Celspecifieke gepaarde ondervraging van het ovarium-epigenoom en transcriptoom van de muis

Deze methode biedt een techniek om nucleïnezuren te isoleren uit specifieke eierstokcelpopulaties van dezelfde muis zonder dat celsortering nodig is. Deze techniek kan helpen identificeren hoe specifieke celpopulaties veranderen onder verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld met ouder worden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gepaarde epigenomische en transcriptomische analyse van een specifiek eierstokceltype mogelijk maakt zonder dat celsortering nodig is. Dit verhoogt de doorvoer aanzienlijk, verlaagt de kosten en elimineert de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur bij het uitvoeren van celtypespecifieke analyse van eierstokweefsel. Hier is ons doel om de celtypespecifieke veranderingen te identificeren die optreden bij ovariële veroudering voorafgaand aan reproductieve senescentie, wat implicaties heeft bij de behandeling van vrouwelijke onvruchtbaarheid.

Deze methode kan worden toegepast op elk celtype in lichaamssystemen waarvoor een celtypespecifiek Cre-stuurprogramma beschikbaar is. Het moeilijkste deel van deze techniek is het kiezen van een geschikte Cre-lijn voor uw celtype interesse. Uitgebreide validatie van de celspecificiteit wordt aanbevolen.

Om te beginnen, verzamel één eierstok van de geëuthanaseerde muis in 500 microliter nuclei lysisbuffer en hak de eierstok in acht delen binnen de buffer met behulp van een zelfopenende microschaar. Breng de gehakte eierstok en de lysisbuffer over in een glazen homogenisator op ijs en homogeniseer de eierstok 10 tot 20 keer met de losse stamper A.Voeg 400 microliter lysisbuffer toe aan de dounce homogenisator wasstamper A.En homogeniseer vervolgens de eierstok met strakke stamper B 10 tot 20 keer. Breng het homogenaat over in een ronde bodembuis van twee milliliter en centrifugeer gedurende 1,5 minuut bij 200 g bij vier graden Celsius om het niet-gedissocieerde weefsel en de bloedvaten te verwijderen.

Na het voorbevochtigen van een 30-micrometer celzeef met 100 microliter lysisbuffer, filtert u het supernatant door de zeef in een conische buis van 15 milliliter. Breng de kernen die het mengsel bevatten over in een ronde bodembuis van twee milliliter. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 500 g bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Resuspendeerde de kernpellet in 250 microliter ijskoude lysisbuffer door kort te vortexen met matige tot hoge snelheid. Breng het volume op 1,75 milliliter door 1,5 milliliter lysisbuffer toe te voegen. Meng voorzichtig en laat de kernsuspensie gedurende vijf minuten op ijs rusten.

Pellet de kernen door centrifugatie bij 500 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. En gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kernpellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 200 microliter ijskoude opslagbuffer en vortex kort om de kernpellet volledig te resuspenderen.

Reserveer 10% van de geresuspendeerde pellet als inputkernmonster voor downstream-analyse. Neem de geresuspendeerde kernenpallet en vul het volume aan tot twee milliliter met ijskoude nucleaire zuiveringsbuffer of NPB. Voeg 30 microliter geresuspendeerde kralen voor elk monster toe aan een ronde bodembuis van twee milliliter.

Voeg vervolgens een milliliter NPB toe en resuspensie goed door pipetteren. Plaats de buis gedurende één minuut op het magnetische rek om de kralen te scheiden. Gooi het supernatant weg en verwijder de buis van de magneet.

Resuspendeer de gewassen magnetische kralen in één milliliter NPB. Herhaal de wasstap voor in totaal drie wasbeurten. En na de laatste wasbeurt, resuspensie de kralen in het initiële volume van NPB.

Voeg 30 microliter van de gewassen kralen toe aan twee milliliter van de nucleaire suspensie en resuspensie het kralenkernmengsel goed door te pipetteren en de buis voorzichtig om te keren. Plaats de buizen op een roterende mixer in een koude ruimte of koelkast gedurende 30 minuten op lage snelheid en incuber de invoermonsters zonder kralen in dezelfde omstandigheden. Plaats de buizen met de kernsuspensie en kralen gedurende drie minuten op de magneet om de gebiotinyleerde kernen gebonden aan streptavidinkorrels te scheiden van de negatieve fractie van kernen.

Verwijder het supernatant. Breng de negatieve fractie door in een verse buis van twee milliliter en bewaar deze op ijs. Verwijder voor elke positieve fractiebuis de buis van de magneet en resuspensie van de inhoud in één milliliter NPB.

Plaats de buis gedurende één minuut op de magneet en gooi het supernatant weg. Resuspendie van het positieve fractie kraalkernenmengsel in 30 microliter NPB. Breng de eierstok en 100 microliter homogenisatiebuffer over in een glazen dounce homogenisator en homogeniseer 10 tot 20 keer met de losse stamper A.Voeg 400 microliter TRAP-homogenisatiebuffer toe aan wasstamper A en breng het homogenaat over naar een ronde bodembuis van twee milliliter.

Was de homogenisator met een extra één milliliter TRAP-homogenisatiebuffer en breng het gewassen volume over naar de ronde onderbuis van twee milliliter. Centrifugeer het homogenaat op 12.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. En breng het vrijgemaakte supernatant over in een verse ronde onderbuis van twee milliliter.

Na het weggooien van de pellet, breng 100 microliter van het geklaarde homogenaat over naar een verse ronde bodembuis van twee milliliter en reserveer het als input op ijs. Incubeer de rest van het geklaarde homogenaat met vijf microgram per milliliter anti-GFP-antilichaam gedurende één uur bij vier graden Celsius terwijl u roteert in een end-over-end mixer. Incubeer het invoermonster in dezelfde toestand.

Breng 50 microliter van het eiwit G magnetische kralen voor elk monster over in een ronde bodembuis van twee milliliter. Voeg 500 microliter zoutarme wasbuffer toe aan de kralen en pipetteer voorzichtig om te mengen. Plaats de buis gedurende één minuut in een magnetische standaard om de kralen tegen de zijkant van de buis te verzamelen.

Nadat u het supernatant hebt weggegooid, verwijdert u de buis van de magnetische standaard en voegt u een milliliter zoutarme wasbuffer toe aan de buis. Pipetteer zachtjes om te mengen. Plaats de buis opnieuw in de magnetische standaard en herhaal de stap voor in totaal drie wasbeurten.

Na de laatste wasbeurt, resuspensie de kralen in het initiële volume van zoutarme wasbuffer. Breng de geresuspendeerde gewassen kralen over naar het antigeenmonsterantilichaammengsel en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius terwijl u roteert in een end-over-end mixer. Incubeer de inputmonsters 's nachts in de equivalente omstandigheden.

Scheid daarna de positieve fractie of de magnetische kralen met de doelribosomen RNA van de negatieve fractie of het supernatant met behulp van de magnetische standaard gedurende 2,5 tot 3 minuten. Zuig de negatieve fractie op. Doe het in een verse ronde onderbuis van twee milliliter en zet het opzij op ijs.

Voeg 500 microliter zoutrijke wasbuffer toe aan de buis met de positieve fractie en pipetteer voorzichtig om te mengen. Plaats de buis op een magnetische standaard die gedurende één minuut op ijs wordt gehouden om de kralen te scheiden. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, verwijdert u de buis van de magneet en herhaalt u de stap gedurende in totaal drie wasbeurten.

Na de laatste wasbeurt, resuspendeerde de kralen in 350 microliter RNA-lysisbuffer aangevuld met 3,5 microliter 2-mercaptoethanol. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur terwijl u gedurende 10 minuten mengt bij 900 RPM in een digitale shaker. Scheid de kralen van de oplossing die nu de doelribosomen RNA bevat met een magnetische standaard gedurende één minuut bij kamertemperatuur.

Verzamel de geëlueerde positieve fractie in een verse buis van 1,5 milliliter. Immunofluorescentie beeldvorming werd uitgevoerd op de geparaffineerde eierstokken van Cyp17-Cre positieve NuTRAP flox en Cyp17-Cre negatieve NuTRAP flox muizen. EGFP-eiwit werd gekleurd met behulp van geit anti-GFP primair antilichaam en Alexa 488 ezel anti-geit secundair antilichaam, en de kernen waren gekleurd met DAPI.

De beelden werden gemaakt met een fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 20x. Het input- en TRAP-positieve fractie-RNA werd geïsoleerd uit Cyp17-Cre-positieve NuTRAP flox-muiseierstokken en gesequenced op een gepaarde eindmanier. De belangrijkste componentanalyse van alle tot expressie gebrachte genen toonde een scheiding van de TRAP-input en positieve fracties in de eerste component.

De vulkaanplot van differentieel tot expressie gebrachte genen tussen de input en positieve fracties wordt hier getoond. De vergelijking van de TRAP-positieve fractie met de input toonde een algehele verrijking van de stroma/theca-celmarkergenen en de uitputting van de oöcyt-, granulosa-, immuun- en gladde spiercelmarkergenen in de TRAP-positieve fractie. Na de eerste centrifugatie van de kernsuspensie om ongedissocieerde bloedvaten te verwijderen, bevinden de kernen zich in het supernatant.

Zorg ervoor dat u het supernatant bewaart en gooi de pellet op dit punt weg. Volgens de intacte methode kunnen verschillende epigenomische technieken worden uitgevoerd, waaronder testen voor chromatinetoegankelijkheid of DNA-modificaties. Volgens de TRAP-methode kan RT-qCPR of RNA-sequencing worden uitgevoerd om de translatoom te beoordelen.

Dit is de eerste toepassing van de NuTRAP-methode in de eierstok van de muis. Dit maakt epigenomische en transcriptomische analyse met hoge doorvoer mogelijk van specifieke eierstokceltypen, die kunnen worden gebruikt om eierstokveroudering of kanker te bestuderen.