Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Deze methode maakt het mogelijk om terugkerende leukemogene gain-of-function mutaties in primaire menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen nauwkeurig te modelleren en daarbij de rol in leukemische transformatie te onderzoeken. Het grote voordeel van deze techniek is dat de crispr-cas9-gebaseerde mutatie engineering wordt gecombineerd met de introductie van een fluorescerende reporter. Dit maakt op unieke wijze de identificatie, verrijking en tracking van zuivere heterozygot-gemuteerde celpopulaties mogelijk.

De procedure wordt gedemonstreerd door Tommaso Sconocchia, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium. Ontwerp om te beginnen het single guide RNA met behulp van de online Benchling-ontwerptool door de plus-creatieoptie te selecteren. Klik vervolgens op DNA-sequentie"gevolgd door DNA-sequenties importeren" en importeren uit databases"optie.

Voer vervolgens het gewenste gen in en selecteer de mens als de soort. Klik op de zoekoptie en selecteer de juiste transcriptimport. Selecteer de regio van belang waarin u de dubbelstrengsbreuk wilt introduceren.

Selecteer vervolgens de CRISPR-optie aan de rechterkant van het scherm, gevolgd door ontwerp- en analysehandleidingen. Selecteer vervolgens enkele gids", terwijl de lengte van de gids op 20 basisparen en PAM-volgorde blijft voor bewerking met SP-Cas9. Kies een gids met een hoge on-target score en een hoge off-target score en bestel het single guide RNA als een chemisch gemodificeerd synthetisch single guide RNA bij een commerciële leverancier.

Om de HDR-sjabloon te ontwerpen, importeert u de genomische sequentie en de coderingsvolgorde in software voor moleculair klonen. Ontwerp vanuit het genomische sequentiebestand de linker homologiearm door idealiter 400 basenparen te selecteren op het vijf priemeinde van de dubbele strengen en plak deze reeks in een nieuw bestand. Ontwerp vanuit het genomische sequentiebestand de splice acceptor-sequentie door de laatste 150 basenparen van het beoogde intron te selecteren en deze na de linker homologiearm te plakken.

Selecteer in het coderingsvolgordebestand het cDNA van belang. Codon optimaliseert de cDNA en plaatst deze na de splice acceptor-sequentie. Na het cDNA van belang, plaats een drie priem polyadenylation signaal volgens een promotor sequentie voor het fluorescerende eiwit.

Plaats vervolgens de volgorde voor het fluorescerende eiwit en een tweede, maar ander polyadenylation-signaal. Ontwerp uit het genomische sequentiebestand de juiste homologiearm door idealiter 400 basenparen te selecteren op het drie priemeinde van de dubbele strengenbreuken en de reeks in te voegen na de tweede polyaminatie. Maak vervolgens een kopie van de hele sjabloon en wijzig het cDNA van belang zodat het de volgorde van de gewenste mutatie bevat.

Wissel het fluorescerende eiwit uit met een ander fluorescerend eiwit. Construeer en kloon de HDR-sjablonen in de AAV-expressievector. Bereid voor recombinante AAV6-bereiding 10 gerechten van 150 millimeter met elk 11 miljoen HECK293T in 20 milliliter DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline streptomycine en 25 millimolaire HEPES.

Plaats vervolgens de gerechten in de incubator op 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, gedurende 24 uur. Nadat u het oude medium zorgvuldig hebt weggegooid, vervangt u het door 20 milliliter antibioticavrije DMEM aangevuld met 10% FBS, 25 millimol HEPES en één millimolair natriumbutyraat. Bereid vervolgens twee buizen van 15 milliliter met het label buizen één en twee.

Voeg aan buis één vijf milliliter gereduceerd serummedium, 60 microgram recombinant AAV6-gemuteerd HDR-plasmide en 220 microgram PDGM6-helperplasmide toe. Voeg aan buis twee vijf milliliter gereduceerd serummedium en 1120 microliter polyethyleenamineoplossing van één milligram per milliliter polyethyleenamine toe. Na het toevoegen van de inhoud van buis twee aan buis één, vortex gedurende 30 seconden en vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.

Voeg voorzichtig druppelgewijs 1,1 milliliter van de oplossing toe aan elk gerecht en verdeel door voorzichtig te draaien. Zet de gerechten in de couveuse op 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, gedurende 48 uur. Voeg vervolgens 250 microliter 0,5 molaire EDTA toe aan elk gerecht en plaats ze gedurende 10 minuten in de incubator.

Oogst de cellen door ze van de schaal te wassen en over te brengen naar een centrifugebuis van 500 milliliter. Centrifugeer bij 2000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Maak de pellet los door vortexing en extraheer het virus met behulp van een AAV-zuiveringskit.

Bewaar het na het aanhalen van het gezuiverde virus bij min 80 graden Celsius. Na het ontdooien van CD34-positieve hematopoëtische stam- en voorlopercellen, breng de cellen over in 10 milliliter voorverwarmd RPMI aangevuld met 1% penicilline streptomycine. Centrifugeer bij 350 G bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Suspensie de cellen in hematopoietische stam en voorlopercelretentiemedium tot een concentratie van 250.000 cellen per milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 72 uur. Oogst vervolgens de cellen in een buis van 15 milliliter. Tel en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-uitsluiting.

Om het ribocucleoproteïnecomplex te bereiden, voegt u 15 microgram Cas9 en acht microgram single guide RNA toe in een buis van 1,5 milliliter en incubeert u bij 25 graden Celsius gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok. Terwijl het ribonucleoproteïnecomplex broedt, centrifugeer je de cellen gedurende vijf minuten op 350 G en gooi je het supernatant weg. Nadat de cellen in 100 microliter nucleofectieoplossing zijn gesuspendeerd, mengt u de cellen met het ribonucleoproteïnecomplex en brengt u ze over in het cuvet.

Nadat u zachtjes op de cuvette hebt getikt om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen, plaatst u de cuvette in de houder van het transfectiesysteem en elektropomeert u de cellen. Voeg onmiddellijk na elektroporatie 400 microliter voorverwarmde hematopoietische stam en voorlopercellen celretentiemedium toe zonder penicilline streptomycine en breng de cellen over met een fijne transferpipet in een kweekplaat met voorverwarmde hematopoietische stam en voorlopercelretentiemedium zonder penicilline streptomycine. Breng vervolgens de plaat over naar de incubator.

Ontdooi de injectieflacons met de bevroren recombinante AAV's op ijs en transduceer de cellen door de optimale hoeveelheid van elke recombinante AAV6 naar de celsuspensie te pipetteren. Nadat u de celsuspensie voorzichtig met de pipet hebt gemengd, incubeert u de getransduceerde cellen gedurende zes tot acht uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verzamel na zes tot acht uur de cellen in een buis en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 350 G bij kamertemperatuur.

Gooi het supernatant weg en vervang het door verse voorverwarmde hematopoëtische stam en voorlopercelretentiemedium aangevuld met penicilline streptomycine en breng de cellen over naar een celkweekplaat. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Om de gemanipuleerde cellen met de heterozygote gain-of-function mutatie te sorteren, oogst u de cellen in een buis van 15 milliliter en centrifugeert u bij 350 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, zoals eerder aangetoond.

Verwijder het supernatant en suspensie de cellen in één milliliter DPBS met 0,1% PSA en centrifugeer opnieuw bij 350 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, suspensie u de cellen in een geschikt volume DPBS plus 0,1% BSA, afhankelijk van het celnummer zoals eerder aangetoond. Breng de cellen over naar een steriele faxbuis uitgerust met een dop en voeg zeven AAD of andere levensvatbaarheidskleurstof toe aan de celsuspensie voor uitsluiting van levende / dode cellen.

Sorteer de levende cellen die dubbel positief zijn voor de fluorescerende reportereiwitten in een verzamelbuis met 200 microliter hematopoietische stam en voorlopercelretentiemedium. Na het centrifugeren van de gesorteerde cellen bij 350 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, zoals eerder aangetoond, tot een concentratie van 250.000 cellen per milliliter voor verdere uitbreiding in cultuur of gebruik de cellen direct voor functionele testen. Twee dagen na transvectie met het ribonucleoproteïnecomplex en transductie met de recombinante AAV6-virussen werden de cellen geanalyseerd met flowcytometrie.

Vier hoofdpopulaties werden gedetecteerd, waaronder cellen zonder HDR-gebaseerde genoombewerking die noch de GFP- noch de BFP-cellen tot expressie brachten die alleen positief waren voor GFP met alleen het wildtype-construct geïntegreerd, cellen die alleen positief waren voor BFP met alleen het gemuteerde construct geïntegreerd, en GFP en BFP dubbele positieve cellen met zowel het wilde type als gemuteerde sequenties geïntegreerd. Om de succesvolle knock-in van de heterozygote calreticuline mutaties in/uit te valideren, werd PCR uitgevoerd op genomisch DNA geëxtraheerd uit cellen die alleen met AAV waren geïncubeerd en uit cellen geïncubeerd met het ribonucleoproteïne en AAV met het ingeslagen calreticuline wildtype en calreticuline-deletiesequentie. Cellen werden gesorteerd op basis van de gelijktijdige expressie van beide fluorescentierapporteurs voorafgaand aan DNA-extractie.

Na gel-elektroforese werden individuele banden uit de gel weggesneden en werd DNA geëxtraheerd voor daaropvolgende Sanger-sequencing. De sequencingresultaten bevestigden de succesvolle naadloze integratie van het wilde type en gemuteerde sequenties in de heterozygote calreticulin-gemuteerde hematopoietische stam en voorlopercellen. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om zorgvuldig het best presterende single guide RNA te selecteren, omdat dit de algehele HDR-efficiëntie en dus de frequentie van succesvolle knock-in van heterozygote mutaties zal bepalen.

Na deze procedure kunnen de genetisch gemanipuleerde cellen worden gebruikt voor functionele in-vitro en in-vivo experimenten zoals kolonievormende eenheidstests, differentiatietests en transplantatie in immuundeficiënte muizen.