Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Dit protocol kan worden geïmplementeerd in de meeste laboratoria voor ontwikkelingsbiologie van de slokdarm, waardoor onderzoekers die geen toegang hebben tot superresolutiemicroscopen superresolutiebeelden kunnen produceren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt de diffractielimiet van conventionele confocale microscopie te omzeilen zonder dat een superresolutiemicroscoop nodig is door het monster zelf uit te breiden. Dit protocol zal gunstig zijn voor diegenen die bestuderen hoe eiwitlokalisatie de celmorfologie of functie in intacte embryo's beïnvloedt, vooral wanneer die eiwitten zijn georganiseerd in complexe subcellulaire structuren of netwerken.

Het meest voorkomende probleem dat mensen tegenkomen, is het verliezen van embryo's tijdens het protocol. Het is raadzaam om meerdere lagen Poly-L-Lysine aan te brengen om de embryo's stevig te hechten. Neem na de embryo's een plastic petrischaalbasis van zes centimeter gevuld met de helft met 3%agar.

Snijd met een scheermesje of scalpel een rechthoek van vijf bij drie centimeter in de agar. Verwijder de agarplaat met een kleine laboratoriumspatel. Keer vervolgens de basis van de petrischaal om, plaats deze op de bank en plaats de agarplaat op de omgekeerde schaal.

Haal het deksel van de petrischaal en zorg ervoor dat deze droog is. Plak met handschoenen een stuk dubbelzijdig plakband aan de binnenkant van het deksel. Haal de flacons met de gecoate en gefixeerde embryo's uit de shaker en plaats ze verticaal op de werkbank.

Laat de organische en waterige fasen scheiden. Goed gefixeerde embryo's moeten op hun interface blijven. Verwijder de onderste waterige fase volledig met een pasteurpipet en een P200-pipet.

Gebruik een glazen pasteurpipet met een latexbol om de gefixeerde embryo's in meerdere kleine batches op een agarmat te plaatsen, zodat ze niet aan de binnenkant van de pipet blijven kleven. Zodra de embryo's op de agarmat liggen, gebruikt u een P200-pipeter om eventueel achtergebleven heptaan in de buurt van de embryo's te verwijderen. Laat nu het dubbelzijdige tapedeksel vanaf een hoogte van twee centimeter op de agarplaat vallen om de embryo's aan de tape te hechten.

Verwijder voorzichtig het deksel van de agarplaat, plaats het ondersteboven op de bank en voeg voldoende PBS Tween toe om de embryo's in het deksel te bedekken. Om de gewenste embryo's te verzamelen, gebruikt u een stereo-ontleedmicroscoop met een vergroting van 100x en indirecte verlichting. Prik het vitelline-membraan in de buurt van het voorste of achterste uiteinde van het embryo met een fijne glazen naald om het leeg te laten lopen en de druk te verminderen.

Gebruik een fijne pincet of een metalen sonde om het embryo voorzichtig door het gat naar buiten te duwen met het vitelline-membraan nog steeds aan de dubbelzijdige tape vastgeplakt. Laat ongewenste embryo's op de tape staan. Gebruik regelmatig een glazen pasteurpipet om drijvende gedenitelliniseerde embryo's te verzamelen en verplaats ze naar een microfugebuis van 1.5 milliliter.

Bereid de PDMS-oplossing in een conische buis van 50 milliliter en creëer een uitgebalanceerde buis door een geschikte hoeveelheid water toe te voegen aan een tweede conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de PDMS-oplossing bij 500G gedurende drie minuten bij 15 graden Celsius. Giet het vervolgens in een petrischaal van 10 centimeter tot een diepte van een millimeter.

Laat de PDMS-oplossing een nacht stollen bij 55 graden Celsius. Zodra de PDMS-plaat is gestold, snijdt u met een scalpel vierkante gebieden in die iets kleiner zijn dan een dekglaasje van 22 bij 22 millimeter. Sneed in elk vierkant een vierkant van acht millimeter breed in en verwijder het.

breng elk vierkant PDMS goed over op een afdekglaasje van 22 bij 22 millimeter en plak het stevig vast. Om de embryo's aan de dekglaasjes te hechten, brengt u voldoende 0,1% Poly-L-Lysine aan om het oppervlak van de dekglaasjes in elk putje te bedekken en plaatst u ze in een incubator van 55 graden Celsius om te drogen. Spoel de embryo's en PBS kort af om het Tween-wasmiddel te verwijderen.

Breng vervolgens meer dan 10 embryo's over in elke Poly-L-Lysine gecoate put. Laat de embryo's naar de bodem van de putjes zakken. Verwijder het overtollige vocht uit de aangehechte embryo's met behulp van een pasteurpipet en ga onmiddellijk door naar de volgende stap.

Terwijl de embryo's in de monomeeroplossing zitten, bereidt u een geleringsoplossing voor om de PDMS-putten te bedekken. Verdun het katalytische oxidatiemiddel vers uit het poeder. Combineer 3.920 microliter monomeeroplossing met 60 microliter 10%TEMED en 20 microliter 1%TEMPO.

Verdeel de geleringsoplossing in aliquots van 125 microliter in meerdere PCR-buisjes. Verwijder de monomeeroplossing uit de PDMS-putjes met behulp van een vacuüm of pipetter en zorg ervoor dat de embryo's niet worden verstoord. Voeg vijf microliter APS toe aan een van de PCR-buisjes met geleringsoplossing om polymerisatie op gang te brengen.

Verdeel de polymeriserende geleringsoplossing snel over de drie putjes. Herhaal dit totdat alle putjes en embryo's bedekt zijn. Laat de monsters 1,5 tot 2,5 uur geleren bij 37 graden Celsius.

Dikkere hydrogels hebben meer tijd nodig om de polymerisatie te voltooien en te stollen. Roer de hydrogels vaak om de polymerisatie te controleren. Eenmaal gestold, zullen hydrogels niet wiebelen.

Schil na het geleren de PDMS-putjes van het afdekglaasje zonder de hydrogels te verstoren. Breng de hydrogels afzonderlijk over in de putjes van een plaat met zes putjes. De hydrogels kunnen tijdens de spijsvertering iets uitzetten.

Bedek de gels volledig met spijsverteringsbuffer. 30 milliliter spijsverteringsbuffer is voldoende om ze in een plaat met zes putjes te bedekken en ze een uur bij 37 graden Celsius te incuberen. Verplaats de hydrogels na de spijsvertering in een petrischaal van zes centimeter en vul deze met gedeïoniseerd water om uit te zetten.

De hydrogels kunnen op dit punt loskomen van de dekglaasjes en vier vouwen in lineaire afmeting uitzetten. Verwijder met behulp van een pasteurpipet zoveel mogelijk overtollig water uit de petrischaal om de beweging van de gels bij het hanteren tot een minimum te beperken. Manoeuvreer de geëxpandeerde gels met de embryo's op het bodemoppervlak op een groot afdekglaasje voor beeldvorming.

Monteer elk afdekglaasje met gel over het objectief van een omgekeerde confocale laserscanmicroscoop. Na het lokaliseren van de correct geënsceneerde en georiënteerde preparaten schakelden ze over op een sterk vergrote olie- of wateronderdompelingsobjectief om met hoge resolutie in beeld te brengen. Meting van de embryolengte langs de hoofd-staartas onder een 10x-objectief toonde aan dat niet-geëxpandeerde embryo's ongeveer de helft van een gezichtsveld besloegen, terwijl de geëxpandeerde embryo's ongeveer twee volledige gezichtsvelden besloegen.

De gemiddelde lengte van kop tot staart van de niet-geëxpandeerde controle-embryo's was 398,8 micrometer. Voor experimenten één, twee en drie waren de gemiddelde embryolengtes expansiefactoren van respectievelijk 4,0-voudig, 4,7-voudig en 4,9-voudig. In het controlemonster hadden de cellen in het maxillaire segment een gemiddelde breedte van 4,76 micrometer.

In de geëxpandeerde monsters hadden de cellen in het maxillaire segment een gemiddelde breedte van 19,10 micrometer, wat neerkomt op een 4,0-voudige expansie. Het actomyosine-cytoskelet werd afgebeeld in niet-geëxpandeerde controle versus geëxpandeerde embryo's, die convergente extensie ondergingen. Ze verschenen als een enkele lijn waar naburige cellen elkaar ontmoetten.

Daarentegen konden in geëxpandeerde embryo's van stadium zeven parallelle lijnen van myosine twee worden waargenomen bij celcelovergangen, die corticale eiwitpools in aangrenzende cellen vertegenwoordigen. In de niet-geëxpandeerde embryo's van stadium zes verschenen de mitochondriën gelabeld met streptavidine als een heterogene cytoplasmatische waas zonder duidelijke subcellulaire details. In de geëxpandeerde embryo's waren echter talrijke puncta oplosbaar in het cytoplasma, waarschijnlijk gefragmenteerde mitochondriën of delen van het mitochondriale netwerk.

Een belangrijk ding om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om de embryo's te beschermen tegen overmatige blootstelling aan licht na de incubatie van secundaire antilichamen.