Onderzoek naar X-chromosomale afwijkingen in eierstokcellen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie

FISH-analyse van eierstokcellen van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen is een unieke techniek om inzicht te krijgen in het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen in deze specifieke groep. Deze technieken kunnen nuttig zijn om meer te weten te komen over het voortplantingspotentieel bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen. Het is belangrijk om te vermelden dat beide methoden bedoeld zijn om toekomstig onderzoek te vergemakkelijken en niet zijn ontworpen om te worden gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel in de klinische praktijk.

Ronald Peek, een senior onderzoeker van ons vruchtbaarheidslaboratorium, en Milad Intezar, een analist van onze afdeling pathologie, zullen de procedure demonstreren. Om te beginnen, snijd het gecryopreserveerde of ontdooide ovariële cortexweefsel in kleine stukjes van één voor één bij één millimeter met behulp van een scalpel. Enzymatisch verteren van de weefselfragmenten in vier liter voorverwarmd L15 gedurende 75 minuten bij 37 graden Celsius.

Pipetteer het verteringsmengsel elke 15 minuten op en neer. Stop de enzymatische spijsvertering door vier milliliter koud L15 toe te voegen, aangevuld met 10% foetaal runderserum of FBS. Was het gedissocieerde weefsel eenmaal met acht milliliter koud L15-medium door centrifugatie op 500 g voordat het opnieuw wordt gesuspendeerd in 500 microliter L15-medium.

Breng de celsuspensie met grotendeels individuele stromale cellen en kleine follikels over in een plastic petrischaaltje en onderzoek de suspensie onder een stereomicroscoop. Pluk de follikels van minder dan 50 micrometer handmatig met behulp van een plastic pipet van 75 micrometer en breng ze over naar de druppel L15-medium aangevuld met 10% FBS bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de gezuiverde follikels over in een oplossing van 0,06% trypsine, één milligram per milliliter EDTA en één milligram per milliliter glucose en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.

Verkrijg na incubatie eierstokstromale cellen uit de cortexcelsuspensie met behulp van een plastic pipet van 75 micrometer. Voor fluorescentie in situ hybridisatie, of FISH-analyse van individuele eierstokcellen, breng de behandelde ovariële follikels met trypsine / EDTA / glucose of stromale cellen over naar druppels van vijf microliter 0,15 millimolair kaliumchloride en 15 microliter DPBS op een dia en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Droog en fixeer de dia gedurende twee minuten in 300 microliter 0,05 millimolair kaliumchloride, 7,5% azijnzuur en 22,5% methanol.

Bedek de dia met drie-op-één methanolazijnzuur gedurende twee minuten om de fixatie te voltooien. Was het monster na fixatie tweemaal in vers bereide SSC op 73 graden Celsius. Bedek het met 100 microliter 2% Proteinase K en sluit het af met een afdekslip.

Incubeer de glijbaan gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius in het hybridisatiestation. Verwijder na de incubatie de afdekslip en was de dia gedurende vijf minuten in DPBS op kamertemperatuur onder schudden. Bevestig het monster gedurende vijf minuten met 1% formaldehyde.

Was het glaasje vervolgens in DPBS en droog het serieel uit in toenemende ethanolconcentraties gedurende twee minuten elk. Droog het monster aan de lucht voordat het wordt gehybridiseerd met fluorescerend gelabelde sondes. Voeg vervolgens een microliter CEPX, een microliter CEP18 en 18 microliter van de hybridisatiebuffer toe aan het monster en sluit af met een afdekstrook die op de dia is gelijmd.

Breng de dia over naar het hybridisatiestation voor denaturatie bij 73 graden Celsius gedurende drie minuten, gevolgd door hybridisatie tijdens een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius. Verwijder na hybridisatie de afdekslip en eventuele resterende lijm van de dia. Was de dia in 0,4x SSC, 0,3% tween-20 bij 72 graden Celsius gedurende twee minuten, gevolgd door incubatie gedurende één minuut in 2x SSC en 0,1% tween-20.

Droog de dia uit zoals gedemonstreerd en droog deze in het donker aan de lucht voordat u deze bedekt met een bevestigingsmedium dat DAPI bevat. Plaats de dia gedurende 10 minuten op min 20 graden Celsius voordat u deze analyseert met fluorescentiemicroscopie. Als u paraffinesecties wilt hybridiseren, selecteert u nieuwe secties vóór of na de sectie met follikels van het paraffinelint.

Monteer een deel op een glazen glijbaan en droog het gedurende 45 minuten op een fornuis op 56 graden Celsius. Deparaffineer de sectie gedurende 10 minuten in xyleen, dompel de dia vervolgens onder in 99,5% ethanol en spoel deze gedurende vijf minuten in leidingwater. Voorbehandel de dia met de doeloplossing gedurende 10 minuten bij 96 graden Celsius.

Spoel de glijbaan na het afkoelen af in gedestilleerd water. Behandel de dia gedurende vijf minuten met 0,01 molair zoutzuur, gevolgd door pepsinevertering gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Spoel de dia opnieuw af in zoutzuur en vervolgens in PBS.

Bevestig de dia gedurende vijf minuten in 1% formaldehyde PBS. Spoel de dia vervolgens kort af in PBS en opnieuw in gedemineraliseerd water voordat u deze uitdroogt in 99,5% ethanol. Breng vijf microliter sonde CEP18 en CEPX aan op de voorbehandelde dia.

Breng vervolgens een afdekstrook aan en sluit het gebied af met fotolijm. Plaats de dia in een veredelaar voor denaturatie op 80 graden Celsius gedurende 10 minuten en hybridisatie 's nachts op 37 graden Celsius. Spoel de volgende dag de dia twee keer gedurende vijf minuten elk in SSC bij 42 graden Celsius, gevolgd door een spoeling van twee minuten en een minuut in 0,3% Nonidet P-40 bij 73 graden Celsius.

Nogmaals, spoel de dia in 2X SSC gevolgd door spoelen in gedestilleerd water voordat u het uitdroogt met 99,5% ethanol. Droog de glijbaan aan de lucht en monteer deze in DAPI-bevattend montagemedium. Gecryopreserveerd ovariële cortexweefsel bij patiënt A toonde 50% van de lymfocyten, had een 45, X karyotype en 50% had 46, XX.In patiënt B, 38% van de lymfocyten waren 45, X, 28% waren 46, XX en 34% waren 47, XXX.

Omliggende stromale cellen werden ook geanalyseerd op X-chromosomale inhoud. Enzymatische vertering van ovariële cortexweefsel resulteerde in een suspensie van grotendeels gedissocieerde cellen, maar liet de primordiale follikels achter, bestaande uit een intacte eicel omgeven door een enkele laag granulosecellen. Kleine follikels gaven problemen bij het interpreteren van signalen na FISH, vanwege het samenklonteren van de granulosecellen.

Extra vertering van de follikels met trypsine vóór FISH resulteerde in individuele granulosecellen die samentrokken tot een bolvormige morfologie op het oppervlak van de follikels. Hematoxyline eosine kleuring toonde morfologisch normale secundaire en antrale follikels in ovariële cortex weefsel na vijf maanden xenografting. Het X-chromosomale gehalte van granulosecellen van deze follikels werd bepaald door FISH-analyse.

Het fixeren van geënt ovariële cortexweefsel in Bouin-oplossing resulteerde in wazige en grotendeels verduisterde fluorescerende signalen in folliculaire cellen als gevolg van een groene waas. Daarentegen leverde ovariële cortexweefsel gefixeerd in formaldehyde uitstekende fluorescerende signalen. De belangrijkste uitdaging van dit protocol ligt in de isolatie van eierstokcellen en de enzymatische vertering van het weefsel.

Afwijken van dit protocol kan tijdens het proces een aanzienlijk verlies van eierstokcellen veroorzaken, en dit moet vooral worden vermeden bij vrouwen die al een lage ovariële reserve hebben. Aanvullende genexpressieprofilering kan nuttig zijn om meer te weten te komen over de impact van aneuploïde eierstokcellen op folliculogenese, en dus het proces van voortijdig ovarieel falen bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen.