beschrijven we een protocol waarin een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmodel wordt gebruikt als een strategie om CD19-gerichte chimere antigeenreceptor T-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen en te monitoren.

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Dit protocol maakt gebruik van menselijke CAR-T en tumorcellen en toont nauwkeurig de toxiciteiten aan die gepaard gaan met CART19-toediening. Daarom een samenvatting van wat er in de kliniek is waargenomen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dit platform is dat het een vertaalbaar en klinisch relevant model biedt waarbij menselijke T-cellen en tumorcellen worden gebruikt.Dit model maakt niet alleen een efficiënte beoordeling van CART19-geassocieerde toxiciteiten mogelijk, maar stelt ons ook in staat om beter te begrijpen hoe we deze toxiciteiten kunnen overwinnen door verbeterde behandelingsstrategieën. Controleer om te beginnen de door CART19 toegediende muizen twee keer per dag om eventuele veranderingen in hun welzijn te beoordelen, zoals motorische zwakte, gebogen lichaam en verlies van lichaamsgewicht. Zodra de muizen motorische zwakte en gewichtsvermindering ontwikkelen, verzamelt u hun perifere bloed om de tumorlast te analyseren.En voer serumisolatie uit voor cytokines, zoals beschreven in het manuscript. Bewaar na isolatie de serummicrocentrifugebuizen bij 80 graden Celsius en gebruik de cera om de chemokines en cytokines te analyseren met behulp van de multiplextest. Meng voor MRI-beeldvorming 120 microliter gadolinium met 880 microliter zoutoplossing en laad deze in een insulinespuit van één milliliter.Injecteer 100 microliter van de bereide oplossing intraperitoneaal in elke muis. Verdoof de muis en plaats deze op de knaagdiercompatibele wiegsonde. Haak dan zijn tanden op de bijtbalk.Trek de kop van de muis in de 25 millimeter volumespoel en pas de neuskegel aan die is vastgemaakt aan het isofluraananesthesiesysteem. Draai de knop van de bijtbalk vast om de positie te behouden voor de duur van de scan. Bevestig voor de beoordeling van de ademhaling de sonde van een ademhalingsbewakingsapparaat dicht bij het diafragma en bevestig het met chirurgische tape.Houd de ademhalingsfrequentie tussen 20 en 60 ademhalingen per minuut, zodat de toestand van de muis stabiel blijft. Steek de dierensonde in de kleine boring in het MRI-systeem met verticale boring voor kleine dieren en pas de kop van het dier in het midden van de spoel aan. Gebruik het slot om het apparaat rechtop te zetten en het instrument op de computer aan te sluiten.Open vervolgens de ParaVision-software om de scanposities en soorten scans in te stellen. Bepaal de optimale sagittale en axiale posities en houd ze consistent voor alle experimentele groepen. Om de T1-gewogen MRI-gegevens te verzamelen, gebruikt u T1-gewogen multi-slice, multi-echosequentie met een herhalingstijd van 300 milliseconden, een echotijd van 9,5 milliseconden, een gezichtsveld van 4,00 X 2,00 X 2,00 centimeter en een matrix van 192 X 96 X 96.Gebruik voor T2-gewogen MRI-beelden een multi-slice, multi-echo-sequentie met vergelijkbare parameters. Zodra de scans zijn voltooid, verwijdert u de sonde uit de boring en haalt u de muis voorzichtig uit door de tanden van de bijtbalk te verwijderen. Na het extraheren van gegevens uit de software, gebruik analysesoftware voor de kwantificering en 3D-volumeweergave van de hyperintensiteitsgebieden CD19 + tumorcelpopulaties werden vergeleken tussen muizen behandeld met CART19 en onbehandelde muizen met behulp van flowcytometrie.Significante gewichtsvermindering werd waargenomen bij muizen die werden behandeld met CART19-cellen. Gewichtsverlies wordt beschouwd als een symptoom van CRS-uiterlijk, dat gerelateerd is aan CART-cel geassocieerde toxiciteiten. Een multiplextest onthulde de expressie van cytokines en chemokines in NSG-muizenserum voor en na toediening van CART19.T2-gewogen beelden onthulden bewijs van oedeem en mogelijk inflammatoir infiltraat tijdens neuro-inflammatie bij met CART19 behandelde muizen. Terwijl de T1-gewogen MRI contrastverbetering in het hersenparenchym liet zien, wat wijst op een verhoogde vasculaire permeabiliteit. Driedimensionale reconstructies van het knaagdierbrein werden samengesteld op basis van T1-hyperintensiteitsgebieden die overeenkomen met vasculaire permeabiliteit, waardoor het volume van gadoliniumlekkage in de hersenen wordt weergegeven.Het is belangrijk om te onthouden dat de dagelijkse fysieke monitoring van de muizen na toediening van CART19, samen met perifere bloedingen, de beste indicator zal zijn om door te gaan met MRI voor het volledig beoordelen van eventuele veranderingen in de hersenen die wijzen op CRS of neurotoxiciteit. Deze technologie is breed toepasbaar op aanvullende CAR-T-celtherapieën en stelt wetenschappers in staat om potentiële toxiciteiten die voortvloeien uit nieuwe CAR-T-cellen efficiënt te testen. Dit voorgestelde model is een springplank om te begrijpen hoe CAR-T-cel geassocieerde toxiciteiten kunnen worden gemonitord, behandeld en gebruikt om nieuwe CAR-T-celmodellen te valideren.

assessment-chimeric-antigen-receptor-t-cell-associated-toxicities

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Receptor tyrosine kinases worden ectopisch uitgedrukt in vele kanker en zijn geïdentificeerd als therapeutische doelwitten bij acute leukemie. Dit manuscript beschrijft een efficiënte strategie voor pre-klinische evaluatie van tyrosine kinase inhibitoren voor de behandeling van acute leukemie.

Pre-klinische evaluatie van tyrosinekinaseremmers voor de behandeling van acute leukemie

Mantel cel lymfoom (MCL) is een moeilijk te behandelen stoornis van de B-cel en het is even moeilijk vast te stellen een muismodel van xenograft van primaire MCL te bestuderen en ontwikkelen van therapeutics. Hier beschrijven we de succesvolle invoering van MCL xenografts bij muizen om te helpen begrijpen van de onderliggende biologie.

Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

Hier presenteren we een protocol voor de productie en de preklinische beproeving van lymfkliertest CD19 auto T-cellen door retrovirale transductie en gebruik als een therapie tegen gevestigde syngeneic A20 B-cel lymfoom in BALB/c muizen met of zonder lymphodepleting Preconditionering.

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode recursief uitdaging tumor-gerichte T-cellen, die het mogelijk voor fenotypische en functionele analyse van antitumorale T cel activiteit maakt.

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

Dit protocol schetst de generatie van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS) voor immuno-oncologische studies. Instructies en overwegingen bij het gebruik van dit model voor het testen van menselijke immunotherapeutica op menselijke tumoren die in dit model zijn geïmplanteerd, worden gepresenteerd met de nadruk op het karakteriseren van de reactie van het menselijk immuunsysteem op de tumor.

Testen van kankerimmunotherapeutica in een gehumaniseerd muismodel met menselijke tumoren

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Dit protocol beschrijft in ovo xenotransplantatie van van de patiënt afgeleide B- en T-acute lymfoblastische leukemie (ALL)-cellen, die 4 dagen na injectie plaatsvindt.

In Ovo Xenotransplantatie van van patiënten afgeleide acute lymfoblastische leukemie (ALL)-cellen (PDX-ALL)

Het protocol heeft tot doel een muismodel te beschrijven voor het genereren van recidieven van acute lymfatische leukemie, gebaseerd op de dynamiek van de respons op inductiechemotherapie.

Muismodel van leukemie Terugval naar inductiechemotherapie voor acute lymfoblastische leukemie

Leer hoe u toxiciteiten van CD19-gerichte CAR-T-celtherapie evalueert met een patiënt-afgeleid xenograftmuismodel van acute lymfoblastische leukemie. Dit model biedt een klinisch relevant platform voor het verbeteren van behandelstrategieën.

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel

Meer video's verkennen