Beoordeling van de integriteit van de darmbarrière bij muizen met fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran
18 november 2022
In deze studie wordt fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC) dextran toegediend aan muizen via orale maagsonde om de intestinale permeabiliteit zowel in vivo als in plasma- en fecale monsters te evalueren. Omdat de darmbarrièrefunctie in veel ziekteprocessen wordt beïnvloed, kan deze directe en kwantitatieve test in verschillende onderzoeksgebieden worden gebruikt.
Deze methode helpt bij het beantwoorden van vragen over de vraag of een aandoening de integriteit van de darmbarrière verandert of vragen of een mogelijke behandeling de integriteit van de darmbarrière kan behouden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een niet-invasieve, low-burden techniek biedt om de darmpermeabiliteit in vivo te evalueren en te kwantificeren. Om te beginnen, versnel de muizen gedurende vier uur en dien vervolgens 200 microliter van de FITC-dextran suspensie toe via orale maagsonde aan elke muis met behulp van een 38 millimeter 22 gauge gesteriliseerde gebogen maagsonde naald.
Start een timer na de eerste maagsonde en wacht vijf tot 10 minuten tussen elke maagsonde om in vivo metingen mogelijk te maken, waarbij een uur na de maagsonde wordt gehandhaafd. Houd de resterende FITC-dextran-ophanging voor de standaardcurve. Start het apparaat en de software door op de startknop te klikken en ingedrukt te houden en het systeem op te warmen.
Klik op Apparaatstatus en zorg ervoor dat alle geconfigureerde apparaten OK weergeven voordat u doorgaat. Klik vervolgens op Nieuwe studie en sla het bestand op met de gewenste naam. Klik vervolgens op Studieopties.
Voer de monster-ID in en kies de juiste laser en experimenteer. Verwijder vervolgens de vacht uit de buikstreek met behulp van een elektrisch scheerapparaat en breng veterinaire zalf royaal aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Open de beeldkamer en plaats het dier dorsaal op de scanplaat.
Zet vervolgens de ledematen en staart vast met tape. Selecteer vervolgens het gebied dat moet worden gescand met het gereedschap Tekenen. Zorg ervoor dat u de hele breedte van de buik van net boven de lever tot het rectum opneemt.
Klik vervolgens op de tool Wijzigen om het gebied aan te passen zodra het is getekend. Stel de scanresolutie in op 2,0 millimeter en klik op Start om de scan te starten. Open vervolgens de afbeeldingsbestanden door ze te vinden onder de gekozen bestandsnaam en open tegelijkertijd alle bestanden met gesynchroniseerde instellingen.
Gebruik de werkbalk Afbeelding synchroniseren en Schalen synchroniseren om de afbeeldingsinstellingen te synchroniseren voor een nauwkeurige vergelijking. Sla vervolgens de afbeeldingen op met de aangepaste schalen. Vergelijk de buikfluorescentie van elk dier en de controlemuis op uniform geschaalde beelden met behulp van software die is gekoppeld aan het beeldvormingssysteem.
Verzamel een fecale pellet van elke muis in een steriele buis vier uur na de maagd. Houd de buizen vervolgens op ijs en plaats ze in het donker. Centrifugeer vervolgens de bloedmonsters op 9, 390 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Breng het plasma vervolgens over naar een nieuwe steriele buis en houd het in het donker op ijs. Verdun 50 milligram fecale monsters in 200 microliter PBS en verdun het plasma met PBS in een verhouding van één tot twee. Plaat 100 microliter monsters en standaarden in een ondoorzichtige zwarte 96-well plaat.
Lees de fluorescentie op een fluorescerende plaatlezer met excitatie op 485 nanometer en absorptie op 530 nanometer. Bepaal ten slotte de concentratie van FITC-dextran per monster door de fluorescentie te vergelijken met de bekende concentraties van de standaardcurve. De analyse van de in vivo fluorescentie toonde aan dat muizen die alleen het controledieet kregen een hogere leverinname van FITC-dextran en hogere niveaus van restfluorescentie in de buikholte hadden in vergelijking met de muizen die het met inuline aangevulde dieet kregen.
De muizen die het met inuline aangevulde dieet kregen, hadden significant lagere niveaus van FITC-dextran in hun plasma in vergelijking met de muizen die alleen het controledieet kregen. Concluderend hadden de muizen die het inulinedieet kregen significant hogere niveaus van FITC-dextran in hun ontlasting dan de muizen die alleen het controledieet kregen. De lagere niveaus van FITC-dextran in de ontlasting van de gecontroleerde muizen geven aan dat het door de darmbarrière in de bloedsomloop is doorgedrongen in plaats van op de juiste manier te worden uitgescheiden.
De hoge niveaus van FITC-dextran in het plasma versterkten deze bevinding. Timing is essentieel bij het proberen van deze procedure. Fluorescentiemeting en monsterverzameling moeten zo dicht mogelijk bij één uur en vier uur na de maagsonde voor elke individuele muis plaatsvinden.
Overzicht
Deze studie evalueert de intestinale permeabiliteit bij muizen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC) dextran, toegediend via orale gavage. Deze methode maakt het mogelijk om de darmbarrièrefunctie in vivo te beoordelen, wat essentieel is voor het begrijpen van diverse ziekteprocessen.
Belangrijkste studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Integriteit van de darmbarrière
- Onderzoek met diermodellen
- Niet-invasieve beoordelingstechnieken
Achtergrond
- De intestinale permeabiliteit is vaak veranderd bij ziektebeelden.
- Het behoud van de integriteit van de darmbarrière is essentieel voor de gezondheid.
- Niet-invasieve methoden hebben de voorkeur voor dierstudies.
Gebruikte methoden
- Toediening van FITC-dextran via orale gavage
- Muizen als experimenteel biologisch systeem
- Fluorescente plaatlezer voor kwantificatie
Belangrijkste resultaten
- Muizen met een controledieet vertoonden hogere hepatische fluorescentieniveaus vergeleken met muizen met een inulinesupplement-dieet.
- Lagere plasmaniveaus van FITC-dextran werden waargenomen bij muizen die het inulinedieet kregen.
- Muizen met inulinesupplementen vertoonden hogere niveaus van FITC-dextran in de feces, wat wijst op een effectief onderhoud van de darmbarrière.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een betrouwbare methode voor het beoordelen van de darmbarrièrefunctie.
- De bevindingen benadrukken het belang van dieetinterventies bij het behoud van de intestinale integriteit.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Kwantitatieve beoordeling van de integriteit van de darmbarrière is cruciaal voor het beperken van risico's bij vroegtijdige programma's die gericht zijn op darmgezondheid en systemische ontsteking. De FITC-dextran-assay biedt een directe, real-time uitlezing van de intestinale permeabiliteit, waardoor therapeutische interventies en dieetwijzigingen in preklinische modellen met vertrouwen kunnen worden geëvalueerd. Deze mogelijkheid ondersteunt voorspellende besluitvorming op het snijvlak van discovery biology en translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van de darmbarrièrefunctie mogelijk als mechanistisch eindpunt.
- Ondersteunt biologische risicoreductie voor targets die de mucosale integriteit moduleren.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij de selectie van kandidaten voor darmgerelateerde indicaties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een gevalideerd, kwantitatief systeem voor het meten van de intestinale permeabiliteit in vivo.
- Standaardiseert de assay-resultaten voor reproduceerbaarheid bij screens van verbindingen en dieetinterventies.
- Maakt schaalbare, niet-invasieve evaluatie van darmbarrière-modulatoren in diermodellen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische meetwaarden uit met ziekterelevante biomarkers van darmgezondheid.
- Ondersteunt de continuïteit van discovery tot preklinische validatie van therapieën gericht op de darmbarrière.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van functionele resultaten van de darmbarrière.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze FITC-dextran-assay is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek en slaat een brug tussen mechanistische studies en translationele biomarker-validatie voor de darmbarrièrefunctie.
- Discovery Biology: Kwantificeert de impact van genetische, dieet- of farmacologische interventies op de mucosale permeabiliteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de onderlinge vergelijking van kandidaat-interventies.
- Analytics: Biedt fluorescentiegebaseerde metingen die statistische vergelijking van de integriteit van de darmbarrière tussen groepen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij klinische biomarkerstrategieën voor intestinale permeabiliteit bij de verdere ontwikkeling van kandidaten.
- Enterprise Reuse: Biedt een gestandaardiseerd, herbruikbaar platform voor de beoordeling van de darmbarrière over meerdere programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de modulatie van de darmbarrière en de validatie van targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoer van assays in preklinische workflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door directe functionele read-outs van de barrière-integriteit te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van assets die gericht zijn op darmgezondheid of systemische ontsteking.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het omgaan met dieren, orale gavage en fluorescentie-imaging.
- Toegang tot in vivo imaging-systemen en fluorescentie-plaatlezers is noodzakelijk.
- Standaardisatie van timing en monsterverwerking tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse dieet-, genetische of farmacologische interventiemodellen bij muizen.
- De timing van de monstername is cruciaal voor een nauwkeurige beoordeling van de permeabiliteit.
