Name: Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Leer een tijdefficiënte pulldown-methode met co-expressie in Escherichia coli voor het bestuderen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties en heterodimeervorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de projecten 19-74-30026 (methodeontwikkeling en -validatie) en 19-74-10099 (eiwit-eiwitinteractietests); en door het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie-subsidie 075-15-2019-1661 (analyse van representatieve eiwit-eiwitinteracties).

De schematische weergave van de methodeworkflow wordt weergegeven in figuur 1.
1. Co-transformatie van E. coli
<ol><li>Bereid expressievectoren voor doeleiwitten voor met behulp van standaard kloonmethoden. OPMERKING: Doorgaans is een goed uitgangspunt om conventionele pGEX / pMAL-vectoren te gebruiken met een ampicillineresistentiegen en ColE1-oorsprong voor de expressie van GST / MBP-gelabelde eiwitten en een compatibele vector met p15A- of RSF-oorsprong en kanamycineresistentie om 6xHis-gelabelde eiwitten tot expressie te brengen, in sommige gevallen gecombineerd met Thioredoxine of SUMO-tag om de oplosbaarheid te verhogen. Meestal moeten voorafgaand aan het experiment verschillende combinaties van tags worden getest. De beschreven methode zelf is handig voor het batchgewijs testen van de expressiecondities van doeleiwitten. Het is belangrijk op te merken dat de meeste Rosetta-stammen al het plasmide met p15A-oorsprong bevatten voor het tot expressie brengen van de tRNA's voor zeldzaam codon; dus als het gebruik van dergelijke stammen een mogelijke optie is, moeten de p15A-plasmiden worden vermeden. Zie de materiaaltabel voor meer informatie.<ol><li>Kweek bacteriën van een geschikte stam in Luria-Bertani (LB) media bij 37 °C tot een optische dichtheid (OD) van 0,1-0,2. BL21(DE3) stam werd gebruikt voor voorbeelden in deze studie. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om vers bereide competente cellen te gebruiken om efficiënte co-transformatie met twee vectoren te bereiken. Als meer dan twee vectoren gezamenlijk moeten worden getransformeerd, is het beter om ze sequentieel te transformeren om een goede transformatie-efficiëntie te bereiken. Elektroporatie is een goed alternatief.</li>
		<li>Centrifugeer 1,0 ml van de bacteriële suspensie gedurende 1 minuut bij 9.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Voeg 0,5 ml ijskoude buffertransformatiebuffer (TB) toe (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 en 15 mM CaCl2) en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 30 s bij 8.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Voeg 100 μL TB-buffer toe, voeg 100 ng van elke vector toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Transformeer afzonderlijke vectoren afzonderlijk om eiwitgedrag te bestuderen zonder co-expressie. Bovendien co-transformeert u expressievectoren in paren met lege co-expressievectoren voor niet-specifieke bindingsbesturingselementen. OPMERKING: In de voorbeelden in deze studie werden pGEX/pMAL-vectoren met overeenkomstige cDNA's gefuseerd tot GST/MBP cDNA's gebruikt in combinatie met compatibele pACYC-afgeleide vectoren met cDNA-coderende partnereiwitdomeinen gefuseerd met Thioredoxine cDNA.</li>
		<li>Verwarm op 42 °C gedurende 150 s en koel vervolgens gedurende 1 minuut op ijs.</li>
		<li>Voeg 1 ml vloeibare LB-media zonder antibiotica toe en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 °C. Plaat op LB-agarplaten met 0,5% glucose en bijbehorende antibiotica (veel voorkomende concentraties zijn: 50 mg/L ampicilline; 20 mg/L kanamycine; 50 mg/L streptomycine; 35 mg/L chlooramfenicol). Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Expressie
<ol><li>Spoel de cellen van de plaat met 2 ml vloeibare LB-media in 50 ml LB-media met bijbehorende antibiotica (veel voorkomende concentraties zijn: 50 mg / L ampicilline; 20 mg / L kanamycine; 50 mg / L streptomycine; 35 mg / L chlooramfenicol). Voeg metaalionen of andere bekende co-factoren toe (in de voorbeelden in deze studie werd 0,2 mM ZnCl2 aan de media toegevoegd). Bewaar een aliquot met 20% glycerol bij -70 °C voor een volgende herhaling van het experiment. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om verschillende kolonies rechtstreeks van de plaat te spoelen om de mogelijkheid van slechte expressie in een enkele geïsoleerde kloon uit te sluiten als gevolg van incidentele recombinatiegebeurtenissen tussen twee plasmiden.</li>
	<li>Kweek de cellen met een constante rotatie van 220 rpm bij 37 °C tot een OD van 0,5-0,7, koel af tot kamertemperatuur (RT) en voeg isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan 1 mM. Bewaar een aliquot van 20 μL celsuspensie als controle van het niet-geïnduceerde monster.</li>
	<li>Incubeer de cellen met een constante rotatie van 220 rpm bij 18 °C gedurende een nacht. OPMERKING: De optimale tijd en temperatuur van incubatie kan variëren; 18 °C 's nachts werkt het beste voor de meeste eiwitten en wordt geadviseerd om standaard te proberen. Verminder de incubatietijd tot 2-3 uur als een sterke niet-specifieke binding wordt waargenomen.</li>
	<li>Verdeel de bacteriële suspensie in twee delen (of meer als meer dan twee verschillende tags werden gebruikt) en bewaar een aliquot van 20 μL van de celsuspensie om de eiwitexpressie te bevestigen. Centrifugeer op 4.000 x g gedurende 15 min. OPMERKING: Pauzepunt: bacteriële pellets kunnen minstens 6 maanden bij -70 °C worden bewaard.</li>
</ol>3. Pulldown assay
OPMERKING: De gedetailleerde procedures worden beschreven voor eiwitten die zijn gelabeld met 6xHis of MBP / GST. Alle procedures worden uitgevoerd bij 4°C.
<ol><li>Resuspendeer de bacteriële pellets in 1 ml ijskoude lysisbuffer met proteaseremmers en reductiemiddelen (zie hieronder) die onmiddellijk voorafgaand aan het experiment zijn toegevoegd. Vermijd dithiotreitol (DTT) bij het gebruik van metaalchelaatharsen, omdat het metaalionen verwijdert. Pas de buffersamenstelling aan voor de geteste eiwitten. De meest voorkomende recepten van lysisbuffers die geschikt zijn bevonden voor de meeste eiwitten zijn:<ol><li>6xHis-pulldown: Meng 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazool, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol, 5 mM beta-mercaptoethanol, 1 mM fenylmethylsfulfonylfluoride (PMSF) en een 1:1.000 verdunning van de proteaseremmercocktail (zie materiaaltabel).</li>
		<li>GST- of MBP-pulldown: Meng 20 mM Tris (pH 7,5 bij 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF en een 1:1.000 verdunning van de proteaseremmercocktail (zie materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Verstoor de cellen door ultrasoonapparaat op ijs. Bewaar een aliquot van 20 μl voor elektroforese. OPMERKING: Doorgaans zijn 20-25 pulsen van 5 s met intervallen van 15 s met een uitgangsvermogen van 20 W per monster vereist. Het juiste ultrasoonapparaatvermogen moet voor elk instrument worden aangepast om oververhitting te voorkomen en totale celverstoring te garanderen. Om betere prestaties te bereiken, wordt het sterk aanbevolen om multi-tip sonicatorsondes met hoge doorvoer te gebruiken.</li>
	<li>Centrifugeer op 20.000 x g gedurende 30 min. Verzamel 20 μL van het geklaarde lysaat voor daaropvolgende SDS-PAGE-analyse.</li>
	<li>Breng de hars (50 μL voor elk monster) in evenwicht met 1 ml ijskoude lysisbuffer gedurende 10 minuten, centrifugeer gedurende 30 s op 2.000 x g en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg cellysaten (totale eiwitconcentratie: 20-50 mg / ml) toe aan de hars, incubeer gedurende 10 minuten bij een constante rotatie van 15 tpm, centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg. Verzamel 20 μL van de ongebonden fractie voor een latere SDS-PAGE-analyse.</li>
	<li>Voeg 1 ml ijskoude wasbuffer toe en incubeer gedurende 1 minuut. Centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg. De meest voorkomende recepten voor wasbuffers zijn:<ol><li>6xHis-pulldown: Meng 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazool, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol en 5 mM beta-mercaptoethanol.</li>
		<li>GST- of MBP-pulldown: Mix 20 mM Tris (pH 7,5 bij 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glycerol en 5 mM DTT.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer twee lange wasbeurten uit: voeg 1 ml ijskoude wasbuffer toe, incubeer gedurende 10-30 minuten met een constante rotatie van 15 tpm, centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 1 ml ijskoude wasbuffer toe, incubeer gedurende 1 minuut, centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Elueer de gebonden eiwitten met 50 μL van de elutiebuffer in een shaker bij 1.200 tpm gedurende 10 min. De meest voorkomende recepten van elutiebuffers zijn:<ol><li>6xHis-pulldown: Meng 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazool en 5 mM beta-mercaptoethanol.</li>
		<li>GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 bij 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutathion (aangepast tot pH 7,5 met basistris) en 5 mM DTT.</li>
		<li>MBP-pulldown: Mix 20 mM Tris (pH 7,5 bij 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltose en 5 mM DTT.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer de geëlueerde eiwitten met SDS-PAGE. OPMERKING: Het percentage acrylamide moet worden aangepast aan de grootte van de eiwitten. In de voorbeelden in deze studie werden 12% acrylamidegels gebruikt, draaiend in tris-glycine-SDS-buffer (2 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,1% SDS) bij een constante spanning van 180 V. Gels werden gekleurd door koken in 0,2% Coomassieblauw R250, 10% azijnzuur en 30% isopropanol, en ontkleurd door koken in 10% azijnzuur. De hoeveelheid geladen eiwit mag niet gelijk zijn, omdat verschillende hoeveelheden interagerende eiwitten in verschillende experimenten naar beneden kunnen worden getrokken.</li>
</ol>

<ol><li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+Pulldown+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li>
<li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+dimerization%2C+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li>
<li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li>
<li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602(2022).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755(2021).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li>
<li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li>
<li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316(2016).</li>
<li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mediator+head+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li>
<li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li>
<li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li>
<li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li>
<li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+ferritin%3A+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li>
<li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li>
<li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li>
<li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li>
<li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number%3A+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li>
<li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li>
<li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70(2019).</li>
<li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+two-hybrid+%28F2H%29+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li>
<li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68(2008).</li>
<li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Doklady+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li>
<li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+insulator+proteins%2C+Pita+and+ZIPIC%2C+target+CP190+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li>
<li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16(2021).</li>
<li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

De beschreven methode maakt het testen van eiwit-eiwitinteracties mogelijk die niet efficiënt in vitro kunnen worden geassembleerd en co-expressie vereisen. De methode is een van de weinige geschikte benaderingen voor het bestuderen van heterodimeriserende eiwitten, die ook in staat zijn tot homodimerisatie, omdat dergelijke eiwitten, wanneer ze afzonderlijk worden gezuiverd, stabiele homodimeren vormen die meestal niet kunnen dissociëren en opnieuw associëren tijdens het experiment ...

Conventionele pulldown wordt veel gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen1. Gezuiverde eiwitten interageren echter vaak niet effectief in vitro2,3, en sommige zijn onoplosbaar zonder hun bindingspartner 4,5. Dergelijke eiwitten kunnen co-translationele assemblage of de aanwezigheid van moleculaire chaperonnes 5,6,7,8,9 vereisen. Een andere beperking van conventionele pulldown is het testen van mogelijke heteromultimerisatieactiviteit tussen domeinen die kunnen bestaan als stabiele homo-oligomeren die co-translationeel zijn geassembleerd 8,10, omdat velen van hen niet in vitro kunnen dissociëren en opnieuw associëren tijdens de incubatietijd. Co-expressie bleek nuttig te zijn bij het overwinnen van dergelijke problemen 3,11. Co-expressie met behulp van compatibele vectoren in bacteriën werd met succes gebruikt om grote multi-subunit macromoleculaire complexen te zuiveren, waaronder polycomb repressief complex PRC212, RNA polymerase II mediator head module13, bacteriofaag T4 basisplaat 14, SAGA complex deubiquitinylase module 15,16 en ferritine 17. Replicatiebronnen die vaak worden gebruikt voor co-expressie zijn ColE1, p15A18, CloDF1319 en RSF20. In het in de handel verkrijgbare Duet-expressiesysteem worden deze oorsprongen gecombineerd met verschillende antibioticaresistentiegenen en handige meerdere kloonsites om polycistronische vectoren te produceren, waardoor de expressie van maximaal acht eiwitten mogelijk is. Deze oorsprongen hebben verschillende kopienummers en kunnen in verschillende combinaties worden gebruikt om evenwichtige expressieniveaus van doeleiwittente bereiken 21. Om eiwit-eiwitinteracties te testen, worden verschillende affiniteitstags gebruikt; de meest voorkomende zijn 6xHistidine, glutathion-S-transferase (GST) en maltose-bindend eiwit (MBP), die elk een specifieke affiniteit hebben met de overeenkomstige hars. GST en MBP verbeteren ook de oplosbaarheid en stabiliteit van gelabelde eiwitten22.
Er zijn ook een aantal methoden ontwikkeld waarbij eiwitten co-expressie in eukaryote cellen gebruiken, waarvan de meest prominente gist twee-hybride assay (Y2H)23 is. Y2H-test is goedkoop, gemakkelijk en maakt het testen van meerdere interacties mogelijk; De workflow duurt echter meer dan 1 week om te voltooien. Er zijn ook een paar minder vaak gebruikte zoogdiercel-gebaseerde assays, bijvoorbeeld fluorescent two-hybrid assay (F2H)24 en cell array protein-protein interaction assay (CAPPIA)25. F2H-assay is relatief snel, waardoor eiwitinteracties in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving kunnen worden waargenomen, maar omvat het gebruik van dure beeldvormingsapparatuur. Al deze methoden hebben een voordeel ten opzichte van prokaryote expressie die de oorspronkelijke eukaryote vertaal- en vouwomgeving biedt; Ze detecteren echter indirect interactie, hetzij door transcriptionele activering of door fluorescerende energieoverdracht, die vaak artefacten produceert. Ook kunnen eukaryote cellen andere interactiepartners van eiwitten van belang bevatten, die het testen van binaire interacties tussen eiwitten van hogere eukaryoten kunnen verstoren.
De huidige studie beschrijft een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten gevolgd door conventionele pulldown-technieken. De methode maakt het mogelijk om interacties tussen doeleiwitten te bestuderen die co-expressie vereisen. Het is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown, waardoor batchtests van meerdere doelen mogelijk zijn, waardoor het in de meeste gevallen voordelig is. Co-expressie met behulp van compatibele vectoren is handiger dan polycistronische co-expressie, omdat het geen moeizame kloonstap vereist.

```html
<table><tbody><tr><td>8-ELEMENT sonde</td><td>Sonics</td><td>630-0586</td><td>De hoogproductieve 8-element sonicator sondes</td></tr><tr><td>Agar</td><td>AppliChem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Amylose hars</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021</td><td>Hars voor zuivering van MBP-gelabelde eiwitten</td></tr><tr><td>Antibiotica</td><td>AppliChem</td><td>A4789 (kanamycine); A0839 (ampicilline)</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>69450-M</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>AppliChem</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R (Z605212)</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>AppliChem</td><td>A9782</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16100</td><td>Hars voor zuivering van GST-gelabelde eiwitten</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A2926</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>25214</td><td>Hars voor zuivering van 6xHis-gelabelde eiwitten</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A4773</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AppliChem</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AppliChem</td><td>414753</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>AppliChem</td><td>A3891</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>AppliChem</td><td>A2947</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>pACYCDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71147</td><td>Vector voor co-expressie van eiwitten met p15A replicatie-oorsprong</td></tr><tr><td>pCDFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71340</td><td>Vector voor co-expressie van eiwitten met CloDF13 replicatie-oorsprong</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AppliChem</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail VII</td><td>Calbiochem</td><td>539138</td><td>Protease Inhibitor Cocktail</td></tr><tr><td>pRSFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71341</td><td>Vector voor co-expressie van eiwitten met RSF replicatie-oorsprong</td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>VC505 sonicator</td><td>Sonics</td><td>CV334</td><td>Ultrasoon vloeistofprocesapparaat</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>AppliChem</td><td>A6285</td><td></td></tr></tbody></table>
```

pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is een eenvoudige en veelgebruikte eiwit-eiwit interactie assay. Het heeft echter beperkingen bij het bestuderen van eiwitcomplexen die niet effectief in vitro assembleren. Dergelijke complexen kunnen co-translationele assemblage en de aanwezigheid van moleculaire chaperonnes vereisen; ofwel vormen ze stabiele oligomeren die in vitro niet kunnen dissociëren en opnieuw associëren, ofwel zijn ze instabiel zonder bindende partner. Om deze problemen te overwinnen, is het mogelijk om een methode te gebruiken die is gebaseerd op de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren gevolgd door de conventionele pulldown-technieken. De workflow is tijdsefficiënter in vergelijking met traditionele pulldown omdat het de tijdrovende stappen van afzonderlijke zuivering van interagerende eiwitten en hun daaropvolgende incubatie mist. Een ander voordeel is een hogere reproduceerbaarheid door een aanzienlijk kleiner aantal stappen en een kortere periode waarin eiwitten die in de in vitro omgeving voorkomen worden blootgesteld aan proteolyse en oxidatie. De methode werd met succes toegepast voor het bestuderen van een aantal eiwit-eiwitinteracties wanneer andere in vitro technieken ongeschikt bleken te zijn. De methode kan worden gebruikt voor het batchgewijs testen van eiwit-eiwitinteracties. Representatieve resultaten worden getoond voor studies van interacties tussen BTB-domein en intrinsiek ongeordende eiwitten, en van heterodimeren van zinkvinger-geassocieerde domeinen.

De beschreven methode werd routinematig gebruikt met veel verschillende doelen. Hier worden enkele representatieve resultaten gepresenteerd die waarschijnlijk niet kunnen worden verkregen met behulp van conventionele pulldown-technieken. De eerste is de studie van specifieke ZAD (Zinc-finger-associated domain) dimerisatie11. ZAD's vormen stabiele en specifieke dimeren, waarbij heterodimeren alleen mogelijk zijn tussen nauw verwante domeinen binnen paraloge groepen. De dimeren gevormd door deze dom...

Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Deze methode maakt het mogelijk om formaties van eiwitcomplexen te bestuderen die co-expressie vereisen voor efficiënte testmonsters, zoals de vorming van heterodimeren. Het belangrijkste eindpotentieel van deze methode is het benutten van de co-expressie van differentieel gelabelde bestudeerde eiwitten met behulp van combinaties van compatibele vectoren om efficiënte complexe assemblage te bevorderen, samen met een tijdefficiënte workflow en schaalbaarheid die snelle patch-testen van meerdere interacties mogelijk maken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor een snelle screening van optimale eiwitexpressie- en zuiveringscondities.Visuele demonstratie helpt bij het correct uitvoeren van kritieke stappen van het protocol, zoals het instellen van co-expressies, celverstoring en daaropvolgende vervolgkeuzestappen. Om te beginnen, kweek Escherichia coli BL21 (DE3) stam in Luria-Bertani, of LB, media bij 37 graden Celsius tot een optische dichtheid, of OD, van 0,1 tot 0,2. Centrifugeer één milliliter van de bacteriële suspensie gedurende één minuut bij 9.000 G bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.Voeg vervolgens 0,5 milliliter ijskoude transformatiebuffer of TB toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer gedurende 30 seconden bij 8.000 G bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 100 microliter TB-buffer toe, 100 nanogram van elke vector en inccubeer gedurende 30 minuten op ijs.Verwarm gedurende 150 seconden op 42 graden Celsius en koel vervolgens een minuut op ijs. Voeg vervolgens een milliliter LB-media toe zonder antibiotica en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius. Na incubatie, centrifugeer en resuspensie de pellet in 100 microliter LB-media voordat u de suspensie op een LB-agarplaat met 0,5% glucose en bijbehorende antibiotica plaatst.Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius. Spoel de cellen de volgende dag van de plaat met twee milliliter LB-media in 50 milliliter LB-media met bijbehorende antibiotica. Voeg metaalionen of andere bekende co-factoren toe voordat u een aliquot met 20% glycerol bij min 70 graden Celsius opslaat voor volgende experimenten.Kweek de cellen met een constante rotatie van 220 RPM bij 37 graden Celsius tot een OD van 0,5 tot 0,7. Koel de cultuur af tot kamertemperatuur en voeg IPTG toe tot een uiteindelijke concentratie van één millimol. Bewaar een aliquot van 20 microliter celsuspensie als controle van het niet-geïnduceerde monster.Incubeer de cellen 's nachts bij 220 RPM bij 18 graden Celsius. Verdeel de volgende dag de bacteriële suspensie in twee delen en bewaar aliquots van 20 microliter om de eiwitexpressie te bevestigen. Centrifugeer de resterende celsuspensie gedurende 15 minuten bij 4.000 G.Voor de pulldown-test resuspendeert u de pellets in één milliliter ijskoude lysisbuffer met proteaseremmers en reductiemiddelen die onmiddellijk voorafgaand aan het experiment zijn toegevoegd. Pas de buffersamenstelling aan voor de geteste eiwitten. Verstoor de cellen door ultrasoonapparaat op ijs en sla een aliquot van 20 microliter op voor elektroforese.Centrifugeer op 16.000 G gedurende 30 minuten en verzamel 20 microliter van het geklaarde lysaat voor elektroforese. Breng de hars in evenwicht met één milliliter ijskoude lysisbuffer gedurende 10 minuten, centrifugeer vervolgens gedurende 30 seconden op 2.000 G en gooi het supernatant weg. Voeg cellysaten toe aan de hars en incubeer gedurende 10 minuten bij een constante rotatie van 15 RPM.Centrifugeer vervolgens en gooi het supernatant weg voordat u 20 microliter van de ongebonden fractie verzamelt voor analyse. Voeg vervolgens een milliliter ijskoude wasbuffer toe en incubeer gedurende één minuut. Nogmaals, centrifugeer en gooi het supernatant weg.Voer vervolgens twee lange wasbeurten uit met ijskoude wasbuffer. Na de tweede wasbeurt, elueer de gebonden eiwitten met 50 microliter van de elutiebuffer in een shaker bij 1, 200 RPM bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Analyseer de geëlueerde eiwitten met SDS polyacrylamide gel elektroforese.Studies van het zinkvinger-geassocieerde domein, of ZAD, homo-dimerisatie in maltose-bindend eiwit, of MBP, en 6xHistidine pulldown assays worden hier getoond. De co-expressie van MBP en Thioredoxine 6xHistidine-gesmolten ZADs toont een goede en reproduceerbare homodimerisatie-activiteit, die als een extra band verschijnt in de SDS-PAGE-resultaten van de MBP pulldown-assay. Een ander voorbeeld van het gebruik van de methode om alternatieve complexe formatie te bestuderen, wordt hier getoond.In de co-expressietest had 6xHistidine-tagged ENY2 interactie met zowel GST-tagged Sgf11 als MBP-CTCF, maar er was geen GST-Sgf11 aanwezig in de MBP-pulldowns en vice versa. Een stapsgewijze vergelijking van de vereiste tijdsintervallen in de workflow van de conventionele pulldown-test in vergelijking met pulldown gekoppeld aan co-expressie wordt hier getoond. De resultaten van het gebruik van beide technieken om dezelfde interactie tussen het BTB-domein van het CP190-eiwit en het GST-gelabelde C-terminale domein van Drosophila CTCF-eiwit te bestuderen, worden hier weergegeven.De juiste keuze van affiniteits- en oplosbaarheidstest, Thioredoxine, GST of MBP, is van cruciaal belang voor de efficiënte uitvoering van de test. Een andere cruciale stap is snelle en uniforme celverstoring. Het wordt ten zeerste aanbevolen om multi-tip sonicator-sondes te gebruiken.Deze methode maakt de directe studie mogelijk van de heterodimeervorming tussen eiwitdomeinen die anders homodimeren vormen die niet zouden loskoppelen tijdens de incubatie van gezuiverde eiwitten in conventionele pulldown-assay.

pulldown-assay-coupled-with-co-expression-bacteria-cells-as-time

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

In this video, we demonstrate the amplified luminescent proximity homogeneous assay—a bead-based proximity assay. It utilizes homogeneously-sized acceptor and donor beads, immobilized with two proteins that tend to interact to screen potential small molecules inhibiting protein interactions.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: A Bead-Based Proximity Assay to Screen Small Molecules Inhibiting Protein-Protein Interactions

This video demonstrates tandem affinity purification — a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Dit artikel illustreert het gebruik van puls-chase radio-labeling in combinatie met plaatsspecifiek fotocrosslinking om interacties te monitoren tussen een eiwit van belang en andere factoren in E. coli. In tegenstelling tot traditionele chemische cross-linking methoden, genereert deze aanpak hoge resolutie “momentopnamen” van een geordende assemblageroute in een levende cel.

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.

Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

SILAC immunoprecipitatie experimenten vormen een krachtig middel voor het ontdekken van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, waar interacties gemakkelijk kan worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen en lage affiniteit interacties bewaard door het gebruik van minder stringente buffer omstandigheden.

Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Eiwitten interageren met elkaar en deze interacties bepalen voor een groot deel hun functies. Eiwitinteractiepartners kunnen op grote schaal in vivo worden geïdentificeerd met behulp van een gistfitnesstest op basis van de dihydrofolaatreducase-eiwitfragmentcomplementatietest (DHFR-PCA).

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

Eiwit co-expressie is een krachtige alternatief voor de reconstitutie in vitro van eiwitcomplexen, en helpt bij het uitvoeren van biochemische en genetische tests in vivo. Hier rapporteren we over het gebruik van eiwit co-expressie in Escherichia coli om eiwitcomplexen te verkrijgen en om de mutatiefrequentie van cellen af te stemmen.

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Leer een tijdefficiënte pulldown-methode met co-expressie in Escherichia coli voor het bestuderen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties en heterodimeervorming.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties (Video) | JoVE Journal

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Meer video's verkennen