Name: Real-time detectie van reactieve zuurstofsoortenproductie in immuunrespons in rijst met een chemiluminescentietest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Leer een geoptimaliseerde L-012-chemiluminescentiemethode voor real-time detectie van reactieve zuurstofsoorten in rijstweefsels tijdens immuunrespons. Dit protocol is gestandaardiseerd en reproduceerbaar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van Shanghai Natural Science Foundation (Grant Number: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X program, Grant Number:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Grant Number: ZXWH2150201/001) aan Jiangbo Fan, en door het Medical-Engineering Collaboration Project van Shanghai Jiao Tong Univesity (subsidienummer: 21X010301734) aan Can Li.

OPMERKING: Het protocol is van toepassing op verschillende plantenweefsels. Rijstschede en bladschijven werden in dit protocol gebruikt voor ROS-detectie bij PAMP-elicitatie. Aangezien verschillen voornamelijk ontstaan als gevolg van de bemonsteringsmethode, worden hieronder alleen de gemeenschappelijke procedures beschreven, waarbij waar nodig specifieke stappen worden vermeld.
1. Plantencultuur
<ol><li>Steriliseer de ontpelde rijstzaden met 70% ethanol gedurende 1 minuut, vervolgens met 40% natriumhypochloriet (NaClO) gedurende 1 uur. Spoel de zaden vervolgens 5x af met steriel water om achtergebleven chloor te verwijderen.</li>
	<li>Breng de zaden aseptisch op 1/2 MS medium (2,37 g/L Murashige en Skoog (MS) medium, 30 g/L sucrose, 2,1 g/L phytagel, pH 5,7, autoclaaf).<ol><li>Bij de rijstmantelmethode kunt u de zaden direct in het steriele glazen vat met MS-medium plaatsen.</li>
		<li>Plaats in de bladschijfmethode de zaden gedurende 5-7 dagen op MS-platen en verplant ze naar de groeimatrix of de grond (figuur 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Kweek de zaailingen in een groeiruimte met een 12 h licht/12 h donkere fotoperiode.</li>
</ol>2. Weefselvoorbereiding en voorbehandeling
<ol><li>Rijstschede<ol><li>Snijd de schede van 10 dagen oude rijstzaailingen in segmenten van 3 mm met een scherp scheermesje of chirurgisch mesje voor voorbehandeling 1 dag voor de ROS-test (figuur 1B).</li>
		<li>Plaats vijf mantelsegmenten in een individuele put van een 96-well microtiterplaat met 100 μL ddH 2 O gedurende10-12 uur, in het donker bij 25 °C, waardoor wondletselgerelateerde ionenlekkage en afweerreacties kunnen afnemen (figuur 2). OPMERKING: Het verticaal houden van de sneden om een consistent snijoppervlak te garanderen dat wordt blootgesteld aan de elicitatieoplossing is een belangrijke stap om zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Beweeg de segmenten voorzichtig. Maak geen extra snijwonden of wonden op de segmenten, die een bron van gegevensvariatie kunnen zijn. In principe moet elke test ten minste vijf replicaties bevatten, omdat de variatie van de ROS-waarde groot is. Hoe meer replica's worden ingesteld, hoe betrouwbaarder de gegevens zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Bladschijf<ol><li>Snijd de bladschijven (4 mm in diameter) van 4-6 weken oude rijstplanten met behulp van een biopsiepons met een zuiger. Snijd altijd bladschijven uit het middelste derde deel van het tweede blad (genummerd vanaf de bovenkant) van de hoofdhelmstok om de gegevensvariatie te verminderen (figuur 1C).</li>
		<li>Plaats één bladschijf in een individuele put van een 96-well microtiterplaat met 100 μL ddH 2 O gedurende 10-12 uur voor voorbehandeling, waardoor wondgerelateerde reacties kunnen afnemen omdat deze de inductie van ROS door PAMPs kunnen verstoren (figuur 2). OPMERKING: Bedien de bladschijven voorzichtig. Maak geen extra snijwonden of wonden op de schijven in het experiment, wat kan leiden tot gegevensvariatie. De inductie van ROS vindt meestal plaats vanuit de cellen van de snijkant, omdat de oppervlakken van rijstweefsels (bladeren of omhulsels) bedekt zijn met hydrofobe lagen. Alleen de cellen van de snijranden staan in contact met de elicitatieoplossing (zie de discussiesectie).</li>
		<li>Houd alle bladschijven drijvend, met het abaxiale oppervlak naar boven gericht, in de putjes van een microtiterplaat voor watervoorbehandeling om bladzijde-geassocieerde variatie te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig01.jpg"> Figuur 1: De groeitoestand en stadia van rijstzaailingen voor schedebemonstering en delen van de rijstschede en rijstbladeren die in de test zijn gebruikt. (A) Rijstzaailingen die gedurende 10 dagen onder steriele omstandigheden op 1/2 MS-medium zijn geteeld, kunnen worden bemonsterd voor ros-bepaling. Gesteriliseerde rijstzaden werden gekweekt op 1/2 MS medium en gekweekt in een 12 uur lichte / 12 uur donkere fotoperiode in een heldere glazen injectieflacon, 8,5 cm in diameter en 15 cm in hoogte. B) Schematisch schema van de bemonsteringsdelen van bladmantels. Bladmantels werden gesneden uit 10 dagen oude rijstzaailingen. De posities van bladscheden waren boven de wortels en onder het eerste blad. (C) Schematisch schema van de bemonsteringspositie van bladschijven. De bladschijven kunnen worden gesneden uit het middelste derde deel van het tweede blad (tel vanaf de bovenkant) van de hoofdhelmstok van gezonde rijstplanten in elk groeistadium. Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; MS = Murashige en Skoog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig02.jpg"> Figuur 2: Schematisch schema van de plaatopstelling voor het meten van ROS-productie met verschillende lijnen van Oryza sativa. Voorbehandeling en test van rijstweefsels met behulp van een 96-well plaat. Lijn 1, Lijn 2 en Lijn 3 (tot acht lijnen op één plaat) kunnen elk interessant materiaal zijn, verschillende cultivars, mutanten of transgene lijnen. De weefsels werden gestimuleerd met elicitatie-oplossingen met PAMP (PAMP, wit) of zonder PAMP (ddH2O, grijs) om de ROS-respons te meten. Opgemerkt moet worden dat hoe meer monsters moeten worden getest, hoe langer het tijdsinterval tussen de metingen. Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; PAMP = pathogeen-geassocieerd moleculair patroon; ddH2O = dubbel gedestilleerd water. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
3. De elicitatieoplossing voorbereiden
<ol><li>Los L-012 poeder op in 20 mM (6,23 mg/ml) waterige oplossing met ddH2O om de stamoplossing te maken. Verdun vervolgens de stamoplossing met 50 mM Tris HCl-buffer (pH 7,5) om de werkoplossing te maken bij de uiteindelijke concentratie van 500 μM L-012. Houd de stamoplossing bevroren en verdun tot de werkoplossing voor gebruik.</li>
	<li>Bereid de elicitatieoplossing die PAMP, L-012 en mierikswortelperoxidase (HRP; 10 mg/ml in ddH2O) bevat. Meng voor een elicitatieoplossing van 10 ml 9,4 ml 50 mM Tris HCl (pH 7,5) oplossing, 400 μl L-012-oplossing, 100 μl HRP en 100 μl flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O). Voeg voor de negatieve controle 100 μL ddH2O toe in plaats van PAMP. OPMERKING: Bewaar de bereide elicitatie-oplossingen bij kamertemperatuur om koude stress voor rijstweefsels te voorkomen. Andere PAMP's kunnen ook worden gebruikt voor de behandeling indien nodig, zoals chitine (20 ng / ml in de uiteindelijke concentratie). Aangezien L-012 lichtgevoelig is, bedek alle buizen met L-012-oplossing met aluminiumfolie.</li>
</ol>4. De software starten en het protocol instellen met de microplaatlezer waarnaar wordt verwezen (zie Materiaaltabel)
OPMERKING: Het duurt enige tijd om de parameters van de microplaatlezersoftware in te stellen. Het wordt aanbevolen om de machine en het protocol gereed te maken (één klik om door te gaan) voordat u de elicitatie-oplossing toevoegt.
<ol><li>Start de software. Klik op de knop Experimenten om een nieuw protocol te maken of een bestaand protocol te gebruiken.</li>
	<li>Klik op Procedure in het pop-upvenster om de plaat in te stellen. Selecteer de putten van de plaat die u wilt controleren.</li>
	<li>Klik op Start Kinetic om de totale looptijd en het leesinterval in te stellen. Stel de looptijd in op 35 minuten of langer, afhankelijk van de experimentele vereisten. Als u zo vaak mogelijk metingen wilt verkrijgen, selecteert u Minimuminterval. Kies voor de integratietijd 1 s of langer, afhankelijk van de signaalintensiteit. OPMERKING: Het leesinterval is afhankelijk van het aantal monsters en de duur van de signaalintegratie.</li>
	<li>Klik op Valideren | OK om de instellingen te bevestigen.</li>
	<li>Klik op De nieuwe plaat detecteren in de pop-up en wacht tot de software het dialoogvenster van de laadplaat vraagt. Plaats de te testen plaat op de drager.</li>
	<li>Stop hier om te wachten tot het elicitatiesysteem is vastgesteld (in de volgende sectie). Zodra het elicitatiesysteem klaar is, klikt u op Uitvoeren om het lezen te starten.</li>
</ol>5. Het opzetten van het elicitatiesysteem en het meten van real-time ROS-productie
<ol><li>Verwijder de ddH2O voorzichtig uit de putjes met de voorbehandelde weefsels en vermijd weefselbeschadiging of uitdroging.</li>
	<li>Gebruik een meerkanaalspipet om 200 μL van de elicitatieoplossing toe te voegen aan de putjes die de weefsels bevatten.</li>
	<li>Schud zachtjes om te mengen. Klik op Uitvoeren om de detectie te starten. OPMERKING: Met PAMP-behandeling reageren plantenweefsels en produceren ze zeer snel ROS. Daarom wordt voorgesteld om de negatieve controle zonder PAMP eerst te behandelen om de operatietijd te verkorten, wanneer er meerdere behandelingen zijn. Werk zo snel mogelijk om de elicitatievertraging tussen behandelingen te verminderen. Hoe korter de tijd tussen de toevoeging van de elicitatieoplossing en het begin van de detectie, hoe beter de vastlegging van belangrijke experimentele gegevens zal zijn.</li>
</ol>

<ol><li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li>
<li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+are+good%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li>
<li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+calcium%2C+and+electric+signals%3A+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li>
<li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+gene+network+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li>
<li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+burst+of+plant+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+oxidases%3A+the+engines+of+ROS+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li>
<li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li>
<li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li>
<li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li>
<li>Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li>
<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Het doel van deze studie was om een zeer efficiënte methode vast te stellen om de vroege ROS-productie te kwantificeren als reactie op PAMP in rijstweefsels. Deze methode biedt een gestandaardiseerde procedure voor de real-time bepaling van apoplast ROS geproduceerd uit behandelde rijstweefsels. Deze methode is eenvoudig in gebruik, laag in kosten, duidelijk van samenstelling en onafhankelijk van commerciële kits. Met behulp van deze methode kunnen onderzoekers de real-time productie van apoplast ROS bestuderen wanneer p...

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) omvatten een reeks chemisch actieve zuurstofderivaten, waaronder superoxide-anionradicalen (O2-) en zijn derivaten, hydroxylradicalen (OH-), waterstofperoxide en producten van singletzuurstof of oxidatie-reductiereacties, die voortdurend worden geproduceerd in plastiden en chloroplasten, mitochondriën, peroxisomen en andere subcellulaire locaties1 . ROS spelen een belangrijke rol in veel biologische processen en zijn essentieel voor alle planten 2,3,4. Het brede spectrum van ROS-functies varieert van de regulatie van groei en ontwikkeling tot de perceptie van abiotische en biotische spanningen 5,6,7,8.
In het immuunsysteem van de plant nemen plantencelplasmamembraan-gelokaliseerde receptoren - zogenaamde patroonherkenningsreceptoren (PRR's) - pathogeen-afgeleide chemicaliën-pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) waar. Deze herkenning veroorzaakt een reeks snelle immuunresponsen, waaronder calciuminstroom, ROS-burst en MAPK-cascade; daarom wordt deze laag van immuniteit PAMP-getriggerde immuniteit (PTI) genoemd. ROS-burst is een kenmerkende PTI-respons, waarvan de bepaling op grote schaal wordt toegepast op PTI-gerelateerde studies 9,10. ROS-productie veroorzaakt door PAMP's wordt toegeschreven aan plasmamembraan-residente NADPH-oxidase, of respiratoire burst-oxidasehomologe (RBOH) familie-eiwitten, die elektronen overbrengen van cytosolische NADPH of NADH naar extracellulaire zuurstof om superoxide (O 2-) te produceren dat spontaan wordt omgezet in waterstofperoxide (H 2 O 2) door superoxidedismutase 8 . PAMP-getriggerde ROS-burst is vrij snel, verschijnt slechts een paar minuten na PAMP-behandeling en piekt op ~ 10-12 min. De overgrote meerderheid van de ROS-moleculen bestaat uit waterstofperoxide (H 2 O2), dat gemakkelijk en gestaag kan worden gedetecteerd met een chemiluminescentietest.
Bij chemiluminescentie reageert het chemiluminescentiereagens met actieve zuurstof, onder invloed van een katalysator, om de aangeslagen toestandstussenproducten te produceren. Vervolgens keren de elektronen in het product terug naar de grondtoestand door niet-stralingsovergang en zenden fotonen uit. Veel voorkomende chemiluminescentiereagentia zijn luminol en L-012, waarbij luminol de toepassing domineert11,12,13. Meer onderzoekers kiezen echter voor L-012 om ros-productie te detecteren, omdat L-012 een veel hogere lichtemissie-efficiëntie heeft onder neutrale of bijna neutrale pH-omstandigheden in vergelijking met luminol.
Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde chemiluminescentiemethode, gebaseerd op L-012, voor de real-time detectie van ROS-productie na de elicitatie van PAMPs in rijst (Oryza sativa) weefselbladschijven en schede. De hier aangeboden methode is eenvoudig, stabiel en gestandaardiseerd en is zeer aanpasbaar om aan verschillende experimentele behoeften te voldoen. De gegevens die met deze methode worden verkregen, zijn in hoge mate reproduceerbaar onder stevig gecontroleerde omstandigheden.

<table><tbody><tr><td>96-well microtiter plate</td><td>WHB</td><td>WHB-96-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluut</td><td>Innochem</td><td>A43543</td><td></td></tr><tr><td>flg22</td><td>Sangon Biotech</td><td>p20973</td><td>PAMP</td></tr><tr><td>Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>L-012</td><td>FUJIFILM</td><td>120-04891</td><td>8-amino-5-chloro-7-fenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dion, CAS #:143556-24-5</td></tr><tr><td>Microplate lezer</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>MS Medium</td><td>Solarbio</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCLO</td><td>Aladdin</td><td>S101636</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase uit mierikswortel (HRP)</td><td>Sigma</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Steekproef</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>15110-40</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610195</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time detectie van reactieve zuurstofsoortenproductie in immuunrespons in rijst met een chemiluminescentietest

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een vitale rol in een verscheidenheid aan biologische processen, waaronder het detecteren van abiotische en biotische spanningen. Bij pathogene infectie of uitdaging met pathogeen-geassocieerde chemicaliën (pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen [PAMPs]), wordt een reeks immuunresponsen, waaronder een ROS-burst, snel geïnduceerd in planten, die PAMP-getriggerde immuniteit (PTI) wordt genoemd. Een ROS-burst is een kenmerkende PTI-respons, die wordt gekatalyseerd door een groep plasmamembraan-gelokaliseerde NADPH-oxidasen - de RBOH-familie-eiwitten. De overgrote meerderheid van ROS bestaat uit waterstofperoxide (H 2 O2), dat gemakkelijk en gestaag kan worden gedetecteerd met een op luminol gebaseerde chemiluminescentiemethode. Chemiluminescentie is een fotonenproducerende reactie waarbij luminol, of zijn derivaat (zoals L-012), een redoxreactie met ROS ondergaat onder invloed van een katalysator. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde op L-012 gebaseerde chemiluminescentiemethode om apoplast ROS-productie in realtime te detecteren bij PAMP-elicitatie in rijstweefsels. De methode is eenvoudig, stabiel, gestandaardiseerd en zeer reproduceerbaar onder stevig gecontroleerde omstandigheden.

Hier nemen we rijstmateriaal als voorbeeld om de ROS te bepalen die wordt geproduceerd met flg22-behandeling. De generatie van ROS na elicitatie is van voorbijgaande aard. In rijst werd de toename van de ROS-productie voor het eerst gedetecteerd in 1-2 minuten, piekte op 10-12 min en keerde terug naar de basislijn in ~ 30-35 min (figuur 3). In vergelijking met de controletest, waarbij PAMP afwezig was in de elicitatieoplossing die resulteerde in geen duidelijke ROS-inductie, werd een specifi...

Hier beschrijven we een methode voor de real-time detectie van apoplastische reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie in rijstweefsels in pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon-getriggerde immuunrespons. Deze methode is eenvoudig, gestandaardiseerd en genereert zeer reproduceerbare resultaten onder gecontroleerde omstandigheden.

Real-time detectie van reactieve zuurstofsoortenproductie in immuunrespons in rijst met een chemiluminescentietest

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde op L-012 gebaseerde chemiluminescentiemethode om ros-productie in realtime te detecteren bij PAMP-elicitatie in rijstweefsels. Deze methode is eenvoudig, gestandaardiseerd en zeer reproduceerbaar onder stevig gecontroleerde omstandigheden. Deze procedure wordt gedemonstreerd door On Ying, een promovendus uit mijn lab.Om te beginnen, steriliseer de ontdopte rijstzaden met 70% ethanol gedurende één minuut en vervolgens met 40% natriumhypochloriet gedurende een uur. Spoel de zaden vijf keer af met steriel water om achtergebleven chloor te verwijderen. Bij de rijstmantelmethode kunt u de zaden direct in het steriele glazen vat met Murashige en Skoog of MS-medium plaatsen.Om de zaden in de bladschijfmethode te plaatsen, Plaats ze vijf tot zeven dagen op MS-platen en transplanteer ze vervolgens naar de groeimatrix of grond. Laat de zaailingen groeien in een groeiruimte met een 12 uur lichte, 12 uur donkere fotoperiode. Snijd de schede van 10 dagen oude rijstzaailingen in drie millimetersegmenten met een scherp scheermesje of chirurgisch mesje voor voorbehandeling een dag voor de ROS-test.Plaats vijf mantelsegmenten in een individuele put van een 96-put microtiterplaat met 100 microliter dubbel gedestilleerd water gedurende 10 tot 12 uur. Snijd de bladschijven van vier tot zes weken oude rijstplanten met behulp van een biopsiepons met een zuiger. Knip altijd de bladschijven van het middelste derde deel van het tweede blad van de hoofdhelmstok om de gegevensvariatie te verminderen.Plaats vervolgens een bladschijf in een individuele put van een 96-put microtiterplaat met 100 microliter dubbel gedestilleerd water gedurende 10 tot 12 uur voor voorbehandeling. Houd alle bladschijven drijvend en naar boven gericht in de putjes van een microtiterplaat voor watervoorbehandeling om bladzijde geassocieerde variatie te voorkomen. Bereid elicitatie-oplossing door 9,4 milliliter 50 micromolaire Tris Hcl, 400 microliter L012-oplossing, 100 microliter paardenradijsperoxidase en 100 microliter Flg22 te combineren.Voeg 200 microliter elicitatie-oplossing toe aan de putten. Start de software en klik op de knop experimenten om een nieuw protocol te maken of een bestaand protocol te gebruiken. Klik op de procedure in de pop-up om de plaat in te stellen en selecteer de putten van de plaat die u wilt controleren.Klik op start kinetic en stel de runtime in op 30 minuten of langer, afhankelijk van de experimentele vereisten. Selecteer het minimale interval om de metingen zo vaak mogelijk te verkrijgen. En kies voor integratietijd een seconde of langer, afhankelijk van de signaalintensiteit.Klik op valideren, gevolgd door OK om de instellingen te bevestigen, klik vervolgens op de nieuwe plaat detecteren in de pop-up en wacht tot de software het dialoogvenster van de laadplaat vraagt. Verwijder voorzichtig het dubbel gedestilleerde water uit de putten met de voorbehandelde weefsels en vermijd weefselbeschadiging of uitdroging. Gebruik een meerkanaalspipet om 200 microliter van de elicitatieoplossing toe te voegen aan de putjes die de weefsels bevatten.Plaats de te testen plaat op de drager en begin met de detectie. Om ROS door Flg22 te induceren, werden bladschijven en drie millimeter lange mantels gebruikt. De ROS-generatie wordt gedurende 35 minuten gemonitord.De staven geven de gemiddelde standaardafwijkingen aan, berekend op basis van vijf technische herhalingen. In rijst werd de toename van de ROS-productie voor het eerst gedetecteerd in één tot twee minuten, piekte op 10 tot 12 minuten en keerde terug naar de basislijn in ongeveer 30 tot 35 minuten. Het totale bedrag aan ROS werd berekend op basis van de curve.Als u het totale aantal ROS-waarden wilt verkrijgen, past u de formule toe op de overeenkomstige gegevenssets om de ROS te berekenen die op elk tijdsinterval wordt gegenereerd, die kan worden gecombineerd door de formulesom toe te passen om het totale gegenereerde bedrag te berekenen. Een enkel gat of twee helften van een bladschijf werden in de putten van een 96-putmicrotiterplaat geplaatst, voorbehandeld met 100 microliter dubbel gedestilleerd water gedurende 10 tot 12 uur en vervolgens behandeld met Flg22 voor ROS-inductie. De afleeswaarden van de twee halve schijfmonsters zijn veel hoger dan die van de hele bladschijf.Gemiddeld zijn de totale waarden van de twee halve schijfmonsters bijna 1,6 keer die van de hele bladschijf, wat evenredig is met de randlengte, niet met de oppervlakte van de monsters. Dit resultaat ondersteunt dat ROS voornamelijk worden gegenereerd in cellen op de wondplaats. Wanneer u deze procedure probeert, moet u voorzichtig met weefsels werken en geen extra uitsneden maken die een bron van gegevensvariatie kunnen zijn.Deze methode kan worden toegepast op alle andere ROS-producerende fysiologische processen in plantenweefsels.

real-time-detection-reactive-oxygen-species-production-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier hebben we voorstellen eenvoudige methoden voor het testen en evalueren van de aanwezigheid van reactieve zuurstofradicalen in de cellen.

Productie en detectie van reactive oxygen species (ROS) in kanker

Een efficiënte methode om inzicht te krijgen in het visualiseren van de paracriene afgeleide ROS inductie van endotheliale Ca2 + signalering wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van het meten van paracriene afgeleid ROS geactiveerd Ca2 + mobilisatie in vasculaire endotheliale cellen in een co-cultuur model.

Visualisatie van vasculaire Ca 2 + Signalering Geactiveerd door Paracriene Derived ROS

This video demonstrates an assay to measure oxidative burst in Arabidopsis leaves upon immune elicitation. Leaf discs, cut from plant leaves, are incubated with bacterial peptides functioning as microbe-associated molecular patterns or MAMPs. Upon detection of the MAMPs, plant cells induce the production of extracellular ROS, which is detected using a chemiluminescence assay.

An Assay to Detect Oxidative Burst in Arabidopsis Leaf Discs upon Immune Elicitation

This video demonstrates an assay for real-time detection of reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues upon pathogen-associated molecular pattern (PAMP) elicitation. Cut sheath segments and leaf discs are exposed to a bacterial flagella-derived peptide functioning as a PAMP. Upon recognition of the peptide via pattern recognition receptors (PRRs) on plant cells, a rapid and transient production of ROS occurs, which is detected via a chemiluminescence assay.

An Assay for Detecting Reactive Oxygen Species Production in Rice Tissues upon Immune Elicitation

We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.

Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring

Escherichia coli is de belangrijkste oorzaak van neonatale gramnegatieve bacteriële meningitis. Tijdens de bacteriële infectie spelen reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door neutrofielen een belangrijke bacteriedodende rol. Hier introduceren we een methode om de reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen te detecteren als reactie op meningitis E. coli.

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Hier presenteren we een verbeterd chemotaxis-testprotocol. Het doel van dit protocol is om de stappen en kosten van traditionele bacteriële chemotaxismethoden te verminderen en te dienen als een waardevolle bron voor het begrijpen van plant-microbe interacties.

Een verbeterde chemotaxistest voor de snelle identificatie van rhizobacteriële chemoattractanten in wortelexsudaten

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

Leer een geoptimaliseerde L-012-chemiluminescentiemethode voor real-time detectie van reactieve zuurstofsoorten in rijstweefsels tijdens immuunrespons. Dit protocol is gestandaardiseerd en reproduceerbaar.

Real-time detectie van reactieve zuurstofsoortenproductie in immuunrespons in rijst met een chemiluminescentietest

Meer video's verkennen