Name: Onderzoek naar X-chromosomale afwijkingen in eierstokcellen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Leer FISH-analyse van eierstokcellen bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen. Deze methode onthult het X-chromosomale gehalte en ondersteunt vruchtbaarheidsonderzoek in de reproductieve biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef en Milan Intezar voor hun expertise en technische assistentie. Financieringsbronnen: Merck Serono (A16-1395), Goodlife en Ferring.

Het TurnerFertility studieprotocol is goedgekeurd door de Centrale Commissie Onderzoek met Mensen (NL57738.000.16). In deze studie werd het ovariële cortexweefsel van 93 vrouwen met TS verkregen. Materialen waarvoor veiligheidsmaatregelen nodig zijn, staan vermeld in tabel 1.
Tabel 1: Veiligheidsmaatregelen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Materiaal</td>
			<td colspan="3">Gevaar</td>
		</tr><tr><td>Azijnzuur</td>
			<td colspan="3">Ernstige brandwonden op de huid en irritatie van de luchtwegen</td>
		</tr><tr><td>Collagenase</td>
			<td colspan="3">Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid</td>
		</tr><tr><td>DAPI</td>
			<td colspan="3">Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid</td>
		</tr><tr><td>DNase I</td>
			<td colspan="3">Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid</td>
		</tr><tr><td>Ethanol</td>
			<td colspan="3">Ontvlambaar</td>
		</tr><tr><td>Formaldehyde</td>
			<td colspan="3">Giftig na inademing, inname en huidcontact</td>
		</tr><tr><td>Formamide (in fluorescentiesondes)</td>
			<td colspan="3">Kan het ongeboren kind schaden</td>
		</tr><tr><td>Liberase</td>
			<td colspan="3">Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid</td>
		</tr><tr><td>Methanol</td>
			<td colspan="3">Licht ontvlambaar, giftig bij inademing, inslikken en huidcontact</td>
		</tr><tr><td>Nonidet P40</td>
			<td colspan="3">Irriterend voor de huid of ogen</td>
		</tr><tr><td>Pepsine</td>
			<td colspan="3">Irriterend voor de ogen, luchtwegen en huid</td>
		</tr><tr><td>Proteïnase K</td>
			<td colspan="3">Ademhalingsmoeilijkheden na inademing</td>
		</tr><tr><td>Xyleen</td>
			<td colspan="3">Licht ontvlambaar, giftig na inademing en huidcontact. Vermijd contact met de ogen.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Materialen waarvoor veiligheidsmaatregelen nodig zijn.
1. FISH op geïsoleerde individuele ovariële cortexcellen
<ol><li>Dissociatie van ovariële cortexweefsel om individuele cellen te verkrijgen<ol><li>Snijd het gecryopreserveerde/ontdooide ovariële cortexweefsel in kleine stukjes van ongeveer 1 mm x 1 mm x 1 mm met behulp van een scalpel.</li>
		<li>Enzymatisch verteren van de weefselfragmenten in 4 ml voorverwarmd (37 °C) L15-medium met 0,1 mg/ml weefseldissociatie-enzymmengsel, 10 μg/ml DNase I en 1 mg/ml collagenase I van C. histolyticum gedurende maximaal 75 minuten bij 37 °C. Pipetteer de verteringsmix elke 15 minuten op en neer.</li>
		<li>Stop de enzymatische spijsvertering door toevoeging van 4 ml koud L15 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Was het gedissocieerde weefsel eenmaal met 8 ml koud L15-medium door centrifugeren op 500 x g en resuspenderen in 500 μL L15-medium zonder vortexing om schade aan de cellen te voorkomen.</li>
		<li>Breng de celsuspensie met grotendeels individuele stromale cellen en kleine follikels (eicellen omgeven door een enkele laag granulosacellen) over naar een plastic petrischaal en onderzoek de celsuspensie onder een stereomicroscoop (100x vergroting).</li>
		<li>Pak de kleine follikels (<50 μm) handmatig op met behulp van een plastic pipet van 75 μm en breng de follikels over in een druppel L15-medium aangevuld met 10% FBS bij 4 °C om de aggregatie van follikels te voorkomen. Voer follikel pick-up uit voor een maximum van 30 minuten. Om de folliculaire celverspreiding voorafgaand aan FISH-analyse te verbeteren, brengt u de gezuiverde follikels over in een oplossing van 0,06% trypsine, 1 mg / ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 1 mg / ml glucose en incubeert u gedurende 20 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Verkrijg ovariële stromale cellen uit de cortexcelsuspensie met behulp van een plastic pipet van 75 μm, waarbij speciale zorg wordt besteed aan het voorkomen van besmetting met kleine follikels.</li>
	</ol></li>
	<li>FISH-analyse van individuele eierstokcellen<ol><li>Breng de behandelde ovariële follikels (aanbevolen n = 5-20) met trypsine/EDTA/glucose of stromale cellen (n > 1.000) over in druppeltjes van 5 μL van 0,15 mM KCl/15 μL dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) op een glaasje en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Droog en fixeer de glaasjes gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT) in 300 μL van 0,05 mM KCl/7,5% azijnzuur/22,5% methanol. Bedek de dia's met methanol/azijnzuur (3:1) gedurende 2 minuten bij RT om de fixatie te voltooien.</li>
		<li>Maak 20x standaard natriumcitraat (SSC) door 876 g natriumchloride en 441 g trinatriumcitraatdihydraat toe te voegen aan 5 L gedestilleerd water. Voeg vervolgens 100 ml van de 20x SSC toe aan 900 ml gedemineraliseerd (demi) water om 2x SSC te verkrijgen. Was het monster in 2x SSC bij 73 °C, bedek het met 100 μL 2% proteïnase K en sluit het af met een dekplaat. Incubeer de dia's gedurende 10 minuten bij 37 °C in het hybridisatiestation.</li>
		<li>Verwijder de afdeklaag en was de dia's gedurende 5 minuten in DPBS bij RT. Fixeer het monster gedurende 5 minuten met 1% formaldehyde bij RT. In dit stadium is het materiaal nog niet volledig bevestigd aan de glasplaten en mag het daarom niet op een schudplatform worden geplaatst.</li>
		<li>Was de dia's gedurende 5 minuten in DPBS bij RT, gevolgd door uitdroging in de daaropvolgende 70%, 80%, 90% en 100% ethanol gedurende elk 2 minuten. Droog het gedehydrateerde monster aan de lucht en hybridiseer het met fluorescerend gelabelde sondes.</li>
		<li>Selecteer een centromeerspecifieke sonde voor chromosoom X en een andere chromosoomspecifieke centromere sonde als controle om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te bepalen. In dit geval worden centromeerspecifieke sondes voor chromosoom X (CEP X [DXZ1]) direct gelabeld met fluorochroom SpectrumGreen en chromosoom 18 (CEP 18 [D18Z1]) direct gelabeld met fluorochroom SpectrumOrange gebruikt.</li>
		<li>Voeg 1 μL CEP X, 1 μL CEP 18 en 18 μL van de hybridisatiebuffer toe aan het monster en sluit af met een coverslip die op de dia's is gelijmd om verdamping van de sonde tijdens hybridisatie te voorkomen. Breng de dia's over naar het hybridisatiestation voor denaturatie bij 73 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door hybridisatie tijdens een nachtelijke incubatie bij 37 °C.</li>
		<li>Verwijder de afdekplaat en eventuele resterende lijm van de glijbaan na hybridisatie. Was de dia's in 0,4x SSC/0,3% Tween-20 op 72 °C gedurende 2 min, gevolgd door incubatie gedurende 1 min in 2x SSC/0,1% Tween-20 bij RT.</li>
		<li>Droog de dia's uit door opeenvolgende incubaties van 2 minuten in 70%, 80%, 90% en 100% ethanol en droog ze in het donker aan de lucht. Bedek de dia's met een bevestigingsmedium dat 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat. Bewaren bij -20 °C gedurende ten minste 10 minuten vóór analyse door middel van fluorescentiemicroscopie.</li>
	</ol></li>
	<li>Beeldvorming<ol><li>Onderzoek de signalen voor het X-chromosoom met een fluorescentiemicroscoop die is gekoppeld aan een beeldverwerkingssoftware.<ol><li>Selecteer eerst fluorochroom DAPI.<ol><li>Verkrijg een afbeelding door Nieuwe cel te selecteren > Live > Capture bij een vergroting van 630x. Er verschijnt een nieuw venster met de drempel. Stel de blauwe balk van de drempel in op 0 om de achtergrond te minimaliseren en de rode balk op maximaal (255) om de signalen helderder te maken. Klik op Accepteren.</li>
				<li>Er verschijnt een nieuw venster met verbetering met een suggestie voor donkerder/helderder (12), straal (3) en diepte (1). Gebruik de voorgestelde waarden of pas ze aan als u niet tevreden bent.</li>
			</ol></li>
			<li>Selecteer ten tweede fluorochroom SpectrumOrange en klik op Capture.<ol><li>Stel de blauwe balk van de drempel in op 0 om de achtergrond te minimaliseren en de rode balk op maximaal (255) om de signalen helderder te maken. Klik op Accepteren.</li>
				<li>Het venster met verbetering wordt weergegeven met een suggestie voor donkerder / helderder (-11), straal (2,7) en diepte (0,6). Gebruik de voorgestelde waarden of pas ze aan als u niet tevreden bent.</li>
			</ol></li>
			<li>Selecteer ten slotte fluorochroom SpectrumGreen en klik op Capture.<ol><li>Stel de blauwe balk van de drempel in op 0 om de achtergrond te minimaliseren en de rode balk op maximaal (255) om de signalen helderder te maken. Klik op Accepteren.</li>
				<li>Het venster met verbetering wordt weergegeven met een suggestie voor donkerder/helderder (0), straal (3) en diepte (0). Gebruik de voorgestelde waarden of pas deze aan als u niet tevreden bent. Sla de afbeelding op in een nieuw gemaakt bestand. OPMERKING: Somatische cellen werden alleen geëvalueerd wanneer twee signalen van het controlechromosoom 18 zichtbaar waren. In de meeste eicellen kon slechts één signaal voor elk chromosoom worden gedetecteerd.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>Bewaar de dia's in het donker bij 4 °C na analyse om verlies van signalen te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. FISH op paraffinesecties van geënt ovariële cortexweefsel
OPMERKING: Eén fragment van gecryopreserveerd/ontdooid ovariële cortexweefsel van 18 vrouwtjes met TS werd gedurende 5 maanden xenogetransplanteerd in ernstige gecombineerde immunodeficiënte (SCID) muizen. De procedure van xenografting is eerder beschreven en werd uitgevoerd aan de Université Catholique de Louvain (Brussel, België) volgens de lokale richtlijnen van het Comité voor dieronderzoek inzake dierenwelzijn (referentie 2014/UCL/MD/007)18,19.
<ol><li>Het selecteren van secties van xenogetransplanteerd ovariële cortexweefsel dat follikels bevat<ol><li>Fixeer xenogetransplanteerd ovariële cortexweefsel in 4% formaldehyde en sluit het weefsel in paraffine in. Snijd de blokken bij met een scalpel om extra paraffine te verwijderen en snijd het paraffineblok op een rotatiemicrotoom tot 4 μm dikte.</li>
		<li>Selecteer elke zevende sectie van het paraffinelint voor hematoxyline en eosine (HE) kleuring om te bepalen welke secties follikels bevatten. Plaats de sectie in een waterbad bij 40-45 °C en monteer ze op immunohistochemische microscoopglaasjes.</li>
	</ol></li>
	<li>Deparaffinisatie en HE-kleuring<ol><li>Zet de dia's 10 minuten op een fornuis bij 60 °C en dompel de dia's daarna 5 minuten onder in 100% xyleen. Het is niet nodig om de dia's direct op de kachel te plaatsen. Hydrateer de secties gedurende 15 s in 100% ethanol, gevolgd door 2 x 15 s in 96% ethanol. Spoel de glijbanen af in leidingwater gedurende 2 min.</li>
		<li>Bevlek de dia's gedurende 10 minuten in hematoxyline en spoel de dia's daarna kort af in leidingwater. Dompel de dia's kort onder in een bicarbonaatoplossing (100 g magnesiumsulfaat en 10 g natriumbicarbonaat in 5 L gedestilleerd water). Spoel de glijbanen af in leidingwater gedurende 5 min.</li>
		<li>Counter de dia's met eosine gedurende 4 minuten en droog de dia's drie keer uit met 100% ethanol, gevolgd door xyleen. Bedek de HE-vlekken op de dia's en evalueer de HE-secties onder een lichtmicroscoop om de secties met follikels (100x vergroting) te selecteren.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbehandeling en hybridisatie van paraffinesecties voor DNA FISH<ol><li>Selecteer nieuwe secties die vóór of na de sectie liggen die follikels van het paraffinelint bevat. Monteer een sectie op een glazen dia. Droog de paraffinesecties minstens 45 minuten op een fornuis op 56 °C. Het is niet nodig om de dia's direct op de kachel te plaatsen.</li>
		<li>Deparaffineer de secties in xyleen gedurende 10 minuten. Dompel de dia's onder in 99,5% ethanol en spoel ze 5 minuten af in leidingwater. Voorbehandel de dia's met de doeloplossing (lage pH) gedurende 10 minuten bij 96 °C. Spoel na het afkoelen de glaasjes af in gedestilleerd water.</li>
		<li>Behandel de dia's gedurende 5 minuten met 0,01 M zoutzuur, gevolgd door pepsinevertering (200 E/ml) gedurende 15 minuten bij 37 °C. Spoel de glaasjes opnieuw af in 0,01 M zoutzuur en vervolgens in PBS.</li>
		<li>Fixeer de glaasjes gedurende 5 minuten in 1% formaldehyde/PBS. Spoel de dia's kort af in PBS en vervolgens opnieuw in demi-water. Droog de glaasjes uit in 99,5% ethanol en laat ze aan de lucht drogen.</li>
		<li>Selecteer een centromeerspecifieke sonde voor chromosoom X en een andere chromosoomspecifieke centromere sonde als controle om het X-chromosomale gehalte van granulosacellen te bepalen. Hier wordt chromosoom 18 als controle gebruikt.</li>
		<li>Breng 5 μL sonde CEP 18 (D18Z1) direct gelabeld met fluorochroom SpectrumGreen en sonde CEP X (DXZ1) direct gelabeld met fluorochroom SpectrumRed aan op de voorbehandelde dia's. Breng een coverslip aan en sluit het gebied af met fotolijm. Plaats de dia's in een veredelaar voor denaturatie bij 80 °C gedurende 10 minuten en hybridisatie 's nachts bij 37 °C.</li>
		<li>Spoel de dia's de volgende dag 5 min af in 2x SSC bij 42 °C, gevolgd door een spoeling van 2 min en 1 min in 0,3% Nonidet P40 bij 73 °C. Ververs de 2x SSC en spoel de dia's opnieuw gedurende 5 minuten af op kamertemperatuur. Dek de cuvette af zodat de secties in het donker worden gehouden.</li>
		<li>Spoel de glaasjes kort af in gedestilleerd water. Droog de glaasjes uit in 99,5% ethanol en laat ze weer aan de lucht drogen. Monteer ten slotte de dia's met een oplossing die DAPI en montagemedium bevat.</li>
	</ol></li>
	<li>Beeldvorming<ol><li>Analyseer de resultaten onder een fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 630x. Open de beeldverwerkingssoftware op de computer. Selecteer FISH als profiel.</li>
		<li>Controleer of de DAPI-emissie is ingesteld op 431 nm en de excitatie op 359 nm, Texas red-emissie op 613 nm en excitatie op 595 nm, en FITC-emissie op 519 nm en excitatie op 495 nm.</li>
		<li>Verkrijg een afbeelding door Live > Eén afbeelding vastleggen te selecteren. Optimaliseer de beeldkwaliteit door de belichting en versterking aan te passen door de schuifregelaar Belichting en de schuifregelaar Versterking in het menu Afbeelding aan de linkerkant te verplaatsen (bijvoorbeeld belichting: 212 ms en versterking: 7,9). De benodigde belichting en versterking kan per beeld verschillen; Observeer de veranderingen tijdens dit proces om een geoptimaliseerd beeld te verkrijgen. Sla de afbeelding op in een nieuw gemaakt bestand.</li>
		<li>Bewaar de dia's in het donker bij 4 °C na analyse om verlies van signalen te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+and+infertility%3A+Definition+and+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li>
<li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+female+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li>
<li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility%2C+testing%2C+and+management%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+National+Research+Centre%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65(2021).</li>
<li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li>
<li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675(2011).</li>
<li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45%2CX+karyotype%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li>
<li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+X+syndrome%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li>
<li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+History%2C+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nano+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3(2014).</li>
<li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Urology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li>
<li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm%3A+diagnostics%2C+indications%2C+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li>
<li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li>
<li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurnerFertility+trial%3A+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855(2019).</li>
<li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner%27s+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45%2CX+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li>
<li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+some+patients+with+45%2CX+Turner+syndrome+fertile%3F+A+young+girl+with+classical+45%2CX+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li>
<li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li>
<li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice%3A+comparison+between+four+grafting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li>
<li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+tissue+damage+after+grafting%3A+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li>
<li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Horizons%22%5BJournal%5D)">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li>
<li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

FISH-analyse is een bekende techniek om X-chromosomale afwijkingen in lymfocyten of buccale cellen van zowel mannen als vrouwen te detecteren10. Verschillende studies hebben FISH beschreven op gameten van mannen met X-chromosomale afwijkingen, maar gedetailleerde informatie verkregen door FISH over eierstokcellen van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen ontbreekt nogsteeds 14. Dit artikel presenteert nieuwe methoden op basis van FISH om te bepalen of aneuploïdie aanwezig ...

Onvruchtbaarheid is een gezondheidsprobleem van het mannelijke of vrouwelijke voortplantingssysteem, dat wereldwijd ongeveer 186 miljoen personen in de vruchtbare leeftijd treft1. Bij ten minste 35% van de onvruchtbare paren wordt onvruchtbaarheid veroorzaakt door een aandoening van het vrouwelijke voortplantingssysteem2. Er zijn veel factoren die vrouwelijke onvruchtbaarheid kunnen veroorzaken, zoals genetische factoren, afwijkingen van het genitale kanaal, endocriene disfunctie, ontstekingsziekten en iatrogene behandeling3.
Genetische afwijkingen zijn aanwezig bij ongeveer 10% van de onvruchtbare vrouwen 4,5. Van alle genetische afwijkingen zijn X-chromosoomafwijkingen de meest voorkomende oorzaak van ovariële dysgenese2. Verschillende studies hebben gemeld dat X-chromosomale afwijkingen bij vrouwen met het syndroom van Turner (TS) of het Triple X-syndroom geassocieerd zijn met voortijdig ovarieel falen als gevolg van een versneld verlies van geslachtscellen of verminderde oogenese 6,7,8.
Afwijkingen van het X-chromosoom zijn onder te verdelen in: 1) numerieke aberraties, waarbij het aantal X-chromosomen verschillend is maar de X-chromosomen intact zijn; en 2) structurele afwijkingen, waarbij het X-chromosoom genetisch materiaal heeft gewonnen of verloren 3,9. Numerieke afwijkingen van het X-chromosoom komen vaker voor dan structurele afwijkingen en worden vaak veroorzaakt door spontane fouten tijdens celdeling 3,9. Wanneer een dergelijke fout optreedt tijdens meiose, kan dit leiden tot aneuploïde gameten en uiteindelijk tot nakomelingen met chromosomale afwijkingen in alle cellen. Wanneer chromosoomdefecten optreden in somatische cellen als gevolg van fouten die optreden tijdens mitose in de vroege stadia van ontogenese, kan dit leiden tot mozaïcisme. Bij deze personen zijn zowel cellen met een normaal X-chromosomale inhoud als cellen met X-chromosomale afwijkingen aanwezig.
In de jaren 1980 werd een cytogenetische techniek genaamd fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) ontwikkeld om specifieke nucleïnezuursequenties op metafase- en interfasechromosomen10,11 te visualiseren en te lokaliseren. Deze techniek maakt gebruik van fluorescerend gelabelde DNA-sondes om te binden aan een specifieke sequentie in het chromosoom, die vervolgens kan worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Tegenwoordig wordt FISH veel gebruikt als een klinisch diagnostisch hulpmiddel en wordt het beschouwd als de gouden standaard bij het detecteren van chromosomale afwijkingen10. Op het gebied van reproductieve geneeskunde is FISH-analyse op sperma gebruikt om inzicht te krijgen in het X-chromosomale gehalte van spermatozoa bij mannen met numerieke of structurele chromosomale afwijkingen in somatische cellen12,13,14. Deze studies toonden aan dat mannen met chromosomale afwijkingen meer kans hadden op een hogere frequentie van aneuploïde spermatozoa in hun sperma in vergelijking met mannen met normale karyotypen12,13,14.
In tegenstelling tot spermatozoa is er zeer weinig bekend over het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen (inclusief eicellen, granulosa / theca-cellen en stromale cellen) bij personen met een chromosomale aberratie, evenals de mogelijke gevolgen van aneuploïdie van deze cellen op hun voortplantingspotentieel. Een belangrijke reden voor de schaarse informatie over het karyotype van eierstokcellen in vergelijking met spermatozoa is het feit dat vrouwen een invasieve procedure moeten ondergaan, zoals een follikelpunctie of een operatie om eicellen of ovariële cortexweefsel te verkrijgen. Vrouwelijke gameten zijn daarom moeilijk te verkrijgen voor onderzoeksdoeleinden.
Momenteel wordt in Nederland een observationele interventiestudie uitgevoerd om de werkzaamheid van cryopreservatie van eierstokweefsel bij jonge vrouwen met TS15 te onderzoeken. Eén fragment van het ovariële cortexweefsel van de patiënt was beschikbaar om de X-chromosomale inhoud van de eierstokcellen te identificeren16,17. Als onderdeel van de studie werd een nieuwe methode ontwikkeld op basis van FISH van gedissocieerd ovariële cortexweefsel om te bepalen of chromosomale afwijkingen aanwezig zijn in eierstokcellen bij vrouwen met een chromosomale afwijking in niet-ovariële somatische cellen, zoals lymfocyten of buccale cellen. Daarnaast werd ook het effect van aneuploïdie in eierstokcellen op folliculogenese bepaald. Hiertoe werd een gevestigd FISH-protocol gewijzigd dat de analyse van histologische secties van ovariële cortexweefsel mogelijk maakt na kunstmatig geïnduceerde folliculogenese tijdens langdurige xenotransplantatie bij immuungecompromitteerde muizen. In deze studie presenteren we twee methoden op basis van FISH om het X-chromosomale gehalte in eierstokcellen in niet-geënt en geënt ovariële cortexweefsel bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen te bepalen, met als doel de basiswetenschap over dit onderwerp te verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Biosolve BV</td><td>0001070602BS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 1200</td><td>Hettich Universal</td><td>4140</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase I</td><td>Sigma</td><td>131470</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>VWR</td><td>0631-0146</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-513Q</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108421</td><td></td></tr><tr><td>Eosina-Y</td><td>Sigma</td><td>1159350100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMSURE</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life technology</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop voor secties DM4 B</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop scope A1</td><td>Zeiss AXIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie gelabelde proben voor gedissocieerde cellen</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie gelabelde proben voor weefselsecties</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)&nbsp; 05J10-028</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Lijm (Fixogum)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LK071A</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxiline</td><td>Sigma</td><td>1159380025</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatiebuffer</td><td>Abott Diagnostics</td><td>32-804826/06J67-001</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatie Station&nbsp;</td><td>Dako</td><td>S2451</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware individuele ovarium cortex cellen (Cytovision 7.7)</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware op paraffine secties&nbsp;</td><td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunohistochemische microscoopslides</td><td>Dako</td><td>K802021-2</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>Lonza</td><td>12-700Q</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche</td><td>05 401 151 001</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Zeiss West Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Merck</td><td>A335586</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Honeywell</td><td>14262-1L</td><td></td></tr><tr><td>Montagemedium</td><td>Vectashield, Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma</td><td>7385-1L</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Poth Hile</td><td>2712.20.10</td><td></td></tr><tr><td>Pepsine</td><td>Sigma</td><td>P7000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11530546</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof pipette</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-4075/1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Rotatie microtoom HM 355S</td><td>Thermo sceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Dahlhausen</td><td>11.000.00.515</td><td></td></tr><tr><td>Slide voor FISH op gedissocieerde cellen</td><td>Thermo scientific</td><td>J1810AM1JZ</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>55761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Standaard natriumcitraat (SSC)</td><td>Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>10515203</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop IX 70</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Target Retrieval Solution &nbsp;&nbsp;</td><td>Dako</td><td>GV80511-2</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher</td><td>85113</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>BOOM</td><td>760518191000</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek naar x-chromosomale afwijkingen in eierstokcellen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Miljoenen mensen wereldwijd hebben te maken met problemen met betrekking tot vruchtbaarheid. Verminderde vruchtbaarheid, of zelfs onvruchtbaarheid, kan te wijten zijn aan veel verschillende oorzaken, waaronder genetische aandoeningen, waarvan chromosomale afwijkingen de meest voorkomende zijn. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een bekende en veelgebruikte methode om chromosomale afwijkingen bij de mens op te sporen. FISH wordt voornamelijk gebruikt voor de analyse van chromosomale afwijkingen in de spermatozoa van mannen met numerieke of structurele chromosomale afwijkingen. Bovendien wordt deze techniek ook vaak toegepast bij vrouwen om X-chromosomale afwijkingen te detecteren waarvan bekend is dat ze ovariële dysgenese veroorzaken. Informatie over het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen in lymfocyten en/of buccale cellen ontbreekt echter nog.
Het doel van deze studie is om fundamenteel onderzoek met betrekking tot X-chromosomale afwijkingen bij vrouwen te bevorderen, door twee methoden op basis van FISH te presenteren om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te identificeren. Eerst wordt een methode beschreven om het X-chromosomale gehalte van geïsoleerde eierstokcellen (eicellen, granulosacellen en stromale cellen) te bepalen in niet-geënt ovariële cortexweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen. De tweede methode is gericht op het evalueren van het effect van chromosomale afwijkingen op folliculogenese door het bepalen van het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen van nieuw gevormde secundaire en antrale follikels in eierstokweefsel, van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen na langdurige transplantatie in immuungecompromitteerde muizen. Beide methoden kunnen nuttig zijn in toekomstig onderzoek om inzicht te krijgen in het voortplantingspotentieel van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen.

FISH op geïsoleerde eierstokcellen voorafgaand aan het enten Gecryopreserveerd ovariële cortexweefsel van vrouwen met 45,X/46,XX (patiënt A) of 45,X/46,XX/47,XXX (patiënt B) TS werden gebruikt om de resultaten met behulp van dit protocol te illustreren. Bij patiënt A had 50% van de lymfocyten een 45,X karyotype en 50% 46,XX. Bij patiënt B was 38% van de lymfocyten 45,X, 28% 46,XX en 34% 47,XXX. Centromeerspecifieke sondes voor chromosoom X (groen) en chromosoom 18 als controle (rood) werden gebruikt o...

Dit artikel presenteert twee methoden op basis van fluorescentie in situ hybridisatie om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te bepalen in niet-geënt en geënt ovariumschorsweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen.

Onderzoek naar X-chromosomale afwijkingen in eierstokcellen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

FISH-analyse van eierstokcellen van vrouwtjes met X-chromosomale afwijkingen is een unieke techniek om inzicht te krijgen in het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen in deze specifieke groep. Deze technieken kunnen nuttig zijn om meer te weten te komen over het voortplantingspotentieel bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen. Het is belangrijk om te vermelden dat beide methoden bedoeld zijn om toekomstig onderzoek te vergemakkelijken en niet zijn ontworpen om te worden gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel in de klinische praktijk.Ronald Peek, een senior onderzoeker van ons vruchtbaarheidslaboratorium, en Milad Intezar, een analist van onze afdeling pathologie, zullen de procedure demonstreren. Om te beginnen, snijd het gecryopreserveerde of ontdooide ovariële cortexweefsel in kleine stukjes van één voor één bij één millimeter met behulp van een scalpel. Enzymatisch verteren van de weefselfragmenten in vier liter voorverwarmd L15 gedurende 75 minuten bij 37 graden Celsius.Pipetteer het verteringsmengsel elke 15 minuten op en neer. Stop de enzymatische spijsvertering door vier milliliter koud L15 toe te voegen, aangevuld met 10% foetaal runderserum of FBS. Was het gedissocieerde weefsel eenmaal met acht milliliter koud L15-medium door centrifugatie op 500 g voordat het opnieuw wordt gesuspendeerd in 500 microliter L15-medium.Breng de celsuspensie met grotendeels individuele stromale cellen en kleine follikels over in een plastic petrischaaltje en onderzoek de suspensie onder een stereomicroscoop. Pluk de follikels van minder dan 50 micrometer handmatig met behulp van een plastic pipet van 75 micrometer en breng ze over naar de druppel L15-medium aangevuld met 10% FBS bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de gezuiverde follikels over in een oplossing van 0,06% trypsine, één milligram per milliliter EDTA en één milligram per milliliter glucose en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.Verkrijg na incubatie eierstokstromale cellen uit de cortexcelsuspensie met behulp van een plastic pipet van 75 micrometer. Voor fluorescentie in situ hybridisatie, of FISH-analyse van individuele eierstokcellen, breng de behandelde ovariële follikels met trypsine / EDTA / glucose of stromale cellen over naar druppels van vijf microliter 0,15 millimolair kaliumchloride en 15 microliter DPBS op een dia en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Droog en fixeer de dia gedurende twee minuten in 300 microliter 0,05 millimolair kaliumchloride, 7,5% azijnzuur en 22,5% methanol.Bedek de dia met drie-op-één methanolazijnzuur gedurende twee minuten om de fixatie te voltooien. Was het monster na fixatie tweemaal in vers bereide SSC op 73 graden Celsius. Bedek het met 100 microliter 2% Proteinase K en sluit het af met een afdekslip.Incubeer de glijbaan gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius in het hybridisatiestation. Verwijder na de incubatie de afdekslip en was de dia gedurende vijf minuten in DPBS op kamertemperatuur onder schudden. Bevestig het monster gedurende vijf minuten met 1% formaldehyde.Was het glaasje vervolgens in DPBS en droog het serieel uit in toenemende ethanolconcentraties gedurende twee minuten elk. Droog het monster aan de lucht voordat het wordt gehybridiseerd met fluorescerend gelabelde sondes. Voeg vervolgens een microliter CEPX, een microliter CEP18 en 18 microliter van de hybridisatiebuffer toe aan het monster en sluit af met een afdekstrook die op de dia is gelijmd.Breng de dia over naar het hybridisatiestation voor denaturatie bij 73 graden Celsius gedurende drie minuten, gevolgd door hybridisatie tijdens een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius. Verwijder na hybridisatie de afdekslip en eventuele resterende lijm van de dia. Was de dia in 0,4x SSC, 0,3% tween-20 bij 72 graden Celsius gedurende twee minuten, gevolgd door incubatie gedurende één minuut in 2x SSC en 0,1% tween-20.Droog de dia uit zoals gedemonstreerd en droog deze in het donker aan de lucht voordat u deze bedekt met een bevestigingsmedium dat DAPI bevat. Plaats de dia gedurende 10 minuten op min 20 graden Celsius voordat u deze analyseert met fluorescentiemicroscopie. Als u paraffinesecties wilt hybridiseren, selecteert u nieuwe secties vóór of na de sectie met follikels van het paraffinelint.Monteer een deel op een glazen glijbaan en droog het gedurende 45 minuten op een fornuis op 56 graden Celsius. Deparaffineer de sectie gedurende 10 minuten in xyleen, dompel de dia vervolgens onder in 99,5% ethanol en spoel deze gedurende vijf minuten in leidingwater. Voorbehandel de dia met de doeloplossing gedurende 10 minuten bij 96 graden Celsius.Spoel de glijbaan na het afkoelen af in gedestilleerd water. Behandel de dia gedurende vijf minuten met 0,01 molair zoutzuur, gevolgd door pepsinevertering gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Spoel de dia opnieuw af in zoutzuur en vervolgens in PBS.Bevestig de dia gedurende vijf minuten in 1% formaldehyde PBS. Spoel de dia vervolgens kort af in PBS en opnieuw in gedemineraliseerd water voordat u deze uitdroogt in 99,5% ethanol. Breng vijf microliter sonde CEP18 en CEPX aan op de voorbehandelde dia.Breng vervolgens een afdekstrook aan en sluit het gebied af met fotolijm. Plaats de dia in een veredelaar voor denaturatie op 80 graden Celsius gedurende 10 minuten en hybridisatie 's nachts op 37 graden Celsius. Spoel de volgende dag de dia twee keer gedurende vijf minuten elk in SSC bij 42 graden Celsius, gevolgd door een spoeling van twee minuten en een minuut in 0,3% Nonidet P-40 bij 73 graden Celsius.Nogmaals, spoel de dia in 2X SSC gevolgd door spoelen in gedestilleerd water voordat u het uitdroogt met 99,5% ethanol. Droog de glijbaan aan de lucht en monteer deze in DAPI-bevattend montagemedium. Gecryopreserveerd ovariële cortexweefsel bij patiënt A toonde 50% van de lymfocyten, had een 45, X karyotype en 50% had 46, XX.In patiënt B, 38% van de lymfocyten waren 45, X, 28% waren 46, XX en 34% waren 47, XXX.Omliggende stromale cellen werden ook geanalyseerd op X-chromosomale inhoud. Enzymatische vertering van ovariële cortexweefsel resulteerde in een suspensie van grotendeels gedissocieerde cellen, maar liet de primordiale follikels achter, bestaande uit een intacte eicel omgeven door een enkele laag granulosecellen. Kleine follikels gaven problemen bij het interpreteren van signalen na FISH, vanwege het samenklonteren van de granulosecellen.Extra vertering van de follikels met trypsine vóór FISH resulteerde in individuele granulosecellen die samentrokken tot een bolvormige morfologie op het oppervlak van de follikels. Hematoxyline eosine kleuring toonde morfologisch normale secundaire en antrale follikels in ovariële cortex weefsel na vijf maanden xenografting. Het X-chromosomale gehalte van granulosecellen van deze follikels werd bepaald door FISH-analyse.Het fixeren van geënt ovariële cortexweefsel in Bouin-oplossing resulteerde in wazige en grotendeels verduisterde fluorescerende signalen in folliculaire cellen als gevolg van een groene waas. Daarentegen leverde ovariële cortexweefsel gefixeerd in formaldehyde uitstekende fluorescerende signalen. De belangrijkste uitdaging van dit protocol ligt in de isolatie van eierstokcellen en de enzymatische vertering van het weefsel.Afwijken van dit protocol kan tijdens het proces een aanzienlijk verlies van eierstokcellen veroorzaken, en dit moet vooral worden vermeden bij vrouwen die al een lage ovariële reserve hebben. Aanvullende genexpressieprofilering kan nuttig zijn om meer te weten te komen over de impact van aneuploïde eierstokcellen op folliculogenese, en dus het proces van voortijdig ovarieel falen bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen.

exploring-x-chromosomal-aberrations-ovarian-cells-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe je een sperma monster proces om goede kwaliteit te bereiken...

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

We ontwikkelden een eenvoudig aan te passen streng-specifieke fluorescente in situ hybridisatie (FISH) protocol gecombineerd met immunofluorescentie. Dit maakt een gedetailleerde onderzoek mogelijk van RNA-dynamica met gelijktijdige inzicht in de chromatinestructuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie op enkelcellig niveau.

Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie

Het huidige protocol beschrijft de bruikbaarheid van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY) bij het identificeren van inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling.

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Hier presenteren we een protocol voor het verbeteren van het succes van interfase fluorescentie in situ hybridisatiedetectie op beenmerguitstrijkjes van patiënten met multipel myeloom.

Interfase Fluorescentie in situ Hybridisatie van beenmerguitstrijkjes van multipel myeloom

Hier beschrijven we een op immunofluorescentie gebaseerde methode om de niveaus van enkelstrengs DNA in cellen te kwantificeren. Deze efficiënte en reproduceerbare methode kan worden gebruikt om replicatiestress te onderzoeken, een gemeenschappelijk kenmerk bij verschillende eierstokkankers. Bovendien is deze test compatibel met een geautomatiseerde analysepijplijn, wat de efficiëntie verder verhoogt.

Kwantificering van replicatiestress in eierstokkankercellen met behulp van enkelstrengs DNA-immunofluorescentie

Drosophila oogenese blijft uitzonderlijk nuttig in de studie van mitochondriale proliferatie en overerving. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om het replicerende mitochondriale DNA (mtDNA) in Drosophila volwassen eierstokken te labelen met 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), wat het mogelijk maakt om mechanismen te ontdekken die geassocieerd zijn met mitochondriale overerving die voorheen discutabel waren.

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

Leer FISH-analyse van eierstokcellen bij vrouwen met X-chromosomale afwijkingen. Deze methode onthult het X-chromosomale gehalte en ondersteunt vruchtbaarheidsonderzoek in de reproductieve biologie.

Onderzoek naar X-chromosomale afwijkingen in eierstokcellen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie

Meer video's verkennen