Toepassing van het intelligente high-throughput antimicrobiële gevoeligheidstest-/faagscreeningsysteem en Lar Index van antimicrobiële resistentie

Dit protocol presenteert een methode op meerdere niveaus, zowel voor EST-detectie als voor de faagfiguur. Het introduceerde ook een grote index voor reddingen om EMR-niveaus van verschillende besturingstechnologie te vergelijken. Deze kosteneffectieve techniek is intelligent, high-throughput en multifunctioneel.

Het heeft de oprichting van VAMS mogelijk gemaakt, een veterinair monitoringnetwerk dat 20.000 epidemische genen en analytische fagen heeft verzameld. Deze methode kan ook worden gebruikt voor het monitoren en beheersen van pathogene bacteriën in de geneeskunde, de landbouw, de hartbatterij van dieren en de visserij. Dit protocol en dit bedrijfsdocument moeten voorzien in een.

Wij met technische training gids. Door het te volgen, zou iedereen de techniek in korte tijd onder de knie krijgen. Begin met het incuberen van het kwaliteitscontrole-organisme E.coli en 93 salmonellastammen op Mueller-Hinton-agarplaten.

Verdun vervolgens het voorbereide inoculum van elke stam 10 keer. Breng 200 microliter steriele normale zoutoplossing over in het a-1 putje van een plaat met 96 putjes als negatieve controle. Vervolgens pipetteer twee suspensies van E.coli in de a-2 en a-3 putjes als respectievelijk positieve en kwaliteitscontroles.

Voeg aan de resterende 93 putjes 200 microliter van de verdunde teststam toe. Voor de bereiding van de antimicrobiële agarplaten. Stel eerst het concentratiebereik in voor de verschillende antibacteriële middelen die worden getest, volgens de LAR-index.

Voer een log-twee verdubbelingsverdunningsschema uit voor de antibiotische oplossing volgens de CLSI-standaard agarverdunningsmethode. Voeg nu twee milliliter van de antimicrobiële oplossing toe aan een gesteriliseerde glazen fles met 18 milliliter gesmolten Mueller-Hinton-agarmedia. Na grondig mengen, giet in borden in een bioveiligheidskast.

Laat de agar stollen bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat er een opening onder het deksel van de platen blijft om het agaroppervlak te laten drogen. Etiketteer de soorten antimicrobiële middelen en hun respectieve concentraties aan de onderkant van de geïncubeerde platen.

Schik de meerdere geïncubeerde platen voor elk antimicrobieel middel in een stapel die is gerangschikt in log twee, verdubbelingsvolgorde. Bereid ten slotte twee medicijnvrije agarplaten voor om als controles voor elk middel te fungeren. Installeer een gesteriliseerde inoculatiepenplaat op de steun van een 96-punts matrix-inoculator in een bioveiligheidskast.

Schik vervolgens het voorbereide zaadblok met geteste stammen en een met agar geïncubeerde plaat op de mobiele drager. Duw de mobiele drager totdat het zaadblok zich onder de inoculatiepenplaat bevindt. Druk nu op de bedieningshendel en laat de entpenplaat zakken, waarbij u de 96 pennen naar het entmateriaal in de 96 putjes van het zaadblok leidt.

Laat de bedieningshendel op een gecontroleerde manier los en reset automatisch de inoculatiepenplaat om elk entmateriaal goed te roeren en onder te dompelen, druk twee tot drie keer op de bedieningshendel. Verschuif en positioneer daarna de draagplaat zodat de incubatieplaat zich onder de inoculatiepenplaat bevindt. Druk de bedieningshendel naar beneden, laat de inoculatiepenplaat zakken en laat deze één tot twee seconden staan om volledig contact met het oppervlak van de geïncubeerde plaat te garanderen.

Laat de bedieningshendel los om een inoculatieronde te voltooien. Plaats de geïncubeerde plaat terug en herhaal het proces totdat de batch antimicrobiële agarplaten is voltooid. Schakel over op een nieuwe inoculatiepenplaat en zaadblok om een andere groep geteste stammen te inoculeren.

Incubeer de geïnoculeerde antimicrobiële agarplaten bij kamertemperatuur totdat het vocht van de inoculumplekken volledig in de agar is opgenomen. Keer na de incubatie de platen om en ga door met incuberen om ongeremde bacteriën kolonies te laten vormen. Om beeldacquisitie en gegevensstatistieken uit te voeren, klikt u eerst op het 96 dot matrix AST-beeldacquisitiesysteem om het programma te starten.

Selecteer testgegevens op de taakbalk. Klik op nieuw om een nieuwe testtaak aan te maken en vul de vereiste gegevens in. Druk vervolgens op gegevensverzameling, gevolgd door foto en testitem om de nieuw aangemaakte taak te selecteren.

Kies antibiotica om de naam van het antibioticum te selecteren en gradiënt om de beginconcentratie van het antibioticum te selecteren. Klik ten slotte op verbinden om een verbinding tot stand te brengen met de beeldacquisitieconverter. Plaats vervolgens de geïncubeerde platen op de basis van de detectieplaat en plaats ze in de beeldacquisitieconverter.

Klik op collectie om foto's van de platen vast te leggen. Druk op antibiotica en selecteer de volgende set platen. Kies verloop om het beginverloop te identificeren en ga vervolgens verder met de volgende ronde van het verzamelen van afbeeldingen.

Voltooi de procedure door op verzenden te klikken om de kolonievorming te bepalen en afbeeldingen om te zetten in minimale remmende concentraties, dat wil zeggen MIC-waarden. Klik op query om toegang te krijgen tot alle MIC-resultaten. Begin met het gebruik van de dubbellaagse agarmethode om verschillende fagen te produceren.

Verdun de fagen tot een geschikte parallelle concentratie en voeg 200 microliter van het faaginoculum toe aan het zaadblok met 96 putjes. Maak vervolgens een dubbellaagse geïncubeerde plaat voor elke te onderzoeken stam. Laat een opening onder het deksel van de dubbellaagse plaat om te kunnen drogen.

Plaats het voorbereide faagzaadblok en de dubbellaagse plaat op de mobiele drager van de 96 dot matrix-inoculator. Breng alle faaginoculair over naar het semi-agaroppervlak. Laat de platen op kamertemperatuur blijven totdat al het inoculair vocht in de semi-agar is opgenomen.

Incubeer nu de platen bij 37 graden Celsius voor de geteste stammen gedurende vier tot zes uur. Gebruik de beeldacquisitieconverter om de afbeelding van het experimentele resultaat van elke dubbellaagse plaat te verkrijgen en op te slaan. Noteer het aantal en de morfologieën van de verschillende puntvormen in een spreadsheet op basis van de verkregen afbeeldingen en bereken de respectievelijke verhoudingen van de verschillende soorten fagen.

Morfologisch onderzoek van salmonellagroei op platen met ampicilline toonde aan dat de negatieve controle in a-1 geen groei vertoonde. De MIC van de salmonellastam in a-4 was 64 microgram per milliliter, terwijl die van a-5 16 microgram per milliliter was. De procentuele resistentiewaarden van ampicilline, ciprofloxacine en amoxicilline-clavulaanzuur waren hoger dan 50%, terwijl die van doxycycline, florfenicol, cefotaxime en enrofloxacine 30% tot 50% waren, vertoonden gentamaïcine, amikacine en meropenem procentuele resistentiewaarden van minder dan 30%De LAR-indices van ciprofloxacine en amoxicilline-clavulaanzuur werden aanzienlijk uitgesteld.

Morfologische analyses van salmonellagroei op dubbellaagse platen toonden aan dat vier belangrijke vlekmorfologie van fagen werden waargenomen. De ronde heldere lytische vlek was afkomstig van een faag die de gastheer op de plaat betrouwbaar kon doden, maar die al dan niet met succes repliceerde ten koste van die gastheer. De verzameling plaquettes werd gevormd door echte plaquettes.

De troebele lytische vlek was het gevolg van een faag die de gastheer op de plaat niet betrouwbaar doodde en die al dan niet met succes repliceerde ten koste van die gastheer. De geen lytische vlek duidde op een niet-lytische aard. Deze techniek brengt gemakkelijk 96 agar-lenzen in één keer over en de instrumenten herkennen automatisch beelden en berekenen vervolgens de lijndobbelstenen.

Deze technologie zal naar verwachting het onderzoek en de industrialisatie van fagen bevorderen en de toepassing van fagen is een van de verbazingwekkende manieren om het probleem van AMR te verminderen en op te lossen.