Name: Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Leer hoe je met CRISPR/Cas9 en rAAV heterozygote gain-of-function mutaties modelleert in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen. Deze methode maakt nauwkeurig onderzoek naar leukemische transformatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van het Austrian Science Fund (FWF; nummer P32783 en I5021) aan A.R. Aanvullende financiering aan A.R. wordt ook verstrekt door de Oostenrijkse Vereniging voor Interne Geneeskunde (Joseph Skoda Fellowship), de Oostenrijkse Vereniging voor Hematologie en Oncologie (OeGHO; Clinical Research Grant) en MEFOgraz. T.K. is een Special Fellow van de Leukemia &Lymphoma Society.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De efficiënte en nauwkeurige genetische manipulatie van menselijke primaire HSPC's biedt een geweldige kans om de processen te onderzoeken en te begrijpen die de normale hematopoëse beïnvloeden, en vooral de leukemische transformatie van hematopoëtische cellen.
In dit protocol werd een efficiënte strategie beschreven om menselijke HSPC's te engineeren om terugkerende heterozygote GOF-mutaties tot expressie te brengen. Deze procedure maakte gebruik van CRISPR/Cas9-technologie en rAAV6-vectoren als donoren voor DNA-sjablonen om nauwkeurig WT- en mutante DNA-sequenties in hun endogene genloci in te voegen. Het koppelen van de gemanipuleerde cDA's (WT en mutant) met gescheiden fluorescerende reportereiwitten maakt de verrijking en tracking van cellen met een definitieve heterozygote toestand mogelijk.
Deze strategie biedt verschillende voordelen ten opzichte van de veelgebruikte lentivirale (LV)-gebaseerde methoden. Een groot voordeel is dat het crispr/cas9-gebaseerde systeem een nauwkeurige bewerking in de endogene loci mogelijk maakt, wat resulteert in het behoud van de endogene promotors en regulerende elementen. Dit leidt tot homogeniteit in de expressie van het bewerkte gen in de cellen, een doel dat nauwelijks haalbaar is wanneer een LV-gebaseerde methode wordt gebruikt. Genoverdracht met LV-vectoren leidt tot semi-willekeurige integratie van het gen met voorkeur voor transcriptioneel actieve sites34. Dit kan zich vertalen in overexpressie van het overgedragen gen en heterogeniteit tussen de bewerkte cellen, wat uiteindelijk resulteert in moeilijkheden om de rol van mutaties en geninteracties te onderzoeken en te analyseren. Een tweede voordeel is dat het beschreven systeem, omdat het een sitespecifiek bewerkingssysteem is, de risico's van insertionele mutageneseelimineert 35.
De dual fluorescent reporter-strategie maakt de nauwkeurige verrijking en tracking mogelijk van cellen die met succes op beide allelen zijn bewerkt, waarbij één allel het WT-cDNA integreert en het andere allel de gemuteerde cDNA-sequenties integreert. Cellen die slechts één reporter uitdrukken, vertegenwoordigen alleen monoallelische integratie of biallelische integratie van HDR-sjablonen met dezelfde fluorescerende reporter. Beide scenario's kunnen alleen nauwkeurig worden onderscheiden als van één cel afgeleide klonen worden geproduceerd en individueel worden geanalyseerd. HSPC's hebben echter slechts een beperkte proliferatieve capaciteit in vitro, en wanneer ze gedurende langere tijd in cultuur worden gehouden, beginnen HSPC's zich te onderscheiden in meer volwassen nakomelingen en verliezen ze hun zelfvernieuwings- en transplantatiecapaciteit. Dit maakt het selecteren en uitbreiden van eencellige klonen met de gewenste heterozygote mutatie onhaalbaar. De toepassing van de dual fluorescente eiwitstrategie en verrijking door flowcytometrie voor cellen met de heterozygote mutatie maakt het mogelijk om de problemen te omzeilen die worden veroorzaakt door uitgebreide in vitro kweek.
In dit specifieke voorbeeld werd met succes aangetoond dat HSPC's efficiënt konden worden ontworpen en gesorteerd om zuivere populaties van HSPC's te verkrijgen die de heterozygote CALRDEL/WT-mutatie dragen.
Dit systeem is echter niet beperkt tot het engineeren van heterozygote frameshift-mutaties, maar kan ook gemakkelijk worden toegepast om andere mutatietypen te creëren, waaronder missense- en onzinmutaties. Door verschillende combinaties van AAV's met WT of gemuteerde sequenties met verschillende fluorescerende reportereiwitten toe te passen, kan dit systeem ook worden gebruikt voor de introductie van homozygote mutaties (gelijktijdige transductie met twee rAAVs die beide mutant cDNA dragen maar verschillende fluorescerende reporters) of zelfs de correctie van mutaties (gelijktijdige transductie met twee AAV's die beide WT cDNA dragen, maar verschillende fluorescerende reporters). Daarnaast is het belangrijk om te vermelden dat deze strategie niet beperkt is tot de introductie van oncogene GOF-mutaties. In feite kan het beschreven protocol worden gebruikt voor meerdere alternatieve strategieën, waaronder gen knock-out, genvervanging36,37, gerichte knock-in van transgenen (d.w.z. chimere antigeenreceptoren)38, en zelfs voor de correctie van ziekteveroorzakende mutaties11,39.
De strategie om CRISPR/Cas9 en AAV6 te combineren met meerdere fluorescerende melders is ook toepasbaar gebleken in vele andere celtypen, waaronder T-cellen, plasmacytoïde dendritische cellen, geïnduceerde pluripotente stamcellen, neuronale stamcellen en luchtwegstamcellen 24,38,40,41,42,43,44 . Deze strategie kan worden geïmplementeerd voor de productie van superieure chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen. Onlangs werd bijvoorbeeld gepubliceerd dat CRISPR / Cas9-gemedieerde knock-out van het TGFBR2-gen in CAR T-cellen hun functie in de onderdrukkende TGF-β rijke tumormicro-omgeving aanzienlijk verhoogt45. Een dergelijke aanpak zou een eenstapsprotocol kunnen bieden om zowel de T-cellen te engineeren om de CAR tot expressie te brengen als om het TGFBR2-gen uit te schakelen door de CAR specifiek in beide allelen van het TGFBR2-gen in te brengen. Bovendien zou deze aanpak ook nuttig kunnen zijn om universele CAR T-cellen te genereren door de CAR te integreren in het T-celreceptor alfaconstante (TRAC) gen46,47.
Om de reproduceerbaarheid te vergroten en een efficiënte bewerking van de cellen te garanderen, moeten enkele belangrijke overwegingen worden overwogen. De belangrijkste kritieke punten voor een succesvolle bewerking van de cellen liggen in (i) de selectie van het sgRNA, (ii) het ontwerp van de HDR-sjabloon en (iii) de rAAV6-productie.
De selectie van een goed presterend sgRNA is cruciaal omdat het het maximale aantal allelen bepaalt waarin de HDR-sjabloon kan worden geïntegreerd. Door de vele software die nu beschikbaar is, is de zoektocht naar kandidaat-sgRNA's vereenvoudigd. Door de regio van belang te selecteren, kan de software een reeks sgRNA's voorstellen met een on-target score en een off-target score die de kansen voor bewerking op respectievelijk de gewenste locus en ongewenste loci aangeven. Deze scores worden berekend op basis van eerder gepubliceerde scoringsmodellen48,49. Hoewel dit een goed uitgangspunt is voor het selecteren van een goed presterend sgRNA, moet de prestatie van het sgRNA worden bevestigd, omdat de voorspelde prestaties in silico niet altijd overeenkomen met een efficiënt sgRNA in vitro. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om ten minste drie sgRNA's te ontwerpen en uit te testen om de kans op het vinden van het beste sgRNA te vergroten. Zodra een echt goed presterend sgRNA is geïdentificeerd, wordt voorgesteld om door te gaan met het ontwerp van de HDR-sjabloon.
Voorzorgsmaatregelen moeten in overweging worden genomen bij het ontwerpen van de HDR-sjabloon. De linker- en rechter homologiearmen (respectievelijk LHA en RHA) moeten elk respectievelijk 400 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van de sgRNA-cut-site beslaan, omdat kortere HAs kunnen resulteren in verminderde HDR-frequenties. De grootte van de cDNA die via HDR kan worden geïntroduceerd, is afhankelijk van de verpakkingsmogelijkheden van AAV's, die ongeveer 4,7 kb is. Vanwege de vele elementen die verplicht zijn binnen de HDR-sjabloon (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor en fluorescerende reportersequentie), is de resterende ruimte voor de gemuteerde of WT cDNA beperkt. Dit is onproblematisch als de gewenste mutatie zich in de buurt van het 3'-uiteinde van een gen bevindt of in genen met een algehele korte CDS. In gevallen waarin de mutatie zich echter in de buurt van de transcriptionele startzijde (TSS) van de genen bevindt met een lang CDS (dat de resterende verpakkingsruimte van de AAV overschrijdt), is deze beschreven aanpak mogelijk niet haalbaar. Om dit probleem te omzeilen, is onlangs een strategie ontwikkeld die afhankelijk is van het splitsen van de HDR-sjabloon in twee AAV's door Bak en collega's. Deze strategie is gebaseerd op twee afzonderlijke HDR-gemedieerde integraties om de uiteindelijke naadloze integratie van een groot gen50 te verkrijgen.
De kwaliteit van het virus en zijn titer zijn bijkomende factoren die de succesvolle genoomtechnologie van de cellen kunnen maken of breken. Voor een optimale opbrengst is het belangrijk om de HEK293T niet volledig te laten samenvloeien terwijl hij in cultuur wordt gehouden. Idealiter zouden de HEK293T-cellen moeten worden gesplitst wanneer 70% -80% samenvloeiing is bereikt. Bovendien mag de HEK293T niet voor lange tijd worden gekweekt, omdat dit hun vermogen om virus te produceren kan verminderen. Nieuwe HEK293T-cellen moeten na 20 passages worden ontdooid. Het verkrijgen van hoge virustiters is belangrijk voor het verhogen van de efficiëntie en reproduceerbaarheid van de experimenten. Lage virale titers vertalen zich in grote hoeveelheden rAAV-oplossing die nodig zijn voor de transductie van de HSPC's. Als algemene regel geldt dat de rAAV-oplossing die aan de nucleofecteerde cellen wordt toegevoegd, niet meer dan 20% van het totale volume van het HSPC-retentiemedium mag bedragen. Hogere volumes AAV-oplossing kunnen leiden tot verhoogde celdood, lagere proliferatie en verminderde transductie-efficiëntie. In het geval van lage virustiters is het daarom aan te raden om het virus verder te concentreren.
Samenvattend biedt dit protocol een reproduceerbare aanpak om menselijke HSPC's nauwkeurig en efficiënt te manipuleren door het gelijktijdige gebruik van CRIPSR / Cas9- en rAAV6-donorsjablonen met extra dubbele fluorescerende melders. Deze aanpak is een geweldig hulpmiddel gebleken bij het bestuderen van normale hematopoëtische stamcelbiologie en de bijdragen die mutaties leveren aan leukemogenese.

Met de ontwikkeling van de geclusterde regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-technologie is een nieuw en uiterst krachtig instrument toegevoegd aan de toolkit van wetenschappers. Deze technologie maakt de nauwkeurige engineering van het genoom mogelijk en heeft bewezen uiterst nuttig te zijn, niet alleen voor onderzoeksdoeleinden (herzien in Hsu et al.1), maar is meer recentelijk ook met succes vertaald naar de klinische setting 2,3,4. CRISPR/Cas9-bewerkingsstrategieën zijn gebaseerd op de activiteit van een Cas9-eiwit en een single-guide RNA (sgRNA)5,6,7. In de gastheercel wordt het Cas9-eiwit naar een specifieke plaats in het DNA geleid die complementair is aan de sgRNA-sequentie en een DNA-dubbelstrengsbreuk (DSB) introduceert. Zodra een DSB is gegenereerd, zijn er twee belangrijke en concurrerende reparatiemechanismen die kunnen optreden: niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologie-gerichte reparatie (HDR). NHEJ is een foutgevoelig, voornamelijk gebruikt reparatiemechanisme dat leidt tot inserties en deleties (indels), terwijl HDR, door de zusterchromatide als reparatiesjabloon te gebruiken, zeer nauwkeurig is, maar beperkt tot de S- of G2-fase van de celcyclus8. In genome engineering kan HDR worden gebruikt voor de gerichte modificatie van DNA door een donorsjabloon te bieden die wordt geflankeerd door homologiearmen die identiek zijn aan beide DNA-uiteinden van de Cas9-geïnduceerde DSB (figuur 1). Het type donorsjabloon dat voor HDR wordt gebruikt, kan de bewerkingsefficiëntie sterk beïnvloeden. Voor genetische manipulatie in menselijke HSPC's is onlangs beschreven dat adeno-geassocieerd virus serotype 6 (AAV6) een uitstekend voertuig is voor de levering van enkelstrengs DNA-sjablonen 9,10.
CRISPR/Cas9 genome engineering kan therapeutisch worden gebruikt om schadelijke mutaties te corrigeren11, maar kan ook worden gebruikt om pathogene mutaties in het DNA te introduceren om de ontwikkeling van kanker te modelleren12. Bloedkanker, zoals leukemie, ontwikkelt zich via de sequentiële verwerving van somatische mutaties in gezonde HSPC's13,14. Vroege genetische gebeurtenissen leiden tot een klonaal proliferatief voordeel, resulterend in klonale hematopoëse van onbepaald potentieel (CHIP)15,16. Verdere verwerving van mutaties zal uiteindelijk leiden tot leukemische transformatie en de ontwikkeling van de ziekte. Somatische mutaties kunnen worden gevonden in genen die zelfvernieuwing, overleving, proliferatie en differentiatie regelen17.
Het introduceren van individuele mutaties via genome engineering in gezonde HSPC's maakt het mogelijk om dit stapsgewijze leukemogene proces nauwkeurig te modelleren. Het beperkte aantal terugkerende mutaties in myeloïde neoplasmata zoals acute myeloïde leukemie (AML)18,19 maakt deze ziekte bijzonder vatbaar voor een samenvatting met behulp van genoomtechnologietools.
Somatische mutaties kunnen op slechts één allel (monoallelische/heterozygote mutaties) of op beide allelen (biallelische/homozygote mutaties) ontstaan en kunnen diepgaande effecten hebben op de functie van het gen, wat een functieverlies (LOF) of een gain-of-function (GOF) kan veroorzaken. LOF-mutaties leiden tot een verminderde (als één allel wordt aangetast) of volledige (als beide allelen zijn aangetast) LOF van het gen, terwijl GOF-mutaties leiden tot een verhoogde activering of nieuwe functie van het gen. GOF-mutaties zijn meestal heterozygoot20.
Belangrijk is dat de zygositeit (hetero- versus homozygoot) grote implicaties heeft voor de poging om een mutatie getrouw te modelleren; daarom is de gerichte manipulatie van slechts één allel van een gen nodig om heterozygote hotspot GOF-mutaties te ontwikkelen. Foutgevoelige NHEJ leidt tot indels van verschillende lengtes21 die kunnen leiden tot verschillende, onvoorspelbare biologische gevolgen. Aangezien NHEJ echter het overheersende reparatieprogramma is dat door cellen wordt gebruikt na de introductie van een DSB, laten de meeste CRISPR / Cas9-platforms die momenteel worden gebruikt om HSPC's te manipuleren, het niet toe om de genetische uitkomst nauwkeurig te voorspellen22,23. Daarentegen maakt de introductie van een CRISPR/Cas9-gemedieerde dubbelstrengsbreuk (DSB's), gecombineerd met het gebruik van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) vectorgebaseerde DNA-donorsjablonen voor genoomtechnologie via HDR, de allelspecifieke insertie van mutaties in menselijke HSPC's11,24 mogelijk. De gelijktijdige integratie van een mutant en een wild-type (WT) sequentie in combinatie met verschillende fluorescerende reporters op de individuele allelen kan worden uitgevoerd om te selecteren op een heterozygoot genotype (figuur 2). Deze strategie kan worden gebruikt als een krachtig hulpmiddel om de effecten van terugkerende, leukemische, heterozygote GOF-hotspotmutaties op de HSPC-functie, ziekte-initiatie en progressie nauwkeurig te karakteriseren.
In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor de efficiënte engineering van recidiverende heterozygote GOF-mutaties in primaire menselijke HSPC's. Deze strategie combineert het gebruik van CRISPR/Cas9 en een dubbele AAV6-transductie om WT- en mutant DNA-donorsjablonen te bieden voor de prospectieve generatie van de heterozygote GOF-mutatie. Als voorbeeld zal engineering van de recidiverende type 1 mutaties (52 bp deletie) in het calreticuline (CALR) gen worden getoond25. De heterozygote GOF-mutatie in exon 9 van CALR wordt herhaaldelijk aangetroffen bij myeloproliferatieve aandoeningen zoals essentiële trombocytemie (ET) en primaire myelofibrose (PMF)26. CALR is een endoplasmatisch reticulum resident eiwit dat voornamelijk een kwaliteitscontrolefunctie heeft in het vouwproces van nieuw gesynthetiseerde eiwitten. De structuur kan worden onderverdeeld in drie hoofddomeinen: een amino (N)-terminal domein en een proline-rijk P-domein, die betrokken zijn bij de chaperonnefunctie van het eiwit, en een C-domein, dat betrokken is bij calciumopslag en regulatie27,28. CALR-mutaties veroorzaken een +1 frameshift, wat leidt tot de transcriptie van een nieuw verlengd C-terminal uiteinde en het verlies van het endoplasmatisch reticulum (ER)-retentiesignaal (KDEL). Van mutant CALR is aangetoond dat het de trombopoietinereceptor bindt, wat leidt tot TPO-onafhankelijke signalering met verhoogde proliferatie29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig01v2.jpg"> Figuur 1: NHEJ- en HDR-reparatie. Vereenvoudigde schematische weergave van NHEJ- en HDR-reparatiemechanismen na de introductie van een dubbelstrengsbreuk in het DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig02.jpg"> Figuur 2: Schematisch overzicht van biallelische HDR-bewerkingsstrategie. Schematische weergave van de integratie van de donorsjablonen in de beoogde allelen, gevolgd door hun vertaling in functionerende mRNA's. De oranje gestippelde vakken geven de gebieden aan die overeenkomen met de linker homologiearm (LHA) en de rechter homologiearm (RHA). De ideale grootte van de HAs is 400 bp elk. Het groene vak met stippen vertegenwoordigt het gebied dat overeenkomt met de SA-reeks. De omvang van de SA is 150 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 25 mm dishes</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>293T</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td>https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635</td></tr><tr><td>4D Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td>-</td><td>Voor nucleofectie van humane HSPC's gebruikt u het DZ-100 programma.</td></tr><tr><td>4D Nucleofector X Unit</td><td>Lonza</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro Purification Kit</td><td>Takara</td><td>6666</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Benchling sgRNA design tool</td><td></td><td></td><td>Online tool voor sgRNA ontwerp: http://www.benchling.com/crispr</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Chemisch gemodificeerde synthetische sgRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Volg de reeks voor de sgRNA die intron 7 van CALR target: 5&rsquo;-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3&rsquo;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Een 80 nucleotide SpCas9 scaffold wordt toegevoegd aan de 20 nucleotide RNA reeks om de sgRNA te voltooien. Chemische modificaties van 2'-O-Methyl worden toegevoegd aan de eerste en laatste 3 basen en 3' fosforothioaatbindingen worden toegevoegd in de eerste 3 en laatste 2 basen.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; *Alternatief kunnen chemisch gemodificeerde synthetische sgRNA's worden verkregen van IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) en Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)</td></tr><tr><td>CHOPCHOP sgRNA design tool</td><td></td><td></td><td>Online tool voor sgRNA ontwerp: http://chopchop.cbu.uib.no</td></tr><tr><td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>CRISPick sgRNA design tool</td><td></td><td></td><td>Online tool voor sgRNA ontwerp: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public</td></tr><tr><td>CRISPOR sgRNA design tool</td><td></td><td></td><td>Online tool voor sgRNA ontwerp: http://crispor.tefor.net</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Droplet Generation Oil for Probes</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml</td><td>Pan Biotech</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.0</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>GenAgarose L.E.</td><td>Inno-train</td><td>GX04090</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0321</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc. (NEB)</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ICE</td><td>Synthego</td><td></td><td>https://ice.synthego.com</td></tr><tr><td>IDT codon optimization tool</td><td>IDT</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool</td></tr><tr><td>IDT sgRNA design tool</td><td></td><td></td><td>Online tool voor sgRNA ontwerp: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7658-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Midori Green Advance</td><td>Nippon Genetics</td><td>MG04</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water, 5X100 ml</td><td>Ambion</td><td>AM9939</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor&nbsp; X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>De Lonza Primary P3 oplossing wordt geleverd als een 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution en 0.5 mL Supplement 1. Om te reconstitueren, voegt u het Supplement 1 toe aan de P3 Primary Cell Nucleofector Solution en mengt u het.</td></tr><tr><td>pAAV-MCS2</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>pDGM6</td><td>Addgene</td><td>110660</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Voeg 50 mL van PBS 4.5 pH (gemaakt met HCl) toe aan 50 mg van PEI in een buis

engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Gedurende hun hele leven verwerven hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) somatische mutaties. Sommige van deze mutaties veranderen de functionele eigenschappen van HSPC, zoals proliferatie en differentiatie, waardoor de ontwikkeling van hematologische maligniteiten wordt bevorderd. Efficiënte en nauwkeurige genetische manipulatie van HSPC's is nodig om de functionele gevolgen van terugkerende somatische mutaties te modelleren, te karakteriseren en beter te begrijpen. Mutaties kunnen een schadelijk effect hebben op een gen en resulteren in functieverlies (LOF) of, in schril contrast, kunnen de functie verbeteren of zelfs leiden tot nieuwe kenmerken van een bepaald gen, genaamd gain-of-function (GOF). In tegenstelling tot LOF-mutaties komen GOF-mutaties bijna uitsluitend heterozygoot voor. De huidige protocollen voor genoombewerking laten de selectieve targeting van individuele allelen niet toe, waardoor het vermogen om heterozygote GOF-mutaties te modelleren wordt belemmerd. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over het engineeren van heterozygote GOF-hotspotmutaties in menselijke HSPC's door CRISPR / Cas9-gemedieerde homologie-gerichte reparatie en recombinante AAV6-technologie te combineren voor efficiënte dna-donorsjabloonoverdracht. Belangrijk is dat deze strategie gebruik maakt van een dubbel fluorescerend reportersysteem om het volgen en zuiveren van succesvol heterozygote HSPC's mogelijk te maken. Deze strategie kan worden gebruikt om nauwkeurig te onderzoeken hoe GOF-mutaties de HSPC-functie beïnvloeden en hun progressie naar hematologische maligniteiten.

Door toepassing van het hierboven beschreven protocol werden heterozygote type 1 CALR-mutaties reproduceerbaar geïntroduceerd in van navelstrengbloed afgeleide HSPC's. Deze mutatie bestaat uit een 52 bp deletie in exon 9 (het laatste exon van CALR), wat resulteert in een +1 frameshift, wat leidt tot de vertaling van een nieuw positief geladen C-terminal domein26,33. Om de CALR-mutatie bij de endogene genlocus te introduceren, werd een intronische targetingstrategie vóór exon 9 gevolgd, omdat dit ongewenste veranderingen in de coderingssequentie zou omzeilen in gevallen waarin de cas9-geïnduceerde DSB niet via het HDR-mechanisme werd gerepareerd. In dit specifieke geval werd een sgRNA voor intron 7 ontworpen vanwege de beschikbaarheid van hoge on-target en lage off-target sequenties in combinatie met gunstige homologiearmen (gebrek aan sequentieherhalingen; Figuur 5A).
Twee donorsjablonen werden vervolgens ontworpen en verpakt in AAV6-vectoren. Om correcte splicing van de endogene exonen naar het geïntegreerde cDNA mogelijk te maken, bevatten de donorsjablonen (i) een SA-sequentie inclusief de 3'-splice-site, het vertakkingspunt en het polypyrimidinekanaal, (ii) de codon-geoptimaliseerde cDNA-sequentie van exonen 8-9, hetzij met de WT (CALRWT) of de gemuteerde sequentie (CALRDEL ) met inbegrip van een stopcodon, iii) een simianvirus 40 (SV40) polyA-signaal, iv) een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit onder controle van de afzonderlijke interne promotor, de miltfocusvormende viruspromotor (SFFV), gevolgd door v) een boviene groeihormoon (bGH) polyA-signaal. Het donorsjabloon met de CALRWT cDNA is ontworpen om een GFP-cassette te bevatten, terwijl het donorsjabloon met de CALRDEL cDNA-sequentie is ontworpen om een BFP-cassette te bevatten. Het hele bouwwerk werd geflankeerd door een links en rechts HA (figuur 5A).
Twee dagen na transfectie met het RNP-complex en transductie met de rAAV6-virussen werden de cellen geanalyseerd met flowcytometrie. Er konden vier hoofdpopulaties worden gedetecteerd: (i) cellen die noch de GFP noch de BFP tot expressie brengen, die cellen vertegenwoordigen zonder hdr-gebaseerde genoombewerking, (ii) cellen die alleen positief zijn voor GFP, die cellen vertegenwoordigen die alleen het WT-construct hadden geïntegreerd, (iii) cellen die alleen positief zijn voor BFP, die cellen vertegenwoordigen die alleen het gemuteerde construct hadden geïntegreerd, en (iv) GFP- en BFP-dubbelpositieve cellen, de cellen vertegenwoordigen die zowel de WT- als de gemuteerde sequenties hadden geïntegreerd (figuur 5B). Om zuivere populaties van HSPC's met de heterozygote type 1 CALR-mutatie te verkrijgen, werden de dubbelpositieve cellen gesorteerd door flowcytometrie. HSPC's waarin twee WT-sequenties werden ingeklopt, werden gebruikt als controlecellen (GFP+ mCherry+; Figuur 5B). Een geldig alternatief om te gebruiken als controlecellen zou HSPC's zijn met een biallelische integratie van de fluorescerende eiwitten in een veilige haven locus (d.w.z. AAVS1; niet getoond). Celtelling door trypanblauwe uitsluiting uitgevoerd op de gesorteerde HSPC's gaf aan dat meer dan 90% van de cellen levensvatbaar was.
Naadloze on-target integratie van de constructen werd bevestigd door de toepassing van de in-out PCR-strategie (figuur 6A). In dit specifieke geval voerden we twee afzonderlijke in-out PCR's uit, één voor de knocked-in CALRWT-sequentie (lane 1 van de gel-elektroforese in figuur 6A) en één voor de knocked-in CALRDEL-sequentie (lane 2 van de gel-elektroforese van figuur 6A). Sanger-sequencing uitgevoerd op het DNA geëxtraheerd uit de gelbanden bevestigde de juiste insertie van de WT en gemuteerde sequenties in de CALRDEL / WT HSPCs (figuur 6B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig05.jpg"> Figuur 5: Generatie van HSPC's met de heterozygote CALR-mutatie. (A) Representatief schema dat de bewerkingsstrategie weergeeft voor het inbrengen van de heterozygote CALR-mutatie . Het RNP-complex richt zich op het intron tussen exon 7 en exon 8 van het CALR-gen . Twee AAV's, een met de gemuteerde exonen 8-9 en een BFP en de andere met de WT-exonen 8-9 en een GFP, zullen dienen als donorreparatiesjablonen en zullen de integratie van de gemuteerde sequentie in één allel en de integratie van de WT-sequentie in het resterende allel bevorderen. (B) Representatieve flowcytometrieplots die de expressie van GFP en BFP of GFP weergeven en mCherry 48 h na de transfectie en transductie van HSPC's. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig06.jpg"> Figuur 6: Validatie van succesvolle heterozygote CALR-mutatie in HSPC's. (A) Gel-elektroforese van de producten van de in-out PCR uitgevoerd op genomisch DNA geëxtraheerd uit AAV-controles, CALRWT / WT en CALRDEL / WT. Er werd gebruik gemaakt van een DNA-ladder van 100 bp. Afkorting: NTC = non-template control. (B) Sanger-sequencingresultaten verkregen van de in-out PCR's uitgevoerd op CALRDEL/WT die een succesvolle integratie van de WT en gemuteerde sequenties bevestigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Nieuwe strategieën om somatische mutaties in hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) getrouw te modelleren, zijn nodig om de hematopoëtische stamcelbiologie en hematologische maligniteiten beter te bestuderen. Hier wordt een protocol beschreven om heterozygote gain-of-function mutaties in HSPC's te modelleren door het gebruik van CRISPR/Cas9 en dual rAAV donortransductie te combineren.

Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Deze methode maakt het mogelijk om terugkerende leukemogene gain-of-function mutaties in primaire menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen nauwkeurig te modelleren en daarbij de rol in leukemische transformatie te onderzoeken. Het grote voordeel van deze techniek is dat de crispr-cas9-gebaseerde mutatie engineering wordt gecombineerd met de introductie van een fluorescerende reporter. Dit maakt op unieke wijze de identificatie, verrijking en tracking van zuivere heterozygot-gemuteerde celpopulaties mogelijk.De procedure wordt gedemonstreerd door Tommaso Sconocchia, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium. Ontwerp om te beginnen het single guide RNA met behulp van de online Benchling-ontwerptool door de plus-creatieoptie te selecteren. Klik vervolgens op DNA-sequentie"gevolgd door DNA-sequenties importeren" en importeren uit databases"optie.Voer vervolgens het gewenste gen in en selecteer de mens als de soort. Klik op de zoekoptie en selecteer de juiste transcriptimport. Selecteer de regio van belang waarin u de dubbelstrengsbreuk wilt introduceren.Selecteer vervolgens de CRISPR-optie aan de rechterkant van het scherm, gevolgd door ontwerp- en analysehandleidingen. Selecteer vervolgens enkele gids", terwijl de lengte van de gids op 20 basisparen en PAM-volgorde blijft voor bewerking met SP-Cas9. Kies een gids met een hoge on-target score en een hoge off-target score en bestel het single guide RNA als een chemisch gemodificeerd synthetisch single guide RNA bij een commerciële leverancier.Om de HDR-sjabloon te ontwerpen, importeert u de genomische sequentie en de coderingsvolgorde in software voor moleculair klonen. Ontwerp vanuit het genomische sequentiebestand de linker homologiearm door idealiter 400 basenparen te selecteren op het vijf priemeinde van de dubbele strengen en plak deze reeks in een nieuw bestand. Ontwerp vanuit het genomische sequentiebestand de splice acceptor-sequentie door de laatste 150 basenparen van het beoogde intron te selecteren en deze na de linker homologiearm te plakken.Selecteer in het coderingsvolgordebestand het cDNA van belang. Codon optimaliseert de cDNA en plaatst deze na de splice acceptor-sequentie. Na het cDNA van belang, plaats een drie priem polyadenylation signaal volgens een promotor sequentie voor het fluorescerende eiwit.Plaats vervolgens de volgorde voor het fluorescerende eiwit en een tweede, maar ander polyadenylation-signaal. Ontwerp uit het genomische sequentiebestand de juiste homologiearm door idealiter 400 basenparen te selecteren op het drie priemeinde van de dubbele strengenbreuken en de reeks in te voegen na de tweede polyaminatie. Maak vervolgens een kopie van de hele sjabloon en wijzig het cDNA van belang zodat het de volgorde van de gewenste mutatie bevat.Wissel het fluorescerende eiwit uit met een ander fluorescerend eiwit. Construeer en kloon de HDR-sjablonen in de AAV-expressievector. Bereid voor recombinante AAV6-bereiding 10 gerechten van 150 millimeter met elk 11 miljoen HECK293T in 20 milliliter DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline streptomycine en 25 millimolaire HEPES.Plaats vervolgens de gerechten in de incubator op 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, gedurende 24 uur. Nadat u het oude medium zorgvuldig hebt weggegooid, vervangt u het door 20 milliliter antibioticavrije DMEM aangevuld met 10% FBS, 25 millimol HEPES en één millimolair natriumbutyraat. Bereid vervolgens twee buizen van 15 milliliter met het label buizen één en twee.Voeg aan buis één vijf milliliter gereduceerd serummedium, 60 microgram recombinant AAV6-gemuteerd HDR-plasmide en 220 microgram PDGM6-helperplasmide toe. Voeg aan buis twee vijf milliliter gereduceerd serummedium en 1120 microliter polyethyleenamineoplossing van één milligram per milliliter polyethyleenamine toe. Na het toevoegen van de inhoud van buis twee aan buis één, vortex gedurende 30 seconden en vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.Voeg voorzichtig druppelgewijs 1,1 milliliter van de oplossing toe aan elk gerecht en verdeel door voorzichtig te draaien. Zet de gerechten in de couveuse op 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, gedurende 48 uur. Voeg vervolgens 250 microliter 0,5 molaire EDTA toe aan elk gerecht en plaats ze gedurende 10 minuten in de incubator.Oogst de cellen door ze van de schaal te wassen en over te brengen naar een centrifugebuis van 500 milliliter. Centrifugeer bij 2000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Maak de pellet los door vortexing en extraheer het virus met behulp van een AAV-zuiveringskit.Bewaar het na het aanhalen van het gezuiverde virus bij min 80 graden Celsius. Na het ontdooien van CD34-positieve hematopoëtische stam- en voorlopercellen, breng de cellen over in 10 milliliter voorverwarmd RPMI aangevuld met 1% penicilline streptomycine. Centrifugeer bij 350 G bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Suspensie de cellen in hematopoietische stam en voorlopercelretentiemedium tot een concentratie van 250.000 cellen per milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 72 uur. Oogst vervolgens de cellen in een buis van 15 milliliter. Tel en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-uitsluiting.Om het ribocucleoproteïnecomplex te bereiden, voegt u 15 microgram Cas9 en acht microgram single guide RNA toe in een buis van 1,5 milliliter en incubeert u bij 25 graden Celsius gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok. Terwijl het ribonucleoproteïnecomplex broedt, centrifugeer je de cellen gedurende vijf minuten op 350 G en gooi je het supernatant weg. Nadat de cellen in 100 microliter nucleofectieoplossing zijn gesuspendeerd, mengt u de cellen met het ribonucleoproteïnecomplex en brengt u ze over in het cuvet.Nadat u zachtjes op de cuvette hebt getikt om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen, plaatst u de cuvette in de houder van het transfectiesysteem en elektropomeert u de cellen. Voeg onmiddellijk na elektroporatie 400 microliter voorverwarmde hematopoietische stam en voorlopercellen celretentiemedium toe zonder penicilline streptomycine en breng de cellen over met een fijne transferpipet in een kweekplaat met voorverwarmde hematopoietische stam en voorlopercelretentiemedium zonder penicilline streptomycine. Breng vervolgens de plaat over naar de incubator.Ontdooi de injectieflacons met de bevroren recombinante AAV's op ijs en transduceer de cellen door de optimale hoeveelheid van elke recombinante AAV6 naar de celsuspensie te pipetteren. Nadat u de celsuspensie voorzichtig met de pipet hebt gemengd, incubeert u de getransduceerde cellen gedurende zes tot acht uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verzamel na zes tot acht uur de cellen in een buis en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 350 G bij kamertemperatuur.Gooi het supernatant weg en vervang het door verse voorverwarmde hematopoëtische stam en voorlopercelretentiemedium aangevuld met penicilline streptomycine en breng de cellen over naar een celkweekplaat. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Om de gemanipuleerde cellen met de heterozygote gain-of-function mutatie te sorteren, oogst u de cellen in een buis van 15 milliliter en centrifugeert u bij 350 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, zoals eerder aangetoond.Verwijder het supernatant en suspensie de cellen in één milliliter DPBS met 0,1% PSA en centrifugeer opnieuw bij 350 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, suspensie u de cellen in een geschikt volume DPBS plus 0,1% BSA, afhankelijk van het celnummer zoals eerder aangetoond. Breng de cellen over naar een steriele faxbuis uitgerust met een dop en voeg zeven AAD of andere levensvatbaarheidskleurstof toe aan de celsuspensie voor uitsluiting van levende / dode cellen.Sorteer de levende cellen die dubbel positief zijn voor de fluorescerende reportereiwitten in een verzamelbuis met 200 microliter hematopoietische stam en voorlopercelretentiemedium. Na het centrifugeren van de gesorteerde cellen bij 350 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, zoals eerder aangetoond, tot een concentratie van 250.000 cellen per milliliter voor verdere uitbreiding in cultuur of gebruik de cellen direct voor functionele testen. Twee dagen na transvectie met het ribonucleoproteïnecomplex en transductie met de recombinante AAV6-virussen werden de cellen geanalyseerd met flowcytometrie.Vier hoofdpopulaties werden gedetecteerd, waaronder cellen zonder HDR-gebaseerde genoombewerking die noch de GFP- noch de BFP-cellen tot expressie brachten die alleen positief waren voor GFP met alleen het wildtype-construct geïntegreerd, cellen die alleen positief waren voor BFP met alleen het gemuteerde construct geïntegreerd, en GFP en BFP dubbele positieve cellen met zowel het wilde type als gemuteerde sequenties geïntegreerd. Om de succesvolle knock-in van de heterozygote calreticuline mutaties in/uit te valideren, werd PCR uitgevoerd op genomisch DNA geëxtraheerd uit cellen die alleen met AAV waren geïncubeerd en uit cellen geïncubeerd met het ribonucleoproteïne en AAV met het ingeslagen calreticuline wildtype en calreticuline-deletiesequentie. Cellen werden gesorteerd op basis van de gelijktijdige expressie van beide fluorescentierapporteurs voorafgaand aan DNA-extractie.Na gel-elektroforese werden individuele banden uit de gel weggesneden en werd DNA geëxtraheerd voor daaropvolgende Sanger-sequencing. De sequencingresultaten bevestigden de succesvolle naadloze integratie van het wilde type en gemuteerde sequenties in de heterozygote calreticulin-gemuteerde hematopoietische stam en voorlopercellen. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om zorgvuldig het best presterende single guide RNA te selecteren, omdat dit de algehele HDR-efficiëntie en dus de frequentie van succesvolle knock-in van heterozygote mutaties zal bepalen.Na deze procedure kunnen de genetisch gemanipuleerde cellen worden gebruikt voor functionele in-vitro en in-vivo experimenten zoals kolonievormende eenheidstests, differentiatietests en transplantatie in immuundeficiënte muizen.

engineering-oncogenic-heterozygous-gain-function-mutations-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Dit protocol biedt stapsgewijze richtlijnen voor het opzetten van competitieve muisbeenmergtransplantatie-experimenten om hematopoëtische stam-/voorlopercellenfunctie te bestuderen zonder voorafgaande zuivering van stamcellen door celsortering.

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Hier worden gedetailleerde protocollen voor het kweken van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn van lymfkliertest myeloïde voorloper, uitvoeren van virale infecties en het uitvoeren van de proliferatie en differentiatie testen gepresenteerd. Deze cellijn is geschikt voor de studie van myeloïde cel ontwikkeling, en de rol van genen van belang in myeloïde celgroei en neutrofiele differentiatie.

Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Hier presenteren we een protocol voor immunophenotypic karakterisering en cytokine geïnduceerde differentiatie van snoer bloed afgeleide CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde lijn. De toepassingen van dit protocol omvatten onderzoeken naar het effect van myeloïde ziekte mutaties of kleine moleculen op myeloïde differentiatie van de CD34+ cellen.

Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Ontwikkeling van Murine modellen met specifieke genen gemuleerd in hoofd-en nekkanker patiënten is nodig voor het begrijpen van neoplasie. Hier presenteren we een protocol voor in vitro transformatie van primaire muriene tong cellen met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem om Murine HNC cellijnen met specifieke genomische veranderingen te genereren.

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde hematopoietische stam- en voorlopercel (HSPC) kweekprocedure voor de robuuste engraftment van gen-bewerkte cellen in vivo.

CRISPR/Cas9-genbewerking van hematopoietische stam- en voorlopercellen voor gentherapietoepassingen

Intrafemorale injecties maken de implantatie van een klein aantal hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) mogelijk door de cellen direct in de beenmergholte te plaatsen. Hier beschrijven we een experimenteel protocol van intrafemorale injectie van menselijke HSPC's in immunodeficiënte muizen.

Intrafemorale injectie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen in immuungecompromitteerde muizen 

Hier presenteren we een protocol dat CRISPR/Cas9-technologie integreert met de Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-test om kandidaatgenen te identificeren die cruciaal zijn voor de abnormale proliferatieve capaciteit van hematopoëtische stam- en voorlopercellen.

Evaluatie van abnormale groeigerelateerde genen van hematopoëtische stam- en voorlopercellen door CRISPR/Cas9-technologie te combineren met celtelling

Leer hoe je met CRISPR/Cas9 en rAAV heterozygote gain-of-function mutaties modelleert in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen. Deze methode maakt nauwkeurig onderzoek naar leukemische transformatie mogelijk.

Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Meer video's verkennen