Name: Een menselijk cerebraal organoïdemodel van neurale celtransplantatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer een protocol voor neurale celtransplantatie in menselijke cerebrale organoïden met fluorescente tracking. Deze methode maakt langdurige in-vitro-evaluatie van celengraftment en integratie mogelijk voor onderzoek naar celtherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Fondsen voor dit werk werden verstrekt via de IRIC Philanthropic fondsen van de Marcelle en Jean Coutu stichting en van het Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. krijgt salarisondersteuning van FRQS in de vorm van een Chercheurs-boursiers Junior 1 fellowship (#283502). M.I.I.R. werd ondersteund door een IRIC Doctoral Award van het Institut of Research in Immunology and Cancer, een Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat van de Universiteit van Montreal en de Bourse de Mérite aux cycles supérieurs.

<ol><li>Spurlock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+penetrating+ballistic-like+brain+injury+induced+cognitive+deficits+after+neuronal+differentiation+of+transplanted+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981(2017).</li>
<li>Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+stem+cell+treatment+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301(2019).</li>
<li>Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neural+stem+cell+transplantation+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models.</a> Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29(2020).</li>
<li>Kefalopoulou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+fetal+cell+transplantation+for+Parkinson+disease%3A+Two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports.</a> JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+graft-derived+dopaminergic+innervation+is+maintained+24+years+after+transplantation+in+the+degenerating+parkinsonian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+Kyoto+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial.</a> Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).</li>
<li>Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+stroke%3A+Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for stroke: Are we there yet.</a> Frontiers in Neurology. 10, 656(2019).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+Growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+vulnerability+and+responses+to+stressors+between+human+and+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes.</a> Nature Communications. 12 (1), 3958(2021).</li>
<li>Morizane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+matching+improves+engraftment+of+iPSC-derived+neurons+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates.</a> Nature Communications. 8 (1), 385(2017).</li>
<li>Khrameeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+transcriptome+map+of+human%2C+chimpanzee%2C+bonobo%2C+and+macaque+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains.</a> Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).</li>
<li>Powell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+brains%3A+The+ethics+of+transplanting+human+neurons+into+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals.</a> Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>García-Delgado, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+to+evaluate+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Brain organoids to evaluate cellular therapies.</a> Animals. 12 (22), (2022).</li>
<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
<li>Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax6+in+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of Pax6 in forebrain development.</a> Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+G2019S-LRRK2+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+3D+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson's disease in 3D midbrain organoids.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).</li>
<li>Smits, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Parkinson%27s+disease+in+midbrain-like+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids.</a> NPJ Parkinson's Disease. 5, 5(2019).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
<li>Sun, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gezien de grote belangstelling voor celtherapeutische benaderingen voor de behandeling van CZS-letsels/neurodegeneratieve aandoeningen 1,2,3,4,5,6,7,8, worden modellen van celfunctie in een transplantatieomgeving steeds belangrijker. Dit artikel presenteert een methode voor de transplantatie van gelabelde, menselijke NPC's in menselijke cerebrale organoïden, samen met hun levende celtracking en eindpuntbeoordeling door histologie en immunofluorescerende kleuring. Belangrijk is dat we aantoonden dat de getransplanteerde cellen in staat waren tot migratie, differentiatie en langdurige (4 maanden) persistentie in de organoïde-setting. Een dergelijke persistentie op lange termijn is een duidelijke toename ten opzichte van de onderhoudbaarheid van hersenplakculturen17. Dit systeem is dus geschikt voor het onderzoeken van veel van de gedragingen die men zou moeten beoordelen in een potentiële therapeutische setting, zoals overleving, proliferatie en differentiatie. Inderdaad, een orthogonale studie heeft onlangs aangetoond dat getransplanteerde NPC's zich op dezelfde manier gedroegen in cerebrale organoïden in vergelijking met NPC's die in NSG-muizenhersenen waren getransplanteerd20, wat het nut van organoïden als ontvanger van transplantaties bevestigt. Omdat dit een in vitro systeem is, is het ook eenvoudig om cytokines of interessante geneesmiddelen toe te voegen. Dit kan worden gebruikt om de effecten van specifieke omgevingen zoals ontstekingen en immunosuppressiva op de getransplanteerde cellen beter te begrijpen om verder na te bootsen wat ze in een therapeutische setting kunnen tegenkomen. Het cyclische immunofluorescentieprotocol dat we hebben gedemonstreerd (gebaseerd op eerder onderzoek21) breidt de kracht van deze aanpak verder uit, waardoor een breed scala aan afstammings- en mogelijk ziektespecifieke markers tegelijkertijd in een enkele sectie kan worden beoordeeld, en waardoor een nauwkeurige tracking van de getransplanteerde cellen en hun impact op het weefsel mogelijk wordt. Natuurlijk kunnen in plaats daarvan andere methoden voor eindpuntbeoordeling worden gebruikt, afhankelijk van de doelen van de analyse. Weefselopruiming met 3D-reconstructie kan bijvoorbeeld worden gebruikt als celmorfologie van primair belang is, of dissociatie gevolgd door flowcytometrie kan worden gebruikt als de kwantificering van specifieke celtypen het einddoel is. We verwachten dat deze methode gemakkelijk uitbreidbaar zal zijn naar andere celtypen zoals CZS-tumoren, waardoor hun studie mogelijk is in een micro-ecologisch relevante context. Evenzo zouden de organoïden die als ontvangers worden gebruikt, kunnen worden uitgewisseld voor ziektemodelorganoïden 25,26,27, waardoor mogelijk transplantatiebenaderingen voor deze aandoeningen kunnen worden gemodelleerd.
Zoals bij alle modellen, heeft ook het hier gepresenteerde model zijn eigen beperkingen. Ten eerste zijn iPSC-afgeleide organoïden onrijp in hun ontwikkeling19 en hebben ze dus belangrijke verschillen met de ouder wordende hersenen, waarin veel neurodegeneratieve ziekten zich manifesteren. Cerebrale organoïden zijn ook niet-uniform in ontwikkeling19, waardoor consistente injectie in exact dezelfde fysiologische niche wordt uitgesloten. Bovendien, hoewel ze de celtypen van de relevante hersengebieden bevatten 18,19, missen ze de endotheel-, microgliale en immuuncomponenten, die ook belangrijk zijn in de in vivo setting14. Dit beperkt de studie van hoe de gastheer zal reageren op de celtransplantatie. Er komen momenteel technieken online om vasculaire28- en microgliale29-cellen toe te voegen, en om de organoïdeconsistentie en regionalisatie18 te vergroten, waardoor de modelleringskracht van het organoïdetransplantatiesysteem wordt verbeterd. Ze zouden echter verder moeten worden getest en geoptimaliseerd dan wat hier wordt gepresenteerd. Hoewel dit protocol goedkoop is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist, blijven er een aantal belangrijke technische overwegingen, bijvoorbeeld de injectiediepte. Dit is zowel te wijten aan het feit dat organoïden niet worden doorbloed en dus vaak een necrotisch centrum hebben als ze te groot worden19 en dat licht niet door de organoïdekern kan dringen voor het volgen van levende cellen. Zo kunnen de cellen die te diep zijn geïnjecteerd en kolonies die naar binnen zijn gemigreerd, worden gemist. Hoewel dit kan worden verbeterd door het gebruik van fluoroforen met een langere golflengte en een betere weefselpenetrantie30, zal dit, afhankelijk van de grootte van de organoïde en het detectieapparaat, waarschijnlijk een overweging blijven. Ten slotte, aangezien hersenorganoïden zich in een staat van ontwikkeling bevinden, is de timing van de transplantatie een andere belangrijke overweging, aangezien de omgeving waarschijnlijk zal verschillen afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de organoïde waarin deze wordt geïnjecteerd. Hoewel dit tot op zekere hoogte kan worden gecontroleerd door te zorgen voor een consistente leeftijd van de organoïden op het moment van injectie, is het zonder twijfel een factor waarmee rekening moet worden gehouden.
Dit protocol is goedkoop, eenvoudig, dierproefvrij en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, waardoor transplantatiemodellering toegankelijk is voor een grotere verscheidenheid aan laboratoria. Met het snelle tempo van vooruitgang, zowel in neurale celtherapieën als organoïdemodelsystemen, verwachten we dat het hier gepresenteerde organoïdetransplantatieprotocol een bruikbaar model zal zijn voor een reeks ziekten en therapeutische benaderingen.

Het menselijk brein is een complex orgaan dat is samengesteld uit meerdere celtypen van de neurale en gliale lijnen. Samen vormen deze een geavanceerd netwerk dat aanleiding geeft tot cognitie. Er is veel belangstelling voor de transplantatie van cellen in dit systeem als behandeling voor een breed scala aan neurologische aandoeningen, waaronder traumatisch hersenletsel (TBI)1,2, neurodegeneratieve aandoeningen 3,4,5,6,7 en beroerte 8 . Een belangrijke beperking in de vooruitgang van dergelijke strategieën is echter de relatieve schaarste aan beschikbare preklinische modellen om de verwachte transplantatieresultaten te bepalen. De meest gebruikte modellen zijn momenteel in vitro kweekmethoden om celpotentiaal en xenotransplantatie in muizen te bepalen. Hoewel celkweekmethoden differentiatie en zelfvernieuwingspotentieel kunnen beoordelen9, worden deze uitgevoerd onder optimale groeiomstandigheden die niet de micro-omgeving nabootsen die de cellen zouden tegenkomen in een transplantatiecontext. Bovendien kan de manier waarop de cellen worden gekweekt hun gedrag beïnvloeden10.
Muizenhersenen bevatten alle cellen van de micro-omgeving en zijn dus uiterst krachtige modelsystemen voor transplantatie11. Er zijn echter belangrijke verschillen tussen de muis- en menselijke cortex12,13, en niet alle groeifactoren reageren kruiselings tussen soorten. Primatenmodellen zijn een nauwer alternatief dat het menselijk systeem beter nabootst en ook belangrijke preklinische resultaten heeft opgeleverd14. Zelfs deze nauwer verwante verwanten behouden echter belangrijke verschillen in hun cellulaire samenstelling15. Hoewel beide modelsystemen waardevolle inzichten bieden in het gedrag van cellen tijdens transplantatie en de chirurgische elementen van een eventuele therapie bevatten, blijven ze onvolmaakt. Ze zijn ook kostbaar en technisch uitdagend (d.w.z. men moet een hersenoperatie uitvoeren op de dieren), waardoor de mogelijke doorvoer wordt beperkt. Bovendien is er een overvloed aan ethische kwesties verbonden aan het transplanteren van menselijke hersencellen in dieren16. Hersenplakculturen maken het mogelijk om één brein te snijden en te gebruiken voor meerdere behandelingen, waardoor enkele van de beperkingen van diertransplantaties worden weggenomen; Deze hebben echter een beperkte levensduur (weken), zijn nog steeds afkomstig van dieren en hebben (omdat het een dun plakje is) niet voldoende volume/oppervlakte-integriteit om de injectie van cellen na te bootsen17. Er blijft dus een belangrijke kloof bestaan tussen strikt celkweek/potentiaalmodellen en in vivo transplantatie.
Cerebrale organoïden zijn een in vitro model dat de belangrijkste neurale celtypen bevat die in de hersenen aanwezig zijn en kunnen in grote aantallen worden gegenereerd uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)18,19. Dergelijke organoïden bieden dus een cellulaire context, die het mogelijk zou kunnen maken om de functionele capaciteit van een testcel die van belang is in de transplantatieomgeving te beoordelen. Inderdaad, een recente studie toonde aan dat neurale voorlopercellen (NPC's) getransplanteerd in menselijke cerebrale organoïden overleven, zich vermenigvuldigen en differentiëren op dezelfde manier als NPC's die zijn getransplanteerd in de hersenen van een non-zwaarlijvige diabeticus severe gecombineerde immunodeficiënte gamma (NSG) muis20. Cerebrale organoïden vertegenwoordigen dus een dierproefvrij, langlevend (>6 maanden), kosteneffectief systeem dat de celtypen van het menselijk brein vastlegt. Als zodanig zouden ze een ideale ontvanger van transplantaties kunnen zijn voor het testen van het regeneratieve vermogen van neurale cellen in een vroeg stadium.
Dit artikel presenteert een protocol voor de transplantatie en daaropvolgende tracking van gelabelde menselijke NPC's in menselijke cerebrale organoïden (Figuur 1). Dit begint met de injectie van GFP-gelabelde NPC's in volwassen (2-4 maanden oude) cerebrale organoïden18. De getransplanteerde cellen worden vervolgens gevolgd door fluorescentiemicroscopie met levende cellen gedurende een periode van 4 maanden. Gedurende deze tijd tonen we zowel de persistentie van cellen op de injectieplaats als de migratie naar distale regio's van de organoïde. Op het eindpunt demonstreren we het ophalen van antigeen, kleuring en beeldvorming van histologische secties afgeleid van deze organoïden, inclusief een protocol voor het doven van bestaande op AlexaFluor gebaseerde kleurstoffen om extra kleurings- en beeldvormingsrondes mogelijk te maken, gebaseerd op eerder werk21. Dit protocol zou dus nuttig kunnen zijn bij het meten van de differentiatiecapaciteit van cellen in een transplantatieomgeving, de duurzaamheid van het transplantaat, celexpansie in situ en celmigratie van de plaats van de transplantatie. We verwachten dat dit nuttig zal zijn voor zowel regeneratieve geneeskunde/celtherapietoepassingen als tumormodellering door tumorcellen te enten in relevante regiospecifieke organoïden.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>proteolytic-collagenolytic enzymmix</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-GFP Antibody</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antibody (clone SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-Tubulin &beta; 3 (TUBB3) (clone TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid Monohydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td>Biotek</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Denaturated Ethyl Alcohol (Anhydrous)</td><td>ChapTec</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12/Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Fenol Red-vrij, LDEV-vrij</td></tr><tr><td>MX35 microtome blade&nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp;Stainless-Steel Base Molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp;UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Progenitor Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi Neural Induction Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Prep</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp; AI Tissue Processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Toluene (histological)</td><td>ChapTec</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue; 0.4% (wt/vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

een menselijk cerebraal organoïdemodel van neurale celtransplantatie

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

De vooruitgang van celtransplantatiebenaderingen vereist modelsystemen die een nauwkeurige beoordeling van de functionele potentie van getransplanteerde cellen mogelijk maken. Voor het centrale zenuwstelsel is xenotransplantatie weliswaar state-of-the-art gebleven, maar dergelijke modellen zijn technisch uitdagend, beperkt in doorvoer en duur. Bovendien reageren de aanwezige omgevingssignalen niet perfect op kruisreacties met menselijke cellen. Dit artikel presenteert een goedkoop, toegankelijk en high-throughput-compatibel model voor de transplantatie en het volgen van menselijke neurale cellen in menselijke cerebrale organoïden. Deze organoïden kunnen gemakkelijk worden gegenereerd uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van commerciële kits en bevatten de belangrijkste celtypen van de grote hersenen. 
We demonstreren dit transplantatieprotocol eerst met de injectie van EGFP-gelabelde menselijke iPSC-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) in deze organoïden. Vervolgens bespreken we overwegingen voor het volgen van de groei van deze cellen in de organoïde door middel van fluorescentiemicroscopie van levende cellen en demonstreren we het volgen van getransplanteerde EGFP-gelabelde NPC's in een organoïde gedurende een periode van 4 maanden. Ten slotte presenteren we een protocol voor de doorsnede, cyclische immunofluorescerende kleuring en beeldvorming van de getransplanteerde cellen in hun lokale context. Het hier gepresenteerde organoïdetransplantatiemodel maakt het mogelijk om getransplanteerde menselijke cellen op lange termijn (ten minste 4 maanden) rechtstreeks in een menselijke micro-omgeving te volgen met een goedkoop en eenvoudig uit te voeren protocol. Het vertegenwoordigt dus een bruikbaar model, zowel voor neurale celtherapieën (transplantaties) als, waarschijnlijk, voor het modelleren van tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) op een meer micro-ecologisch nauwkeurige manier.

Als validatie van de cerebrale organoïde-identiteit werden histologische secties van een volwassen (2 maanden oude) cerebrale organoïde gekleurd voor PAX6 (een marker van dorsale NPC's23) en SATB2 (een marker van volwassen, postmitotische, bovenste laag neuronen24). Zoals verwacht waren PAX6+- cellen aanwezig aan de binnenkant van de organoïde en SATB2+- cellen in de bovenste lagen (Figuur 2). Deze resultaten ondersteunen dat de gebruikte cerebrale organoïden inderdaad dorsale voorhersenen waren, zoals gespecificeerd in de differentiatiekit. Om de dosisafhankelijkheid van het cerebrale organoïdetransplantatiesysteem vast te stellen, werden 2 maanden oude cerebrale organoïden geïnjecteerd met een toenemend aantal EGFP+ iPSC-afgeleide NPC's. Er was een duidelijke dosisafhankelijkheid van GFP-fluorescentie van het aantal ingangscellen, met consistente EGFP+ -celpatchdetectie bij 10.000 cellen en hoger (Figuur 3). De persistentie en migratie van de getransplanteerde NPC's werden vervolgens beoordeeld door de getransplanteerde organoïden in de loop van de tijd te volgen. Hiervoor werden 50.000 iPSC-afgeleide EGFP+ NPC's getransplanteerd in 2-3 maanden oude cerebrale organoïden gegenereerd uit dezelfde iPSC-lijn. De geïnjecteerde organoïden en controles werden in de komende 3-4 maanden op aangegeven tijdstippen in beeld gebracht op EGFP-positiviteit. In deze transplantatiereeks hebben we persistentie van de geïnjecteerde plaats waargenomen gedurende de trackingperiode van 4 maanden (Figuur 4A). Aanvullende EGFP+ -celpleisters verschenen 9 dagen na transplantatie en hielden aan tot het eindpunt van de studie (3-4 maanden, afhankelijk van de organoïde), wat wijst op de migratie van de cellen en integratie op hun nieuwe locaties (Figuur 4A). Bij een hogere vergroting was een duidelijke neurale morfologie waarneembaar met lange projecties in de organoïde (Figuur 4B), wat de integratie van de geïnjecteerde cellen bevestigde.
Om de differentiatiestatus van de geïnjecteerde cellen laat na injectie te bepalen, werden de 4 maanden gevolgde organoïde en de controle ervan gefixeerd, met paraffine ingebed, in plakjes van 15 μm dik gesneden en op glasplaatjes gemonteerd. De plakjes werden vervolgens verwerkt en gekleurd in een enkele ronde fluorescerende kleuring (EGFP, TUJ1, NESTIN) of gedurende twee opeenvolgende kleuringscycli om extra markers toe te voegen (MAP2, GFAP). De eerste enkelvoudige kleuring bevestigde de aanwezigheid van EGFP+-cellen op de injectieplaats, waaronder een mengsel van cellen die de NPC-status behielden (NESTIN+TUJ1−) en cellen die zich hadden gedifferentieerd in de richting van een neuraal lot (NESTIN−TUJ1+) (Figuur 5). Voor zowel de controle- als de geïnjecteerde organoïden werden zeer weinig NESTIN+ NPC's waargenomen (de meeste, maar niet alle EGFP+ getransplanteerde NPC's op de injectieplaats), met een meerderheid van TUJ1+ onvolgroeide-rijpe neuronen (Figuur 5). De tweeronde kleuring gaf meer details en onthulde rijpe neuronen (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) rond het grootste deel van het buitenste gebied van de organoïde, met gebieden met onrijpe (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) neuronen in het midden (Figuur 6A,B). Astrocyten (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) waren aanwezig in zowel de geïnjecteerde als de controleorganoïden en werden afgewisseld langs de buitenranden (Figuur 6A,B). De plak waarvoor de tweeronde kleuring in de geïnjecteerde organoïde werd uitgevoerd, toonde een kleine satellietkolonie van EGFP+-cellen ver van de injectieplaats die het fenotype van volwassen neuronen had aangenomen (Figuur 6B,C). Sommige hiervan leken zich in de nabijheid van astrocyten te bevinden; er waren echter geen EGFP+-cellen met volledige overlap met de GFAP-kleuring, wat suggereert dat ze naast elkaar lagen in plaats van de astrocyten zelf te genereren (Figuur 6B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> Figuur 1: Transplantatiemodel van gelabelde cellen in cerebrale organoïden. Schematisch overzicht van het genereren van gelabelde cellen door lentivirale transductie, hun transplantatie in cerebrale organoïden en tracking door middel van beeldvorming van levende cellen en immunofluorescentie. Afkorting: GFP = groen fluorescerend eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> Figuur 2: Immunofluorescentie van histologische doorsneden die de architectuur van vroege en late organoïden laten zien. Een cerebrale organoïde van 2 maanden oud werd gefixeerd, met paraffine ingebed, in plakjes gesneden en gekleurd met PAX6, SATB2 en DAPI. Een ongekleurde doorsnede werd gebruikt om de belichtings- en integratietijd in te stellen om een vals-positief signaal van autofluorescentie te voorkomen. PAX6+-cellen waren aanwezig aan de binnenkant van de organoïde, terwijl SATB2+-cellen aanwezig waren in de bovenste lagen. Z-stack-beelden werden om de 4,2 μm genomen door het hele weefselgedeelte van 15 μm. Optische secties werden gecombineerd met behulp van de focus stacking-optie in de Gen5-software met standaardopties. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: PAX6 = gepaarde box 6 proteïne; SATB2 = speciaal AT-rijk sequentiebindend eiwit 2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> Figuur 3: Dosisafhankelijke implantatie van NPC's in cerebrale organoïden. De organoïden werden getransplanteerd met 0 (negatieve controle), 1.000, 5.000, 10.000 of 50.000 GFP+ iPSC-afgeleide NPC's. 1 week na de transplantatie werden de organoïden afgebeeld op een Cytation 5 met een GFP-filterkubus. De negatieve controle werd gebruikt om de belichtings- en integratietijd in te stellen om autofluorescentie te minimaliseren. Donkere kleuren duiden op meer EGFP-fluorescentie ten opzichte van de negatieve controle. Schaalbalken = 100 μm. Dit zijn 4x afbeeldingen van de hele organoïden. Na beeldvorming werd voorafgaand aan de weergave een rollende bal achtergrondaftrekking uitgevoerd met een pixelstraal van 50 om te corrigeren voor de variabele achtergrondintensiteit over de organoïden. Injectieplaatsen die zijn geïdentificeerd als de regio's met de hoogste implantatie, worden aangegeven met een rode pijl waar implantatie aanwezig was. Afkortingen: NPC's = neurale voorlopercellen; GFP = groen fluorescerend eiwit; EGFP = verbeterd GFP; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> Figuur 4: Volgen van getransplanteerde celgroei, migratie en persistentie met fluorescentie live-cell beeldvorming. (A) Controle- en getransplanteerde (50.000 GFP+ iPSC-afgeleide NPC's) organoïden werden gevolgd door fluorescentie live-cell beeldvorming in de loop van 2-4 maanden uit twee onafhankelijke transplantatiesets. Negatieve controleorganoïden werden gebruikt om de belichtings- en integratietijd in te stellen om de autofluorescentie op elk tijdstip te minimaliseren. EGFP-beelden werden vastgelegd met behulp van een GFP-filterkubus op de Cytation 5 op aangegeven tijdstippen na transplantatie. Donkere kleuren duiden op meer EGFP-fluorescentie ten opzichte van de negatieve controle voor dat tijdstip. Voorafgaand aan de weergave werd een rollende bal achtergrondaftrekking uitgevoerd met een pixelstraal van 50 om te corrigeren voor de variabele achtergrondintensiteit over de organoïden. De organoïden werden op elk tijdstip in ongeveer dezelfde richting geplaatst en de afbeeldingen werden gedraaid voor consistentie van de weergave en om de getransplanteerde celgroei duidelijk te laten zien. De injectieplaatsen die zijn geïdentificeerd als de regio's met de hoogste implantatie op het vroegste tijdstip, zijn aangegeven met een rode pijl. Een voorbeeld van een negatieve controle-organoïde is onderaan de figuur weergegeven. (B) Voorbeeld 20x afbeeldingen worden getoond van geënte organoïden in week 1 en week 15 na transplantatie. Het lokale contrast werd voorafgaand aan de weergave verbeterd met behulp van FIJI om de zichtbaarheid van neurieten te garanderen. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: NPC's = neurale voorlopercellen; GFP = groen fluorescerend eiwit; EGFP = verbeterd GFP; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> Figuur 5: Immunofluorescentie van de histologische secties die de persistentie van de getransplanteerde NPC's op de injectieplaats aantonen, samen met migratie en neurale differentiatie. Eenkanaals fluorescentiebeelden van (A) niet-geïnjecteerde en (B) getransplanteerde organoïden. De overlay-afbeelding aan de rechterkant toont de drie interessekanalen (NESTIN, TUJ1 en EGFP), maar bevat geen DAPI. De displayminima zijn zo ingesteld dat alleen het signaal van de negatieve cellen wordt uitgesloten (bepaald voor EGFP van de niet-geïnjecteerde controle en voor andere kanalen op basis van bekende markercombinaties). De displaymaxima waren gebaseerd op het hoogste signaal dat voor dat antilichaam in een cel werd waargenomen. Het weergavebereik werd constant gehouden tussen de niet-geïnjecteerde en getransplanteerde organoïden om een directe vergelijking mogelijk te maken. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: NPC's = neurale voorlopercellen; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; TUJ1 = bèta-III tubuline; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> Figuur 6: Beoordeling van de differentiatietoestand en lokalisatie van getransplanteerde cellen met behulp van cyclische immunofluorescentie van de histologische secties. Eenkanaals fluorescentiebeelden van de niet-geïnjecteerde, (A) leeftijdsgebonden en (B) getransplanteerde organoïden worden getoond voor de eerste en tweede kleuringsronde zoals aangegeven. De displayminima zijn zo ingesteld dat alleen het signaal van de negatieve cellen wordt uitgesloten (bepaald voor EGFP van de niet-geïnjecteerde controle en voor andere kanalen op basis van bekende markercombinaties). De displaymaxima waren gebaseerd op het hoogste signaal dat voor dat antilichaam in een cel werd waargenomen. Het weergavebereik (en natuurlijk de beeldvormingsparameters) werd constant gehouden tussen de controle- en geïnjecteerde organoïden om een directe vergelijking mogelijk te maken. Schaalbalken = 100 μm. Aan de rechterkant wordt voor elke kleuringsronde voor elke organoïde een overlay-afbeelding (exclusief DAPI) getoond. (B) Voor de geïnjecteerde organoïde waarvoor beeldregistratie is uitgevoerd, worden alle beelden bijgesneden tot het gebied dat in beide kleuringsrondes is waargenomen. (B,C) Voor de geïnjecteerde organoïde zijn de EGFP+-celregio's blauw omlijnd. Een diagram van hoe DAPI wordt gebruikt om de kenmerken tijdens de beeldregistratie te matchen, wordt weergegeven in (C), gevolgd door een algehele samenvoeging van het geregistreerde beeld. Afkortingen: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TUJ1 = bèta-III tubuline; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; MAP2 = microtubuli-geassocieerd eiwit 2; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Kloon</td>
			<td>Fluorofoor</td>
			<td>Concentratie</td>
		</tr><tr><td>Anti-NESTIN</td>
			<td>10C2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 op 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 op 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 op 200</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 op 500</td>
		</tr><tr><td>Anti-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 op 1.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-PAX6</td>
			<td>O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 op 100</td>
		</tr><tr><td>Anti-SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 op 500</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Antilichaamconcentraties voor kleuring. Afkortingen: TUBB3 = bèta-tubuline III; GFP = groen fluorescerend eiwit; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; MAP2 = microtubuli-geassocieerd eiwit 2; PAX6 = gepaarde box 6 proteïne; SATB2 = speciaal AT-rijk sequentiebindend eiwit 2.

Hier beschrijven we een protocol voor de transplantatie en het volgen van gelabelde neurale cellen in menselijke cerebrale organoïden.

Een menselijk cerebraal organoïdemodel van neurale celtransplantatie

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

Met de groeiende belangstelling voor celtherapieën zijn nieuwe methoden nodig om de functionaliteit van deze cellen te evalueren. Dit protocol maakt het mogelijk om in vitro op lange termijn deze celimplantatie in een neurale context te beoordelen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat alle componenten van menselijke oorsprong zijn.Ook kan de implantatie gemakkelijk worden gevolgd en kan de omgeving van de organoïde gemakkelijk worden gewijzigd, waardoor verschillende medicijnen of soorten behandelingen kunnen worden getest. Deze techniek wordt gedemonstreerd door Iliana Ibanez, een getalenteerde promovendus in mijn lab. Begin met het verwijderen van de eencellige suspensie van geïnduceerde pluripotente stamcellen of iPSC-afgeleide neurale voorlopercellen, of NPC's, uit het ijs en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 300 g bij 4 graden Celsius.Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in 3 milligram per milliliter opgeloste basaalmembraanmatrix om een eindvolume van twee microliter per injectie te verkrijgen. Plaats de ophanging onmiddellijk terug op het ijs tot gebruik. Breng de voorgekoelde spuit van de vriezer van 20 graden Celsius over in een ijsemmer voor verder gebruik.Verwijder vervolgens de hersenorganoïdeplaat uit de incubator en breng de organoïde over in een schaal van 35 millimeter met behulp van een brede boorpunt. Om de organoïden te stabiliseren en de injectie te vergemakkelijken, verwijdert u het medium zoveel mogelijk zonder de organoïde te beschadigen. Plaats de schaal van 35 millimeter met de organoïde onder een ontleedmicroscoop om de injectie te vergemakkelijken.Zodra de organoïden klaar zijn om te injecteren, resuspendeert u de EGFP-gelabelde NPC-cellen voorzichtig met behulp van een gekoelde P20-pipetpunt en verplaatst u twee microliter van deze cellen naar een voorgekoeld steriel glasplaatje. Neem een voorgevulde insulinespuit uit het ijs en zuig langzaam de 2 microliter celsuspensie op met de schuine kant van de naald naar beneden gericht. Open het deksel van de schaal met de organoïde voordat u de microscoop erop richt.Houd de schaal met één hand vast, plaats de schuine kant van de naald omhoog. En met de andere hand injecteer je de cel langzaam in het organoïde-oppervlak. Plaats na het injecteren van de cellen het deksel terug in de schaal en incubeer de geïnjecteerde organoïde gedurende één tot twee minuten.Voeg vervolgens voorzichtig 500 microliter van het organoïdemedium toe aan de plaat voordat u de organoïde overbrengt naar een plaat met 24 putjes en een brede boorpunt. Incubeer de organoïde bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met een volledige mediumwissel om de dag. Plaats een niet-geïnjecteerde of negatieve controleorganoïde in een fluorescentiemicroscoop.En stel de verlichtingsintensiteit in tussen 1 en 2 en de belichtingstijd tussen 80 en 100 milliseconden voor minimale autofluorescentie. Laad vervolgens de positieve controle-organoïde en verhoog de belichtingstijd om ervoor te zorgen dat de gelabelde cellen zichtbaar zijn. Verplaats de organoïde met een pipetpunt met brede boring om het verbeterde groene fluorescerende eiwit of EGFP plus-gebied voor injectie te vinden.Verwijder het medium volledig uit de organoïde voordat u de organoïde plaatst. En stel het voor met de geselecteerde instellingen. Zodra de beeldvorming is voltooid, voegt u onmiddellijk een nieuw medium toe om te voorkomen dat de organoïde uitdroogt.Na het herhalen van de mediumverwijdering en beeldvorming voor alle organoïden, brengt u de organoïden terug naar de normale incubatie en mediumwisselingen. Herhaal de beeldvorming met de gewenste tussenpozen. Plaats het objectglaasje gedurende twee minuten in een Coplin-kleurpot gevuld met tolueen en herhaal deze stap.Breng vervolgens het glasplaatje gedurende twee minuten over in een glazen Coplin-kleurpot gevuld met 100% ethylalcohol. En herhaal deze stap voordat u de dia gedurende twee minuten in een Coplin-pot gevuld met water plaatst. Herhaal de wasbeurt met water.Plaats vervolgens een plastic bakje in het waterbad en zorg ervoor dat het plastic de bodem van het bad niet raakt. Giet de citraatbuffer in de plastic container en laat deze 95 tot 100 graden Celsius bereiken. Zodra de buffer de gewenste temperatuur heeft bereikt, plaatst u de glaasjes in de buffer en dekt u de container losjes af met een deksel, waarbij u de glaasjes 30 tot 40 minuten in het waterbad laat staan.Haal na het incuberen de plastic container uit het waterbad en laat deze 20 minuten afkoelen op kamertemperatuur. Was de glaasjes drie keer gedurende twee minuten elk met PBS. Verwijder de PBS met een papieren zakdoekje zonder het monster aan te raken.Bereid de permeabilisatiebuffer voor en vul er een glazen glaasjekleurpot mee. Dompel de objectglaasjes onder in de permeabilisatiebuffer en incubeer gedurende 10 minuten. Herhaal drie wasbeurten PBS gedurende elk twee minuten.Maak vervolgens een kleuringsmengsel om elk monster te bedekken en voeg 25 microliter toe aan het organoïdeglaasje voordat u het objectglaasje een uur bij kamertemperatuur incubeert. Herhaal na incubatie drie wasbeurten PBS gedurende elk twee minuten en verwijder de zouten door het glaasje af te spoelen met gedestilleerd water in een glazen kleurpot. Voeg vervolgens 10 microliter vloeistofbevestigingen en DAPI toe aan elk monster voordat u het objectglaasje afbeeldt met de fluorescentiemicroscoop.Voeg aan de glazen Coplin-kleurpot die voor de helft is gevuld met 2X blusbuffer 45 milliliter PBS toe en plaats de glaasjes in deze pot. Incubeer de pot een nacht bij 4 graden Celsius. Gebruik fluorescentiemicroscopie om te controleren of de fluoroforen effectief zijn geblust voordat u de kleuring en beeldvorming herhaalt.Er was een duidelijke dosisafhankelijkheid van GFP-fluorescentie aanwezig op het aantal ingangscellen, met consistente EGFP plus celpatchdetectie bij 10.000 cellen en hoger. De geïnjecteerde organoïden en controles die in beeld werden gebracht voor EGFP-positiviteit toonden de persistentie van de geïnjecteerde plaats gedurende de trackingperiode van vier maanden. Aanvullende EGFP-positieve celpleisters verschenen negen dagen na de transplantatie en hielden aan tot het eindpunt van de studie, wat wijst op de migratie van de cellen en integratie op hun nieuwe locaties.Bij een hogere vergroting was een duidelijke neurale morfologie waarneembaar met lange projecties in de organoïde, wat de integratie van de geïnjecteerde cellen bevestigde. De eerste enkelvoudige kleuring bevestigde de aanwezigheid van EGFP plus-cellen op de injectieplaats, waaronder een mengsel van cellen die de NPC-status behielden en cellen die zich hadden gedifferentieerd in de richting van een neuraal lot. Voor de controle- en geïnjecteerde organoïden werden zeer weinig Nestin plus NPC's waargenomen, met een meerderheid van TUJ1 plus onrijpe volwassen neuronen.De twee ronde kleuringen gaven meer details en onthulden volwassen neuronen rond het grootste deel van het buitenste deel van het buitenste deel van de organoïde, met gebieden met onrijpe neuronen in het midden. Astrocyten waren aanwezig in de geïnjecteerde en controleorganoïden en werden afgewisseld langs de buitenranden. De plak waarvoor de twee ronde kleuring werd uitgevoerd in de geïnjecteerde organoïde, toonde een kleine satellietkolonie van EGFP plus-cellen ver van de injectieplaats die het fenotype van volwassen neuronen hadden aangenomen.Sommige van deze kolonies lijken in de buurt van astrocyten te zijn. Geen EGFP plus-cellen met volledige overlap met de GFP-kleuring suggereerden echter dat ze naast elkaar lagen in plaats van de astrocyten zelf te genereren. Wanneer u de organoïde injecteert, moet u voorkomen dat u te veel kracht uitoefent of het te snel doet, omdat u de organoïde volledig kunt vernietigen.Dus na het volgen van het leven kunnen de organoïden worden geassocieerd en gebruikt voor flowcytometrie-analyse of sequencing-benaderingen van één cel. Dit zal ons in staat stellen om de moleculaire toestand van de cellen te kennen. Deze techniek zou zeer nuttig kunnen zijn voor het bevorderen van de celtherapie voor neurodegeneratieve ziekten, ook voor het modelleren van hersentumoren of metastasen.

a-human-cerebral-organoid-model-of-neural-cell-transplantation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Palma-Tortosa, S., et.al. Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the transplantation of stem cell-derived neuronal progenitor cells into human cortical tissue slices. The procedure involves isolating and resuspending progenitor cells in a basement membrane matrix, followed by their injection into a cortical slice placed on a transwell assembly. After incubation to allow...

Transplantation of Stem Cell-Derived Neuronal Progenitors into Human Cortical Slices

Source: Ibanez-Rios, M.I., et al., A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the injection of fluorescently labeled neural progenitor cells (NPCs) into human cerebral organoids using a cell-matrix mixture. The method is reproducible and animal-free, enabling transplantation with minimal organoid disruption. It offers a valuable platform for modeling neural transplants and central nervous system (CNS) diseases.

Injection of Fluorescent Neural Progenitor Cells into Human Cerebral Organoids for Transplantation Modeling

Cerebrale organoids vertegenwoordigen een nieuw modelsysteem voor vroege menselijke hersenen ontwikkeling in vitroonderzoeken. Dit artikel bevat de gedetailleerde methodologie voor het efficiënt genereren van homogene dorsale reukkolf-type organoids van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met inbegrip van kritische karakterisatie en validatie stappen.

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Deze studie introduceert en beschrijft protocollen voor het afleiden van twee specifieke menselijke neurale organoïden als een relevant en nauwkeurig model voor het bestuderen van 1) menselijke multiform glioblastoom ontwikkeling binnen menselijke neurale organoïden uitsluitend bij de mens en 2) neuron Dopaminerge differentiatie die een driedimensionale organoïde genereert.

Menselijke neurale Organoïden voor het bestuderen van hersenkanker en neurodegeneratieve ziekten

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van hersenorganoïden uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Om hersenorganoïden in grote hoeveelheden en van hoge kwaliteit te verkrijgen, gebruiken we zelfgemaakte mini-bioreactoren.

Brain Organoid Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen in zelfgemaakte mini-bioreactoren

In deze studie bieden we een gedetailleerde techniek voor een eenvoudig maar robuust corticale organoïde kweeksysteem met behulp van standaard feedervrije hPSC-culturen. Dit is een snel, efficiënt en reproduceerbaar protocol voor het genereren van organoïden die aspecten van hersensenescentie in vitro modelleren.

Robuuste en zeer reproduceerbare generatie corticale hersenorganoïden voor het modelleren van neuronale senescentie in de hersenen in vitro

Dit protocol beschrijft organotypische culturen op lange termijn van de volwassen menselijke cortex in combinatie met ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopers, die een nieuwe methodologie presenteren om op stamcellen gebaseerde therapieën voor menselijke neurodegeneratieve aandoeningen verder te testen.

Organotypische culturen van volwassen menselijke cortex als een ex vivo model voor menselijke stamceltransplantatie en validatie

De elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten biedt een nauwkeurige en efficiënte benadering om voorbijgaande genetische modificatie (s) te introduceren in verschillende voorlopertypen en neuronen in een modelsysteem dat dicht bij de ontwikkeling van primaat (patho) fysiologische neocortex ligt. Dit maakt de studie van neurologische ontwikkelings- en evolutionaire processen mogelijk en kan ook worden toegepast voor ziektemodellering.

Gerichte micro-injectie en elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten voor genetische modificatie

Hier presenteren we een protocol om menselijke hersenorganoïden in meerdere rijpingsstadia te enten in het chorioallantoïsche membraan (CAM) van het kuiken. Hersenorganoïden werden gekweekt volgens ongeleide gestandaardiseerde protocollen.

Vroege ongeleide menselijke hersenorganoïde neurovasculaire nichemodellering in het toegeeflijke kuikenembryo chorioallantoïsch membraan

Hier presenteren we de acute genetische manipulatie van gesneden menselijke corticale organoïden door elektroporatie. Deze corticale organoïdemodellen zijn bijzonder vatbaar voor injectie, aangezien ventrikelachtige structuren gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd na het snijden, waardoor functioneel onderzoek naar de ontwikkeling van de menselijke corticale ontwikkeling, neurologische ontwikkelingsstoornissen en corticale evolutie mogelijk is.

Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden voor onderzoek naar de genfunctie

Leer een protocol voor neurale celtransplantatie in menselijke cerebrale organoïden met fluorescente tracking. Deze methode maakt langdurige in-vitro-evaluatie van celengraftment en integratie mogelijk voor onderzoek naar celtherapieën.

Een menselijk cerebraal organoïdemodel van neurale celtransplantatie

Meer video's verkennen