Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Deze methode maakt het mogelijk om formaties van eiwitcomplexen te bestuderen die co-expressie vereisen voor efficiënte testmonsters, zoals de vorming van heterodimeren. Het belangrijkste eindpotentieel van deze methode is het benutten van de co-expressie van differentieel gelabelde bestudeerde eiwitten met behulp van combinaties van compatibele vectoren om efficiënte complexe assemblage te bevorderen, samen met een tijdefficiënte workflow en schaalbaarheid die snelle patch-testen van meerdere interacties mogelijk maken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor een snelle screening van optimale eiwitexpressie- en zuiveringscondities.

Visuele demonstratie helpt bij het correct uitvoeren van kritieke stappen van het protocol, zoals het instellen van co-expressies, celverstoring en daaropvolgende vervolgkeuzestappen. Om te beginnen, kweek Escherichia coli BL21 (DE3) stam in Luria-Bertani, of LB, media bij 37 graden Celsius tot een optische dichtheid, of OD, van 0,1 tot 0,2. Centrifugeer één milliliter van de bacteriële suspensie gedurende één minuut bij 9.000 G bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter ijskoude transformatiebuffer of TB toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer gedurende 30 seconden bij 8.000 G bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 100 microliter TB-buffer toe, 100 nanogram van elke vector en inccubeer gedurende 30 minuten op ijs.

Verwarm gedurende 150 seconden op 42 graden Celsius en koel vervolgens een minuut op ijs. Voeg vervolgens een milliliter LB-media toe zonder antibiotica en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius. Na incubatie, centrifugeer en resuspensie de pellet in 100 microliter LB-media voordat u de suspensie op een LB-agarplaat met 0,5% glucose en bijbehorende antibiotica plaatst.

Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius. Spoel de cellen de volgende dag van de plaat met twee milliliter LB-media in 50 milliliter LB-media met bijbehorende antibiotica. Voeg metaalionen of andere bekende co-factoren toe voordat u een aliquot met 20% glycerol bij min 70 graden Celsius opslaat voor volgende experimenten.

Kweek de cellen met een constante rotatie van 220 RPM bij 37 graden Celsius tot een OD van 0,5 tot 0,7. Koel de cultuur af tot kamertemperatuur en voeg IPTG toe tot een uiteindelijke concentratie van één millimol. Bewaar een aliquot van 20 microliter celsuspensie als controle van het niet-geïnduceerde monster.

Incubeer de cellen 's nachts bij 220 RPM bij 18 graden Celsius. Verdeel de volgende dag de bacteriële suspensie in twee delen en bewaar aliquots van 20 microliter om de eiwitexpressie te bevestigen. Centrifugeer de resterende celsuspensie gedurende 15 minuten bij 4.000 G.

Voor de pulldown-test resuspendeert u de pellets in één milliliter ijskoude lysisbuffer met proteaseremmers en reductiemiddelen die onmiddellijk voorafgaand aan het experiment zijn toegevoegd. Pas de buffersamenstelling aan voor de geteste eiwitten. Verstoor de cellen door ultrasoonapparaat op ijs en sla een aliquot van 20 microliter op voor elektroforese.

Centrifugeer op 16.000 G gedurende 30 minuten en verzamel 20 microliter van het geklaarde lysaat voor elektroforese. Breng de hars in evenwicht met één milliliter ijskoude lysisbuffer gedurende 10 minuten, centrifugeer vervolgens gedurende 30 seconden op 2.000 G en gooi het supernatant weg. Voeg cellysaten toe aan de hars en incubeer gedurende 10 minuten bij een constante rotatie van 15 RPM.

Centrifugeer vervolgens en gooi het supernatant weg voordat u 20 microliter van de ongebonden fractie verzamelt voor analyse. Voeg vervolgens een milliliter ijskoude wasbuffer toe en incubeer gedurende één minuut. Nogmaals, centrifugeer en gooi het supernatant weg.

Voer vervolgens twee lange wasbeurten uit met ijskoude wasbuffer. Na de tweede wasbeurt, elueer de gebonden eiwitten met 50 microliter van de elutiebuffer in een shaker bij 1, 200 RPM bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Analyseer de geëlueerde eiwitten met SDS polyacrylamide gel elektroforese.

Studies van het zinkvinger-geassocieerde domein, of ZAD, homo-dimerisatie in maltose-bindend eiwit, of MBP, en 6xHistidine pulldown assays worden hier getoond. De co-expressie van MBP en Thioredoxine 6xHistidine-gesmolten ZADs toont een goede en reproduceerbare homodimerisatie-activiteit, die als een extra band verschijnt in de SDS-PAGE-resultaten van de MBP pulldown-assay. Een ander voorbeeld van het gebruik van de methode om alternatieve complexe formatie te bestuderen, wordt hier getoond.

In de co-expressietest had 6xHistidine-tagged ENY2 interactie met zowel GST-tagged Sgf11 als MBP-CTCF, maar er was geen GST-Sgf11 aanwezig in de MBP-pulldowns en vice versa. Een stapsgewijze vergelijking van de vereiste tijdsintervallen in de workflow van de conventionele pulldown-test in vergelijking met pulldown gekoppeld aan co-expressie wordt hier getoond. De resultaten van het gebruik van beide technieken om dezelfde interactie tussen het BTB-domein van het CP190-eiwit en het GST-gelabelde C-terminale domein van Drosophila CTCF-eiwit te bestuderen, worden hier weergegeven.

De juiste keuze van affiniteits- en oplosbaarheidstest, Thioredoxine, GST of MBP, is van cruciaal belang voor de efficiënte uitvoering van de test. Een andere cruciale stap is snelle en uniforme celverstoring. Het wordt ten zeerste aanbevolen om multi-tip sonicator-sondes te gebruiken.

Deze methode maakt de directe studie mogelijk van de heterodimeervorming tussen eiwitdomeinen die anders homodimeren vormen die niet zouden loskoppelen tijdens de incubatie van gezuiverde eiwitten in conventionele pulldown-assay.