Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

Ons protocol biedt een manier om de neuronale reactie op mechanische stress in een levende muis te visualiseren, wat direct bewijs kan leveren van hoe traumatisch hersenletsel de hersenen beïnvloedt. Deze techniek kan het doeleiwit op dezelfde hersenlocatie in hetzelfde dier monitoren voor zowel de acute als de chronische fase na traumatisch hersenletsel. Het gen van belang en de viruspromotor kunnen dienovereenkomstig worden gewijzigd om andere eiwitten in de specifieke celtypen in de hersenen te bestuderen.

Breng om te beginnen oogzalf aan op de ogen van de verdoofde muis. Verwijder het haar van de bovenkant van het hoofd door te knippen met een gewone schaar. Na het maken van een incisie van 12 tot 15 millimeter lang, snijdt u de huid over de linker- en rechterhersenhelft van de schedel met behulp van een veerschaar met gebogen punt.

Zodra de schedel zichtbaar is, verwijdert u het periosteum door er zachtjes over te wrijven met de steriele wattenstaafje en het te spoelen met steriele zoutoplossing. Zodra het schedelgebied is opgedroogd, markeert u de inslagplaats van het traumatisch hersenletsel, of TBI, op de coördinaten 2,5 millimeter achter het bregma en twee millimeter lateraal van de sagittale hechting aan de rechterkant. Haal de muis snel uit het stereotaxische frame en plaats de kop op het bufferkussen onder het TBI-apparaat.

Lijn de punt van het botslichaam uit met de gemarkeerde inslagplaats. Til de metalen kolom op door het vastgebonden nylon touwtje 15 centimeter boven het hoofd van de muis te trekken en laat het vervolgens los, zodat het gewicht vrij op de transducerstaaf kan vallen, die in contact staat met de schedelbovenkant op de TBI-plaats. Plaats het hoofd van de verdoofde muis op het stereotaxische frame dat onder de chirurgische microscoop wordt bewaard.

Boor voorzichtig en langzaam in het oppervlak van de schedel met een FG4-hardmetalen boor met een lage rotorsnelheid om het resterende periost te verwijderen en creëer een ruw schedeloppervlak zodat het tandcement stevig met de schedel bindt. Gebruik zoutoplossing om botstof van het schedeloppervlak te spoelen en te verwijderen. Om de laterale spieren van de schedel te scheiden, ongeveer vijf millimeter achter het oog, waar de hechting bevindt die de pariëtale en temporale schedel verbindt, brengt u voorzichtig de fijne gesloten uiteinden in en beweegt u de gesloten uiteinden voorzichtig in de achterste richting tot aan de lambdoïde hechting.

Scheid de laterale spieren aan de kant waar de implantatie van het schedelvenster zal plaatsvinden. Spoel het vuil van de operatieplaats weg met zoutoplossing en droog het gebied af met gaas. Om de hoofdpaal te implanteren, markeert u het middelpunt 2,5 millimeter achter het bregma en 1,5 millimeter van de sagittale hechting op de rechterhersenhelft met behulp van een markeerstift en een chirurgische schuifmaat.

Trek vervolgens de omtrek van de craniotomie over op de schone en droge schedel. Maak de oorbalk los en draai de kop, zodat het craniotomievlak perfect horizontaal is, en draai de oorbalk vervolgens weer vast. Gebruik het houten stokje van een applicator met wattenstaafje om twee kleine druppels secondelijm aan te brengen aan de voor- en achterkant van de hoofdpaal.

Plaats de titanium hoofdpost over het midden van de craniotomie en pas deze snel aan om binnen hetzelfde vlak te rusten waar het schedelvenster zal worden geïmplanteerd. Oefen lichte druk uit totdat de secondelijm is opgedroogd, wat meestal ongeveer 30 seconden duurt. Bereid tandheelkundig cement in een voorgekoelde keramische schaal door 300 milligram cementpoeder, zes druppels QuickBase-vloeistof en één druppel katalysator grondig te mengen.

Breng snel een ruime hoeveelheid tandheelkundig cementmengsel aan op de buitenomtrek van de getraceerde omtrek en bedek elk blootliggend botoppervlak. Bedek echter niet de plaats van de craniotomie. Maak de oorstang los en bevestig de hoofdpaal aan het metalen frame om ervoor te zorgen dat de kop stabiel staat voor nauwkeurig boren langs de gemarkeerde craniotomieomtrek.

Om de craniotomie uit te voeren, gebruikt u een chirurgische schuifmaat om de diameter van de gemarkeerde cirkel te verifiëren zoals eerder gedemonstreerd, en past u deze indien nodig aan, zodat het schedelvenster precies in de craniotomie past. Gebruik een elektrische tandartsboor om de schedel langs de buitenkant van de gemarkeerde cirkel te etsen en te verdunnen met eerst een FG4-hardmetalen bit, waardoor een spoor ontstaat waarbinnen de schedel kan worden uitgedund. Irrigeer het gebied met zoutoplossing om het botstof weg te spoelen.

Ga door met het verdunnen van de schedel met een FG 1/4 hardmetalen bit totdat de schedel flinterdun en transparant is. Stop regelmatig met boren en irrigeer het hele gebied opnieuw met steriele zoutoplossing om de opwarming van de boor te verminderen en het botstof weg te spoelen. Voltooi het uitdunnen van de schedel met een EF4-carbide bit en ga door met dunner worden en boren door de rest van de schedel langs het spoor.

Steek een pincet van 0,5 millimeter met fijne punt door de gebarsten plaats en til de botflap voorzichtig omhoog zonder de onderliggende hersenen in te deuken. Na het verwijderen van de botflap, irrigeert u het craniotomiegebied met zoutoplossing. Gebruik de gebogen chirurgische pincet om voorzichtig de zichtbare spinachtige materie te verwijderen.

Gebruik de chirurgische pincet met rechte punt om het steriele glazen venster op te pakken met de drie millimeter glazen afdekglaasje naar beneden gericht. Plaats en pas het glazen venster aan boven de craniotomieplaats om ervoor te zorgen dat het venster goed aansluit op de craniotomierand. De vijf millimeter glazen afdekglaasje zit bovenop.

Bereid het tandcement voor zoals eerder gedemonstreerd en wacht ongeveer zes minuten tot het cement pasteus en dik wordt. Terwijl u wacht tot het cement pasteus en dik wordt, oefent u voldoende druk uit op het raam via een stereotaxische manipulator om te controleren of de schedel veilig en stevig contact kan maken met het glazen raam. Gebruik een verstelbare precisie-applicatorborstel om een kleine hoeveelheid cement langs de raamrand toe te voegen om het glazen raam met de schedel af te dichten.

Wacht ongeveer 10 minuten om het cement volledig te laten drogen, laat dan voorzichtig los en verwijder de manipulator boven het raam. Voltooi door het tandcement bij te snijden met behulp van de tandartsboor met een FG4-carbide bit als overtollig cement het raam bedekt. Ongeveer vier uur na de operatie werd beeldvorming met twee fotonen uitgevoerd, waarbij op oppervlakkig niveau het vaatstelsel zwart leek, en op het diepe niveau van ongeveer 400 micrometer was de EGFP-eiwitexpressie diffuus verdeeld over het cellichaam.

Een week en vier maanden na TBI werd het vasculatuurpatroon dat werd waargenomen op het tijdstip van dag nul gebruikt als referentie om hetzelfde beeldvormingsgebied te lokaliseren. Het vasculatuurpatroon is vergelijkbaar met dat op dag nul. Evenzo werd de EGFP-expressie in het hele cellichaam gedetecteerd.

De fluorescentie-intensiteit op dag nul en vier maanden was vergelijkbaar op zowel het oppervlakkige als het diepere niveau. De fluorescentie-intensiteit na één week was echter lager dan die van dag nul en vier maanden, mogelijk als gevolg van de translationele repressie die werd gerapporteerd voor andere TBI-modellen. Het is van cruciaal belang om uiterst voorzichtig te zijn bij het uitvoeren van de craniotomiestap om beschadiging van het hersenweefsel te voorkomen.

Zorg ervoor dat de boorpunt niet in de hersenen wordt ingebracht. Met behulp van deze techniek kunnen onderzoekers verschillende eiwitten van belang in dezelfde cel longitudinaal visualiseren in verschillende fasen na TBI, wat informatie oplevert over de lokalisatie, expressie en oplosbaarheid van dat eiwit in de hersenen van zoogdieren na trauma.