Microdissectie en Whole Mount Scanning Elektronenmicroscopie Visualisatie van muis choroïde plexus

Om een beter inzicht te krijgen in de samenstelling en structuur van de choroïde plexus is een efficiënte methode om de choroid plexus uit de hersenventrikels te isoleren een eerste stap van onschatbare waarde. Met deze microdissectietechniek is het mogelijk om de plexus choroïde uit de hersenventrikels te ontleden terwijl de functie, levensvatbaarheid en structuur ervan worden vastgehouden zonder de plexus choroideus te besmetten met het omliggende weefsel. Een belangrijke hindernis bij de isolatie van de choroïde plexus is het identificeren van de structuur zoals deze nog steeds in de hersenventrikels zweeft.

Het kleuren van de plexus choroïde met broomfenolblauw vergemakkelijkt de isolatie. Elien Van Wonterghem, onze labmanager, zal de procedure demonstreren. Begin met het voorbereiden van een terminale verdoving, transcardiale perfusieoplossing en een oplossing die nodig is voor het scannen van elektronenmicroscopie, of SEM, en andere oplossingen zoals vermeld in de tekst.

Om het muizenbrein te isoleren, plaatst u het terminaal verdoofde dier in de dorsale decubituspositie en fixeert u de muis door de ledematen op een plaat vast te pinnen. Desinfecteer de borstkas door 70% ethanol te spuiten voordat u een incisie van ongeveer vier centimeter net onder het diafragma maakt met behulp van een koolstofstalen chirurgisch mes. Open de huid en stel de borstkas bloot met een chirurgische schaar.

Snijd het middenrif volledig open en scheid de thorax om de longen en het kloppende hart bloot te leggen. Gebruik een perfusiepomp transcardiaal perfuseer de muis met 10 milliliter van de perfusieoplossing met een snelheid van 4,5 milliliter per minuut. Steek een naald van 26 gauge in de linker ventrikel om de oplossing in het systemische circuit te pompen.

Knip met een chirurgische schaar het rechteratrium af zodat het bloed uit de circulatie komt. Na onthoofding van de muis snijdt u de hoofdhuid open door een incisie te maken die begint tussen de oren naar de superieur aan de ogen. Trek de huid zijdelings om de schedel bloot te leggen.

Snijd vervolgens de schedel open door de plaveiselhechtingen naar het neusgedeelte te volgen. Als je klaar bent, plaats je de hersenen in een ijskoude petrischaal en voeg je een milliliter ijskoude PBS toe aan het hersenweefsel. Om de plexus choroideus te isoleren die in de vierde ventrikel drijft, snijdt u voorzichtig het cerebellum van het cerebrum af met behulp van een scalpel.

Verwijder de resterende hersenstamweefseldelen uit het cerebellum. Draai de hersenen zodat de snijlijn naar boven is gericht, zodat de vierde ventrikelholte zichtbaar is in het midden van het gedeelte met de plexus choroïde op de dorsale plaats. Open indien nodig de ventrikel door met een scherpe tang aan het bindweefsel te trekken.

Scheur de plexus choroideus voorzichtig uit de ventrikelwand met behulp van een kleine scherpe tang. Om de plexus choroïde te isoleren van de laterale ventrikel, snijdt sagittaal de hersenen in twee hemisferen met behulp van een kleine scherpe tang. Draai één hersenhelft zodat de snijlijn omhoog is.

Om de laterale ventrikel te onthullen, trekt u voorzichtig de cortex weg van de thalamus. Trek de hippocampus terug tot de mid-sagittale snijlijn. De laterale ventrikel is nu zichtbaar met de plexus choroideus die aan de onderkant van de ventrikel ligt.

Open indien nodig de ventrikel een beetje door het bindweefsel met een scherpe tang open te trekken. Gebruik een kleine scherpe tang om de plexus choroideus voorzichtig uit de ventrikelwand te scheuren. Om de monstervoorbereiding voor SEM uit te voeren, brengt u de vers geïsoleerde choroïde plexus over in een vers gemaakte fixatieoplossing en incubeert u 's nachts bij vier graden Celsius.

Als u klaar bent, wast u het monster drie keer met drie tot vijf milliliter 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer gedurende vijf minuten elk. Breng de monsters gedurende 30 minuten aan in drie tot vijf milliliter 2% osmiumtetroxide in 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer. Was de monsters vervolgens drie keer gedurende vijf minuten elk met drie tot vijf milliliter ultrapuur water.

Droog de monsters vervolgens uit in een toenemende reeks ijskoude ethylalcoholconcentraties met 15 minuten per ethylalcoholoplossing. Gebruik een kritische puntdroger om het monster goed te drogen. Plaats het monster voorzichtig op een monsterbevestiging met een koolstofsticker en visualiseer de plexusmonsters van de choroideus met behulp van SEM.

Het huidige protocol vergemakkelijkte de efficiënte isolatie van de plexus choroideus van de laterale en vierde ventrikels van de hersenen van de muis. Perfusie met broomfenolblauw resulteerde in de visualisatie van de plexus choroideus. Wanneer broomfenolblauw niet was toegestaan in de verdere verwerkingsstappen, werd perfusie met PBS-heparine of geen perfusie uitgevoerd voor verwerking.

De SEM-morfologische analyse van het oppervlak van choroïde plexus epitheel, of CPE, cellen toont duidelijk de tweearmige structuur van de vierde ventrikel en de typische C-vormige vorm van de laterale choroïde plexus geïsoleerd van de laterale ventrikel. Een hogere SEM-vergroting onthulde vesikelachtige structuren aan de apicale kant van CPE-cellen en microvilli, wat aangeeft dat morfologische veranderingen van de CPE-cellen in ziekteomstandigheden kunnen worden onderzocht met behulp van SEM. Het is belangrijk om alleen het plexusweefsel van het vaatvlies aan te raken en eruit te halen om het monster niet te besmetten met het omliggende weefsel.

Wees voorzichtig om de structuur van de plexus choroideus te behouden. Een verscheidenheid aan downstream-technieken kan worden toegepast op de geïsoleerde choroïde plexus om de structuur en functie ervan te onderzoeken, gaande van microscoopanalyse over transcriptoomanalyse tot flowcytometrie. Door de plexus choroideus uit de hersenen te microdissecteren, kunnen we een beter inzicht krijgen in de structuur en functie van dit kleine hersenweefsel.

Deze kennis is essentieel om de rol ervan bij neurologische aandoeningen beter te begrijpen.