Name: Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer een 3D-geprint inzetstuk voor co-cultuur van endotheelcellen en keratinocyten. Dit model onderzoekt paracriene communicatie en toont significante toename van celproliferatie en migratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd uitgevoerd in samenwerking met BASF Beauty Care Solutions. Mevrouw Charlie Colin-Pierre is een door BASF / CNRS gefinancierde PhD-fellow.
We willen de heer Mehdi Sellami bedanken voor het ontwerp van de 3D-geprinte inserts.

OPMERKING: De 3D-inzetstukken (figuur 1A) worden commercieel verkregen en worden geprint met behulp van een fotopolymeerhars die biocompatibel is met celkweek en autoclaveren (zie de materiaaltabel). In deze paragraaf wordt een gedetailleerd protocol beschreven om het cocultuurmodel vast te stellen door middel van inserts (zie figuur 1B). Er worden ook enkele voorbeelden van toepassingen gegeven.
1. Plaatsing van de gesteriliseerde insert in de 6-well platen
<ol><li>Meng de twee componenten in de kit (zie materiaaltabel), voedingssilicium (reagens A) en katalysator (reagens B), in een verhouding van 10:1 (v/v) volgens de instructies van de fabrikant. (Figuur 1Ba). Gebruik een 70% ethanol gesteriliseerde spatel om de twee componenten te mengen. OPMERKING: Het volume van het te bereiden siliciummengsel is afhankelijk van het aantal te fixeren inserts. Een teveel aan katalysator kan ertoe leiden dat het siliciummengsel te snel stolt.</li>
	<li>Breng de inserts met een pincet aan op het siliconenmengsel, zodat het mengsel homogeen wordt verdeeld aan de onderkant van de inserts (figuur 1Bb). Plaats de inzetstukken in de putjes van een 6-putplaat en oefen zachte druk uit op de inzetstukken om ervoor te zorgen dat de inzetstukken in nauw contact staan met de plaat om lekkage van het celkweekmedium te voorkomen (figuur 1Bc).</li>
	<li>Zet de plaat gedurende 1 uur op 37 °C om het stollingsproces van het silicium te ondersteunen. OPMERKING: De tijd van stolling is afhankelijk van de hoeveelheid katalysator die is toegevoegd.</li>
	<li>Steriliseer na het stollen de platen met de inzetstukken door ze gedurende 30 minuten tot 1 uur onder te dompelen in een 70% ethanolbad.</li>
	<li>Gooi de alcohol weg door pipetteren en laat de plaat een nacht drogen (deksel open) in een celkweekkap. OPMERKING: De alcohol moet volledig worden verdampt voordat de volgende stap wordt uitgevoerd om celfixatie en toxiciteit te voorkomen. De kant-en-klare plaat met de inzetstukken kan enkele dagen worden bewaard voor gebruik in droge en steriele omstandigheden bij kamertemperatuur.</li>
</ol>2. Coatings zoals poly-L-lysine of poly-HEMA (optionele stap)
OPMERKING: Coating wordt niet uitgevoerd in dit experiment en de stappen worden gegeven om te informeren over de mogelijkheid om de inserts te coaten.
<ol><li>Bereid de coatingoplossing voor volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Overweeg een volume van 200-400 μL voor de grootste compartimenten en een volume van 50-100 μL voor de kleinste compartimenten voor de coating van het inzetstuk. Voeg de coatingoplossing toe aan de afzonderlijke compartimenten.</li>
	<li>Laat de coating drogen zoals aangegeven door de fabrikant onder steriele omstandigheden.</li>
</ol>3. Zaaien van de cellen
<ol><li>Kweek de keratinocyten van de buitenste wortelschede (KORS) en menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen (HDMECs) zoals aanbevolen door de fabrikant. Bereid de celsuspensie voor zodra de cellen samenvloeiing bereiken.<ol><li>Gooi het medium uit de kolven en voeg 5 ml trypsine toe om de cellen los te maken (zie materiaaltabel).</li>
		<li>Plaats de kolf met de KORS gedurende 5 minuten op 37 °C met 5% CO2 . Incubeer de kolf met de HDMEC's gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Meng de trypsine-oplossing met de KORS met 5 ml mesenchymaal stamcelmedium (MSCM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en groeifactoren (basaal medium met supplementkit, zie materiaaltabel). Meng de trypsine-oplossing met de HDMECs met 5 ml endotheelcelmedium (ECM) aangevuld met 5% FBS en groeifactoren (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Breng de cellen over in een 15 ml steriele conische buis. Centrifugeer de KORS- en HDMEC-suspensies gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 200 x g.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in 2 ml van het betreffende medium.</li>
		<li>Meng 10 μL van de celsuspensie met 10 μL trypanblauwe kleurstof (zie materiaaltabel).</li>
		<li>Voeg 10 μL van het mengsel toe aan de kamer van de telglaas.</li>
		<li>Plaats de telschuif in het celtelsysteem (zie materiaaltabel) en detecteer het celnummer en de levensvatbaarheid.</li>
		<li>Bereid de celsuspensie in een concentratie van 0,5 x 105 cellen/ml in het betreffende medium. OPMERKING: Als de verschillende celtypen verschillende tijdstippen van hechting vereisen en/of om de ideale samenvloeiing te bereiken, kan de celzaaiing op verschillende tijdstippen worden gemaakt, afhankelijk van de celtypen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdeel 800 μL tot 1 ml van de celsuspensie in de afzonderlijke grote compartimenten en 100-150 μL in de afzonderlijke kleine compartimenten met een pipet.<ol><li>Zaai de KORS op 1 x 10 5 cellen/ml in MSCM aangevuld met5% FBS en groeifactoren in een van de grote compartimenten.</li>
		<li>Zaad HDMEC in ECM aangevuld met 5% FBS en groeifactoren bij 2,5 x 103 cellen/ml in de kleine compartimenten en bij 1,25 x 105 cellen/ml in het andere grote compartiment. OPMERKING: De proliferatietest kan worden uitgevoerd in de kleine compartimenten en de migratie- en levensvatbaarheidstests kunnen worden uitgevoerd in de grote compartimenten. De concentratie van de gezaaide cellen is geoptimaliseerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Deze concentratie zorgt voor een goede levensvatbaarheid van de cellen na 24-48 uur incubatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de celkweekplaat op 37 °C met 5% CO2 of onder de gebruikelijke omstandigheden om celhechting en/of rijping mogelijk te maken. OPMERKING: Incubeer de cellen gedurende 24-48 uur zonder de media te veranderen. Indien nodig kan het medium van de compartimenten onafhankelijk worden gewijzigd.</li>
</ol>4. Implementatie van de cocultuur (figuur 1Bd)
OPMERKING: De implementatie van de co-cultuur komt overeen met het tijdstip waarop het gemeenschappelijke medium wordt toegevoegd. De toevoeging van een uniek medium voor alle celtypen in de verschillende compartimenten biedt de mogelijkheid van paracriene communicatie tussen de cellen vanwege de aanwezigheid van communicatievensters (eivormige gaten in de wanden van de 3D-geprinte inserts). Volg de stappen 4.1-4.3 om de cocultuur te implementeren.
<ol><li>Leeg de kweekmedia van de verschillende compartimenten van de inzetstukken met behulp van een pipet. In het geval van een 3D-sferoïde celcultuur, gooi het medium heel voorzichtig weg.</li>
	<li>Spoel de cellen met 1 ml warme PBS van 37 °C in de grote compartimenten en 200 μL van 37 °C warme PBS in de kleine compartimenten. Zorg voor voorzichtig wassen om de cellen niet los te maken.</li>
	<li>Voeg 3 ml van een gemeenschappelijk medium toe dat is geselecteerd om compatibel te zijn voor alle celtypen. OPMERKING: In deze studie wordt de basale ECM (zonder FBS en groeifactoren) gebruikt. Zorg ervoor dat het medium alle compartimenten bedekt (niveau boven de communicatievensters [eivormige gaten in de wanden], zoals weergegeven in figuur 1A).</li>
	<li>Plaats de plaat met de coculturen gedurende 24-48 uur op 37 °C met 5% CO2 .</li>
</ol>5. Celobservatie, tellen en schrapen
<ol><li>Observeer de morfologie en tel het celnummer van de verschillende compartimenten tijdens het experiment onder een optische microscoop na 24-48 uur incubatie. OPMERKING: Het verwachte aantal cellen is afhankelijk van de gebruikte celtypen (grootte, morfologie, enz.) en van de grootte van het compartiment. In dit experiment worden tussen 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/ml en tussen 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMECs/ml geteld in de grote compartimenten.</li>
	<li>Maak de cellen los met trypsine voor het tellen van de celsuspensie. OPMERKING: Overweeg voor de celloslatingsoplossing een volume van 100-500 μL voor de grootste compartimenten en een volume van 10-50 μL voor de kleinste compartimenten.</li>
	<li>Controleer de levensvatbaarheid met behulp van trypan blue kleuring (zie stappen 3.1.6-3.1.8).</li>
</ol>6. Insert reiniging voor recycling
<ol><li>Verwijder de inzetstukken van de 6-putplaat aan het einde van het experiment met een lichte draaiing (figuur 1Be).</li>
	<li>Verwijder het silicium van de inzetstukken door het eraf te trekken. Gebruik indien nodig een spatel om het resterende silicium dat aan de wanden van de inzetstukken is vastgeplakt te verwijderen (figuur 1Bf).</li>
	<li>Was de inzetstukken met conventionele celkweekreinigingsmiddelen en reinigingsmaterialen (voorbeeld in de materiaaltabel).</li>
	<li>Steriliseer de inzetstukken voor toekomstig gebruik in een autoclaaf (vaste cyclus, 121 °C gedurende 20 minuten) of door ze gedurende 1 uur onder te dompelen in een 70% ethanolbad. OPMERKING: In deze stap worden twee voorbeelden van mogelijke assays (proliferatie- en migratietests) beschreven met behulp van de 3D-geprinte inserts (figuur 1Bd).</li>
</ol>7. Celproliferatietest - WST-1-test
<ol><li>Volg stap 1-3.1 om de cellen te kweken. OPMERKING: Volg de stap in deze sectie om het co-cultuursysteem te implementeren om het effect van het KORS-secretoom op HDMEC-proliferatie te onderzoeken. KORS-cellen worden gebruikt om de eerder gepubliceerde gegevens te vergelijken8.<ol><li>Zaai de KORS op 1 x 10 5 cellen/ml in mesenchymaal stamcelmedium (MSCM) aangevuld met5% FBS en groeifactoren in de grote compartimenten.</li>
		<li>Plaats de celkweekplaat gedurende 24 uur op 37 °C met 5% CO2 .</li>
		<li>Zaai de HDMECs in endotheelcelmedium (ECM) aangevuld met 5% FBS en groeifactoren bij 2,5 x 103 cellen/ml in de kleine compartimenten.</li>
		<li>Plaats de celkweekplaat op 37 °C met 5% CO2 gedurende 24-48 uur.</li>
		<li>Gooi de media uit alle compartimenten weg en implementeer het co-cultuursysteem door toevoeging van 3 ml niet-aangevuld basaal ECM (gemeenschappelijk celkweekmedium voor alle compartimenten van de 3D-geprinte inserts).</li>
	</ol></li>
	<li>Verdun WST-1 in het ECM common cell culture medium (1:10 eindverdunning) om de WST-1 oplossing te bereiden. OPMERKING: Bereid voor het volume WST-1-oplossing ten minste 500 μL extra oplossing voor de blanco.</li>
	<li>Gooi het celkweekmedium uit de insert door pipetteren.</li>
	<li>Voeg de WST-1-oplossing toe aan de geselecteerde compartimenten (150 μL voor de kleine compartimenten en 600 μL voor de grote compartimenten). Zet de plaat op 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Na de optimale celincubatietijd van 30 minuten, breng 100 μL van het incubatiemedium van elke toestand over op een plaat met 96 putten.</li>
	<li>Beoordeel de colorimetrische reactie met behulp van een microplaatlezer tussen 420 nm en 480 nm.<ol><li>Plaats de plaat op de microplaatlezer en klik op de knop een nieuw protocol bewerken.</li>
		<li>Selecteer het specifieke type 96-putplaat (zie materiaaltabel) dat wordt gebruikt en de golflengte van 450 nm.</li>
		<li>Klik op de knop meting starten.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Celmigratietest - apparaat met twee migratiekamers
<ol><li>Volg stap 1-3.1 om de cellen te kweken. OPMERKING: Volg de stappen in deze sectie om het co-cultuursysteem te implementeren om het effect van het KORS-secretoom op HDMEC-proliferatie te onderzoeken.<ol><li>Zaai de KORS op 1 x 10 5 cellen/ml in MSCM aangevuld met5% FBS en groeifactoren in een van de grote compartimenten.</li>
		<li>Plaats de celkweekplaat gedurende 24 uur op 37 °C met 5% CO2 .</li>
		<li>Plaats het apparaat met twee migratiekamers in het andere grote compartiment van inzetstukken.</li>
		<li>Zaai de HDMECs in ECM aangevuld met 5% FBS en groeifactoren bij 7 x 105 cellen/put van de twee migratiekamers apparaat.</li>
		<li>Plaats de celkweekplaat gedurende 24 uur op 37 °C met 5% CO2 .</li>
		<li>Gooi de media en het apparaat van de twee migratiekamers na 24 uur of op een optimaal tijdstip weg, afhankelijk van het celtype dat migreert. Implementeer het co-cultuursysteem door toevoeging van 3 ml niet-aangevulde basale ECM. OPMERKING: Ga voorzichtig te werk om de cellen niet los te maken. Als de cellen echt gevoelig zijn voor loslating veroorzaakt door de toevoeging van gemeenschappelijk medium, trek dan het apparaat van de twee migratiekamers af na de toevoeging van het gemeenschappelijke medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Observeer en maak een foto van het oppervlak bedekt door de cellen op verschillende tijdstippen onder een fasecontrastmicroscoop bij 10x vergroting. OPMERKING: De foto's zijn gemaakt met een fasecontrastmicroscoop (zie materiaaltabel). De foto's worden opgeslagen in een USB-stick en vervolgens geanalyseerd door de plug-in voor wondgenezingstools van de software (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Meet het onbedekte oppervlak met behulp van klassieke kwantitatieve analysesoftware.<ol><li>Open de afbeelding in de software en activeer de wondgenezingstool die beschikbaar is in de macrolijst.</li>
		<li>Klik op de m-knop om het onbedekte oppervlak van de migratieafbeelding te meten.</li>
		<li>Het onbedekte oppervlak wordt berekend volgens de volgende formule: Dekkingspercentage = ([gemiddelde oppervlakte zonder cellen bij T0 − oppervlakte zonder cellen op tijdstip T]/gemiddeld gebied zonder cellen bij T0) × 100. OPMERKING: De 3D-geprinte inserts zijn volledig aangepast aan de meeste technieken van de celbiologie (zoals de pseudobuisvormingstest, 3D-culturen) en voor biochemische experimenten (zoals de extractie van DNA, RNA, eiwit).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li>
<li>Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825(2019).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1%2F2%2FHIF-1%CE%B1%2FVEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113(2018).</li>
<li>Soares, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+modulation+of+microglia-neuron+communication%3A+Anti-neuroinflammatory+and+neurotrophic+role%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role.</a> Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).</li>
<li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense%2C+interconnected+endothelial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318(2021).</li>
<li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).</li>
<li>Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+effect+of+air+particles+exposure+induce+Nrf2-dependent+cardiomyocyte+cellular+response+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro.</a> Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).</li>
<li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glypican-1%2FHGF%2FC-met+and+glypican-1%2FVEGF%2FVEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172(2021).</li>
<li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li>
<li>Wu, A. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m%C3%BCller+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352(2021).</li>
<li>Oudart, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li>
<li>Martinotti, S., Ranzato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).</li>
<li>Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth%2C+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97(2018).</li>
<li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Indirecte celcommunicatie wordt vaak onderzocht met behulp van geconditioneerde media of co-cultuursysteemapparaten. Geconditioneerde mediavoorbereiding is stroomopwaarts in de experimenten tijdrovend en deze methode is beperkt tot eenzijdige effectanalyses. De vorige studie van Colin-Pierre et al.8 met behulp van geconditioneerde media werd uitgevoerd op de indirecte celcommunicatie tussen twee celtypen (HDMECs en KORS). De gegevens van deze eerdere studie toonden het effect aan van KORS...

In vivo communiceren cellen direct (celcontact) of indirect (door afscheiding van moleculen) met elkaar. Om celcommunicatie te bestuderen, kunnen verschillende cocultuurmodellen worden ontwikkeld, zoals directe cocultuur (de verschillende celtypen zijn in directe interactie in dezelfde put) en gecompartimenteerde cocultuur (de verschillende celtypen zijn in indirecte interactie in verschillende compartimenten van een cultuursysteem)1. Bovendien kunnen geconditioneerde media worden gebruikt voor co-cultuursystemen, waarbij de indirecte interactie mogelijk wordt gemaakt door uitgescheiden moleculen in de geconditioneerde media van een effectorceltype dat wordt overgebracht naar een responderceltype1.
In het geval van paracriene celcommunicatiestudies bieden indirecte cocultuursystemen modellen die celinteracties in vivo sterk weerspiegelen. Indirecte co-cultuur systemen zijn ontwikkeld en gecommercialiseerd, waardoor de oprichting van indirecte co-cultuur modellen 2,3. Helaas bieden de meeste indirecte co-cultuursystemen slechts twee compartimenten. Andere indirecte co-cultuursystemen bieden meerdere compartimenten, maar ze zijn minder schaalbaar in vergelijking met het systeem dat in dit manuscript wordt gerapporteerd. Sommigen van hen laten geen klassieke visualisatie onder een microscoop toe en ze presenteren vaak specifieke toepassingsmethoden. In verschillende studies wordt de paracriene communicatie tussen verschillende celtypen onderzocht door het geconditioneerde mediamodel 4,5,6,7. Dit is een gemakkelijkere manier van onderzoek in vergelijking met indirecte cocultuursystemen, omdat het geen specifieke methoden of materialen vereist om te worden vastgesteld1. Aan de andere kant is de voorbereiding van geconditioneerde media tijdrovend en levert alleen informatie op over eenrichtingscelsignalering (effector naar responder)1.
In dit artikel wordt een nieuwe, eenvoudige manier voorgesteld om celcommunicatie te onderzoeken. Door de combinatie van verschillende celtypen in directe of indirecte interactie en in 2D- of 3D-formaten mogelijk te maken, bieden de geprinte inserts tal van voordelen voor het eenvoudig opzetten van co-cultuurmodellen. Aangepast om in de putten van 6-putplaten te worden geplaatst, is het 3D-geprinte inzetstuk cirkelvormig en maakt het scheiding van de put in vier compartimenten mogelijk (twee grote compartimenten en twee kleine compartimenten; Figuur 1A). De 3D-geprinte inzetstukken kenmerken zich door de afwezigheid van een bodem. De cellen staan dus in direct contact met de plaat waarop de insert is geplaatst. Bovendien kan elk compartiment onafhankelijk van de andere worden gecoat. Bovendien kan het celgedrag gemakkelijk worden gevolgd onder optische microscopen. De aanwezigheid van communicatievensters in elke wand van de insert maakt de toevoeging, op het optimale moment, van een gemeenschappelijk medium mogelijk om verschillende experimenten van co-cultuur uit te voeren. Talrijke combinaties van co-cultuur kunnen worden uitgevoerd om directe en / of indirecte communicatie tussen verschillende celtypen te bestuderen. Zo kan een model van indirecte cocultuur tussen vier verschillende celtypen in monolaag en/of in 3D (sferoïden) worden ontworpen. Een combinatie van directe en indirecte co-cultuurmodellen kan ook worden uitgevoerd door verschillende celtypen in hetzelfde compartiment te mengen. Het effect van complexe structuren (organoïden, weefselexplant, enz.) op verschillende celtypen zou een ander voorbeeld kunnen zijn van modellen die kunnen worden gemaakt. Bovendien zijn de 3D-geprinte inserts compatibel met functionele assays van de celbiologie (proliferatie, migratie, pseudobuisvorming, differentiatie, enz.) en met biochemische tests (de extractie van DNA, RNA, eiwitten, lipiden, enz.). Ten slotte bieden de 3D-geprinte inserts een breed scala aan experimentele schema's van co-cultuurmodellen met de mogelijkheid om tegelijkertijd verschillende assays in hetzelfde experiment in de verschillende compartimenten te combineren.
Sommige capaciteiten van de 3D-geprinte inserts worden gepresenteerd om ze te valideren als een snel en eenvoudig te gebruiken co-cultuurmodel. In vergelijking met een eerder gepubliceerde studie uitgevoerd op paracriene celcommunicatie, wordt het vermogen van de 3D-geprinte inserts om een waardevol co-cultuurmodel te zijn, aangetoond. Om dit punt te beoordelen, werd de regulatie van endotheelcelproliferatie en migratie door keratinocyten vergeleken tussen het 3D-geprinte insertsysteem en het klassieke systeem met behulp van geconditioneerde media. De 3D-geprinte wisselplaten maken het mogelijk om snel vergelijkbare resultaten te verkrijgen in vergelijking met het conventionele systeem met behulp van geconditioneerde media. De 3D-geprinte inserts bieden inderdaad een robuust model om celinteracties in beide richtingen te bestuderen zonder de noodzaak om geconditioneerde media te produceren en met de mogelijkheid om parallel de proliferatie- en migratietests in hetzelfde experiment uit te voeren.
Tot slot wordt in dit artikel een nieuw en kant-en-klaar model voorgesteld om celcommunicatie te bestuderen. De 3D-geprinte inserts zijn compatibel met alle adherente celtypen en maken het mogelijk om talloze combinaties van co-cultuur uit te voeren die gericht zijn op het dichter bij in vivo omstandigheden zijn.

<table><tbody><tr><td>Autoclaaf</td><td>Getinge</td><td>APHP</td><td>Solide cyclus, 121 &deg;C gedurende 20 min</td></tr><tr><td>Biomed Clear</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>Impressie uitgevoerd door 3D-Morphoz bedrijf (Reims, Frankrijk)</td></tr><tr><td>Celcultuur detergenten&nbsp;</td><td>Tounett</td><td>A18590/0116</td><td></td></tr><tr><td>Celproliferatie Reagens WST-1</td><td>Roche</td><td>11,64,48,07,001</td><td></td></tr><tr><td>Tellingschuif</td><td>NanoEnTek</td><td>EVE-050</td><td></td></tr><tr><td>Culture-Insert 2 Well in &mu;-Dish 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>80206</td><td>twee-migratiekamers apparaat.&nbsp;</td></tr><tr><td>Endotheliaal celmedium</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td>Basaal medium +/- 25 mL foetaal bovien serum (FBS, 0025), 5 mL endotheelcelgroeisupplement (ECGS, 1052), en 5 mL penicilline/streptomycine oplossing (P/S, 0503).</td></tr><tr><td>EVE Geautomatiseerde celteller&nbsp;</td><td>NanoEnTek</td><td>NESCT-EVE-001E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMEX1200</td><td>10x vergroting</td></tr><tr><td>Siliconen reagens en katalysatorkit voor voedsel</td><td>Artificina</td><td>RTV 3428 A en B&nbsp;</td><td>(10:1)</td></tr><tr><td>FORM 3B printer</td><td>Formlabs</td><td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td><td>Impressie uitgevoerd door 3D-Morphoz bedrijf</td></tr><tr><td>Human Dermal Microvascular Endotheel Cellen (HDMEC)</td><td>ScienCell</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyten van Outer Root Sheath (KORS )</td><td>ScienCell</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Macro Wound Healing Tool Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Software gebruikt voor de meting van het onbedekte oppervlak (voor migratie assays)</td></tr><tr><td>Mesenchymale stamcelmedium&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>7501</td><td>Basaal medium +/-25 mL foetaal bovien serum (FBS, 0025), 5 mL mesenchymaal stamcelgroeisupplement (MSCGS, 7552), en 5 mL penicilline/streptomycine oplossing (P/S, 0503)</td></tr><tr><td>Microplaatlezer SPECTRO star NANO</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>BMG LABTECH software</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Promocell</td><td>C-40232</td><td>Zonder Ca2+ / Mg2+</td></tr><tr><td>Trypan Blauw Kleur</td><td>NanoEnTek</td><td>EBT-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine / EDTA</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td>Incubatie van KORS bij 37 &deg;C met 5% CO2 gedurende 5 min. Incubatie van HDMECs gedurende 5 min op kamertemperatuur</td></tr><tr><td>96-well plaat Nunclon Delta Surface</td><td>Thermoscientific</td><td>167008</td><td></td></tr></tbody></table>

een innovatief 3d-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2d- en 3d-celculturen mogelijk te maken

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

De klassieke analyses van indirecte communicatie tussen verschillende celtypen vereisen het gebruik van geconditioneerde media. Bovendien blijft de productie van geconditioneerde media tijdrovend en ver verwijderd van fysiologische en pathologische omstandigheden. Hoewel een paar modellen van co-cultuur in de handel verkrijgbaar zijn, blijven ze beperkt tot specifieke testen en zijn ze meestal voor twee soorten cellen. 
Hier worden 3D-geprinte inserts gebruikt die compatibel zijn met tal van functionele assays. Het inzetstuk maakt de scheiding van één put van een 6-well plaat in vier compartimenten mogelijk. Er kan een breed scala aan combinaties worden ingesteld. Bovendien zijn ramen in elke wand van de compartimenten zo ontworpen dat potentiële intercellulaire communicatie tussen elk compartiment op een volumeafhankelijke manier in het kweekmedium mogelijk is. Paracriene intercellulaire communicatie kan bijvoorbeeld worden bestudeerd tussen vier celtypen in monolaag, in 3D (sferoïden) of door beide te combineren. Bovendien kan een mix van verschillende celtypen in hetzelfde compartiment worden gezaaid in 2D- of 3D-formaat (organoïden). De afwezigheid van een bodem in de 3D-geprinte inzetstukken maakt de gebruikelijke kweekomstandigheden op de plaat, mogelijke coating op de plaat met de insert en directe visualisatie door optische microscopie mogelijk. De meerdere compartimenten bieden de mogelijkheid om verschillende celtypen onafhankelijk van elkaar te verzamelen of om in elk compartiment verschillende reagentia te gebruiken voor RNA- of eiwitextractie. In deze studie wordt een gedetailleerde methodologie gegeven om de nieuwe 3D-geprinte insert te gebruiken als een co-cultuursysteem. Om verschillende capaciteiten van dit flexibele en eenvoudige model aan te tonen, werden eerder gepubliceerde functionele assays van celcommunicatie uitgevoerd in de nieuwe 3D-geprinte inserts en werden aangetoond dat ze reproduceerbaar zijn. De 3D-geprinte inserts en de conventionele celcultuur met behulp van geconditioneerde media leidden tot vergelijkbare resultaten. Kortom, de 3D-geprinte insert is een eenvoudig apparaat dat kan worden aangepast aan tal van modellen van co-culturen met aanhangende celtypen.

In het huidige werk werd een geoptimaliseerd co-cultuursysteem beschreven om robuuste, betrouwbare en significante gegevens te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met klassieke methoden door het gebruik van geconditioneerde media. De 3D-geprinte inserts bootsen de in vivo micro-omgevingsomstandigheden van verschillende celtypen in interactie na door de moeilijkheden en de tijdrovende productie van geconditioneerde media stroomopwaarts in de experimenten te overwinnen. Een eerder gepubliceerde studie is opnieuw uit...

In dit artikel wordt een nieuw ontworpen 3D-geprinte insert gepresenteerd als een model van co-cultuur en gevalideerd door de studie van de paracriene intercellulaire communicatie tussen endotheelcellen en keratinocyten.

Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Dit protocol kan worden gebruikt om tal van kweekstudies te onderzoeken en een nieuw hulpmiddel te bieden voor het onderzoeken van directe celcommunicatie. Dit nieuwe apparaat bespaart veel tijd bij het opstellen van een kweekmodel en is toepasbaar op verschillende celtypen die al dan niet een specifieke coating vereisen. Inderdaad, de vier compartimenten van de 3D-geprinte inserts, maken het mogelijk om verschillende celtypen in monolaag of in 3D op dezelfde manier met verschillende combinaties te kweken.De 3D-geprinte inserts zijn duurzamer, flexibeler, schaalbaarder en kunnen worden gebruikt om experimentele modellen te ontwerpen voor de studies van fysiopathologieën, zoals immunologie of androgenese. Meng om te beginnen de twee componenten, voedselsilicium en katalysator in de kit in een verhouding van 10: 1, met behulp van een 70% ethanol gesteriliseerde spatel volgens de instructies van de fabrikant. Breng de inserts aan op de siliconenmix met een pincet, zodat het mengsel homogeen wordt verdeeld aan de onderkant van het inzetstuk.Plaats de inzetstukken in de putjes van een zesputplaat en oefen zachte druk uit om ervoor te zorgen dat de inzetstukken in nauw contact staan met de plaat om lekkage van het celkweekmedium te voorkomen. Zet de plaat op 37 graden Celsius om het stollingsproces van het silicium gedurende een uur te ondersteunen. Na het stollen steriliseert u de platen met de inzetstukken door ze gedurende 30 minuten tot een uur onder te dompelen in een 70% ethanolbad.Gooi vervolgens de alcohol weg door pipetteren en laat de plaat een nacht drogen in een celkweekkap. Om de keratinocyten van de buitenste wortelschede en menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen te kweken, gooit u het medium uit de kolven en voegt u vijf milliliter trypsine toe om de cellen los te maken. Breng de kolf met de keratinocyten van de buitenste wortelmantel gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en incubeer de kolf met de menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Meng in een steriele conische buis van 15 milliliter de trypsine-oplossing met de keratinocyten van de buitenste wortelschede met vijf milliliter mesenchymaal stamcelmedium aangevuld met 5% FBS en groeifactoren en de menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen met vijf milliliter endotheelcelmedium aangevuld met 5% FBS en groeifactoren. Centrifugeer de keratinocyten van de buitenste wortelschede en menselijke dermale microvasculaire endotheelcelsuspensies bij 200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, suspensieer u de cellen in twee milliliter van hun respectieve mediums.Meng 10 microliter van de celsuspensie met 10 microliter trypanblauwe kleurstof en voeg 10 microliter van het mengsel toe aan de kamer van de telglaas. Plaats de telschuif in het celtelsysteem en detecteer het celnummer en de levensvatbaarheid. Na het bereiden van de celsuspensie in een concentratie van 50.000 cellen per milliliter in het respectieve medium, verdeelt u 800 microliter tot één milliliter van de celsuspensie in de afzonderlijke grote compartimenten en 100 tot 150 microliter in de afzonderlijke kleine compartimenten met een pipet.Zie de keratinocyten in mesenchymaal stamcelmedium aangevuld met 5% FBS en groeifactoren en menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen in endotheelcelmedium, aangevuld met 5% FBS en groeifactoren in de kleine en andere grote compartimenten. Plaats de celkweekplaat op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide, of onder de gebruikelijke omstandigheden, om celhechting en of rijping mogelijk te maken. Leeg de kweekmedia van de verschillende compartimenten van de inzetstukken met behulp van een pipet.Spoel vervolgens de cellen met een milliliter van 37 graden Celsius warme PBS in de grote compartimenten en 200 microliter in de kleine compartimenten. Voeg drie milliliter van een gemeenschappelijk medium toe dat is geselecteerd om compatibel te zijn voor alle celtypen. Leg de plaat met de coculturen op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 tot 48 uur.Maak de cellen los met trypsine voor het tellen van de celsuspensie en controleer de levensvatbaarheid met behulp van trypanblauwe kleuring. Na het observeren van de morfologie, tel het celnummer van de verschillende compartimenten tijdens het experiment onder een optische microscoop na 24 tot 48 uur incubatie. Verwijder eerst de inzetstukken van de plaat met zes putten aan het einde van het experiment met een lichte draaiing en verwijder vervolgens het silicium van de inzetstukken door het eraf te trekken.Was de inzetstukken met conventionele celkweekreinigingsmiddelen en reinigingsmaterialen. Steriliseer vervolgens de inserts voor toekomstig gebruik in een autoclaaf of door ze een uur onder te dompelen in een 70% ethanolbad. Het fenotype en de levensvatbaarheid van de cel werden vergeleken, waarbij 90% levensvatbaarheid werd waargenomen in de putten van de zes putplaten en bij 91% werd waargenomen in de 3D-geprinte inserts voor keratinocyten van de buitenste wortelschede.De levensvatbaarheid van menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen was 85% in de putten van de zes putplaat, terwijl 86% in de 3D-geprinte inserts. De indirecte celcommunicatie tussen keratinocyten en endotheelcellen in de 3D-geprinte inserts toonde aan dat in aanwezigheid van keratinocyten in de inserts de proliferatie van menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen significant toenam met 1,5-voudig na 24 uur en met 3,1-voudig na 48 uur in vergelijking met de controle. Het bleek echter dat de keratinocyt van het buitenste wortelschedeconditiemedium de proliferatie van menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen na 24 uur aanzienlijk verhoogde met 1,5-voudig en na 48 uur met 2,1-voudig.Het 3D-geprinte insert co-cultuur model werd getest om het effect van keratinocyten op menselijke dermale microvasculaire endotheelcelmigratie te bepalen. In de controleconditie migreerden endotheelcellen en bedekten ongeveer 44% van het wondgebied na 24 uur. In aanwezigheid van keratinocyten werd een significante toename van de migratie van menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen waargenomen, waaruit blijkt dat 43% 67% en 99% van het wondgebied na respectievelijk drie, 12 en 24 uur bedekt was.Evenzo neemt de migratie van HDMECs toe in aanwezigheid van keratinocyten van het medium voor de toestand van de buitenste wortelschede. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het inzetstuk op de plaat wordt afgedicht om te voorkomen dat het medium cellen van het ene compartiment naar het andere lekt. Verschillende toepassingen kunnen worden gemaakt, zoals proliferatie, migratie, sedatieve formatie assays DNA, RNA, eiwit en andere analyse.

an-innovative-3d-printed-insert-designed-to-enable-straightforward-2d

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in micro-bioreactoren. Een chip kan maximaal huis tot 10 miljoen. cellen die kunnen worden geteeld onder nauwkeurig omschreven voorwaarden met betrekking tot stroming, zuurstofspanning enz. in een steriele, gesloten circulatie lus.

Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo&#39;s in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

Bij meercellige organismen veroorzaken uitgescheiden oplosbare factoren reacties van verschillende celtypen als gevolg van paracriene signalering. Co-cultuursystemen bieden een eenvoudige manier om de veranderingen aan te brengen die worden veroorzaakt door uitgescheiden oplosbare factoren in de afwezigheid van cel-celcontact.

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Dit protocol beschrijft een platform voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen in verschillende afmetingen met behulp van een aangepaste 3D-gedrukte kunststof schimmel. PDMS negatieven worden genezen in de 3D-gedrukte mal; vervolgens is agarose gegoten in de uitgeharde PDMS negatieven. Cellen worden overgeënt in de resulterende agarose putten waar ze in weefsel ringen aggregaat.

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Wij ontwikkeld een heterogene borst kanker model bestaande uit vereeuwigd tumor en fibroblast cellen ingebed in een bioprintable alginaat/gelatine bioink. Het model recapituleert de tumor in vivo communicatie en vergemakkelijkt de vorming van meercellige tumor spheroïden, inzicht in de mechanismen van tumorvorming rijden oplevert.

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.

Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Dit artikel presenteert een fabricageprotocol voor een nieuw type kweeksubstraat met honderden microcontainers per mm2, waarin organoïden kunnen worden gekweekt en waargenomen met behulp van microscopie met hoge resolutie. De protocollen voor het zaaien en immunostainen van cellen zijn ook gedetailleerd.

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.

Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

Leer een 3D-geprint inzetstuk voor co-cultuur van endotheelcellen en keratinocyten. Dit model onderzoekt paracriene communicatie en toont significante toename van celproliferatie en migratie.

Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken

Meer video's verkennen