Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken

Dit protocol kan worden gebruikt om tal van kweekstudies te onderzoeken en een nieuw hulpmiddel te bieden voor het onderzoeken van directe celcommunicatie. Dit nieuwe apparaat bespaart veel tijd bij het opstellen van een kweekmodel en is toepasbaar op verschillende celtypen die al dan niet een specifieke coating vereisen. Inderdaad, de vier compartimenten van de 3D-geprinte inserts, maken het mogelijk om verschillende celtypen in monolaag of in 3D op dezelfde manier met verschillende combinaties te kweken.

De 3D-geprinte inserts zijn duurzamer, flexibeler, schaalbaarder en kunnen worden gebruikt om experimentele modellen te ontwerpen voor de studies van fysiopathologieën, zoals immunologie of androgenese. Meng om te beginnen de twee componenten, voedselsilicium en katalysator in de kit in een verhouding van 10: 1, met behulp van een 70% ethanol gesteriliseerde spatel volgens de instructies van de fabrikant. Breng de inserts aan op de siliconenmix met een pincet, zodat het mengsel homogeen wordt verdeeld aan de onderkant van het inzetstuk.

Plaats de inzetstukken in de putjes van een zesputplaat en oefen zachte druk uit om ervoor te zorgen dat de inzetstukken in nauw contact staan met de plaat om lekkage van het celkweekmedium te voorkomen. Zet de plaat op 37 graden Celsius om het stollingsproces van het silicium gedurende een uur te ondersteunen. Na het stollen steriliseert u de platen met de inzetstukken door ze gedurende 30 minuten tot een uur onder te dompelen in een 70% ethanolbad.

Gooi vervolgens de alcohol weg door pipetteren en laat de plaat een nacht drogen in een celkweekkap. Om de keratinocyten van de buitenste wortelschede en menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen te kweken, gooit u het medium uit de kolven en voegt u vijf milliliter trypsine toe om de cellen los te maken. Breng de kolf met de keratinocyten van de buitenste wortelmantel gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en incubeer de kolf met de menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Meng in een steriele conische buis van 15 milliliter de trypsine-oplossing met de keratinocyten van de buitenste wortelschede met vijf milliliter mesenchymaal stamcelmedium aangevuld met 5% FBS en groeifactoren en de menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen met vijf milliliter endotheelcelmedium aangevuld met 5% FBS en groeifactoren. Centrifugeer de keratinocyten van de buitenste wortelschede en menselijke dermale microvasculaire endotheelcelsuspensies bij 200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, suspensieer u de cellen in twee milliliter van hun respectieve mediums.

Meng 10 microliter van de celsuspensie met 10 microliter trypanblauwe kleurstof en voeg 10 microliter van het mengsel toe aan de kamer van de telglaas. Plaats de telschuif in het celtelsysteem en detecteer het celnummer en de levensvatbaarheid. Na het bereiden van de celsuspensie in een concentratie van 50.000 cellen per milliliter in het respectieve medium, verdeelt u 800 microliter tot één milliliter van de celsuspensie in de afzonderlijke grote compartimenten en 100 tot 150 microliter in de afzonderlijke kleine compartimenten met een pipet.

Zie de keratinocyten in mesenchymaal stamcelmedium aangevuld met 5% FBS en groeifactoren en menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen in endotheelcelmedium, aangevuld met 5% FBS en groeifactoren in de kleine en andere grote compartimenten. Plaats de celkweekplaat op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide, of onder de gebruikelijke omstandigheden, om celhechting en of rijping mogelijk te maken. Leeg de kweekmedia van de verschillende compartimenten van de inzetstukken met behulp van een pipet.

Spoel vervolgens de cellen met een milliliter van 37 graden Celsius warme PBS in de grote compartimenten en 200 microliter in de kleine compartimenten. Voeg drie milliliter van een gemeenschappelijk medium toe dat is geselecteerd om compatibel te zijn voor alle celtypen. Leg de plaat met de coculturen op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 tot 48 uur.

Maak de cellen los met trypsine voor het tellen van de celsuspensie en controleer de levensvatbaarheid met behulp van trypanblauwe kleuring. Na het observeren van de morfologie, tel het celnummer van de verschillende compartimenten tijdens het experiment onder een optische microscoop na 24 tot 48 uur incubatie. Verwijder eerst de inzetstukken van de plaat met zes putten aan het einde van het experiment met een lichte draaiing en verwijder vervolgens het silicium van de inzetstukken door het eraf te trekken.

Was de inzetstukken met conventionele celkweekreinigingsmiddelen en reinigingsmaterialen. Steriliseer vervolgens de inserts voor toekomstig gebruik in een autoclaaf of door ze een uur onder te dompelen in een 70% ethanolbad. Het fenotype en de levensvatbaarheid van de cel werden vergeleken, waarbij 90% levensvatbaarheid werd waargenomen in de putten van de zes putplaten en bij 91% werd waargenomen in de 3D-geprinte inserts voor keratinocyten van de buitenste wortelschede.

De levensvatbaarheid van menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen was 85% in de putten van de zes putplaat, terwijl 86% in de 3D-geprinte inserts. De indirecte celcommunicatie tussen keratinocyten en endotheelcellen in de 3D-geprinte inserts toonde aan dat in aanwezigheid van keratinocyten in de inserts de proliferatie van menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen significant toenam met 1,5-voudig na 24 uur en met 3,1-voudig na 48 uur in vergelijking met de controle. Het bleek echter dat de keratinocyt van het buitenste wortelschedeconditiemedium de proliferatie van menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen na 24 uur aanzienlijk verhoogde met 1,5-voudig en na 48 uur met 2,1-voudig.

Het 3D-geprinte insert co-cultuur model werd getest om het effect van keratinocyten op menselijke dermale microvasculaire endotheelcelmigratie te bepalen. In de controleconditie migreerden endotheelcellen en bedekten ongeveer 44% van het wondgebied na 24 uur. In aanwezigheid van keratinocyten werd een significante toename van de migratie van menselijke dermale microvasculaire endotheelcellen waargenomen, waaruit blijkt dat 43% 67% en 99% van het wondgebied na respectievelijk drie, 12 en 24 uur bedekt was.

Evenzo neemt de migratie van HDMECs toe in aanwezigheid van keratinocyten van het medium voor de toestand van de buitenste wortelschede. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het inzetstuk op de plaat wordt afgedicht om te voorkomen dat het medium cellen van het ene compartiment naar het andere lekt. Verschillende toepassingen kunnen worden gemaakt, zoals proliferatie, migratie, sedatieve formatie assays DNA, RNA, eiwit en andere analyse.