Name: Synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Ontdek de synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels met behulp van fysieke en chemische disruptie en enzymatische digestie. Deze methode behoudt de structurele integriteit en biologische activiteit voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesponsord door het Medicine and Health Technology Plan van de provincie Zhejiang (2019KY050), het Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan van de provincie Zhejiang (2019ZA026), het Key Research and Development Plan in de provincie Zhejiang (subsidie nr. 2020C03043), het Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan van de provincie Zhejiang (2021ZQ021) en de Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ22H060007).

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Tongde-ziekenhuis in de provincie Zhejiang.
1. Bereiding van de DC-ECM-hydrogel
OPMERKING: In deze studie werd het kraakbeen verkregen uit de kniegewrichten van 12 maanden oude Bama-miniatuurvarkens, waardoor de verzameling van botweefsel werd vermeden.
<ol><li>Neem het verzamelde kraakbeen en blokkeer en hak het in 1-2 mm3 stukken met een scalpel.</li>
	<li>Doe 20 g van het gehakte kraakbeen in een centrifugebuisje van 50 ml en voeg 20 ml hypotone Tris-HCl-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) toe om het weefsel volledig onder te dompelen. Plaats de centrifugebuis gedurende 3 uur in een vriezer van -80 °C en vervolgens gedurende 3 uur in een oven van 37 °C. Herhaal de stap voor invriezen en verwarmen zes keer. In deze stap hoeft de hypotone Tris-HCl-buffer niet te worden vervangen.</li>
	<li>Schud de centrifugebuis gedurende 30 s met behulp van een vortexmixer met een snelheid van 1.000 tpm. Plaats een roestvrijstalen zeef (poriegrootte: ~250 μm) op een nieuwe centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Decanteer het gedecellulariseerde kraakbeen langzaam in de roestvrijstalen zeef, was het weefsel drie keer met steriele PBS en vang het kraakbeen op.</li>
	<li>Voeg 10 ml trypsine-oplossing toe (0,25% trypsine in PBS) en plaats de tube gedurende 24 uur op een shaker bij 37 °C. Vervang gedurende deze periode de trypsine om de 4 uur. Filtreer de suspensie met behulp van de roestvrijstalen zeef en bewaar het weefsel. De trypsine kan 's nachts worden behandeld tijdens een van de verteringsprocessen, en dit heeft geen invloed op de uiteindelijke vertering.</li>
	<li>Was het getrypsiniseerde weefsel met hypertone buffer (1,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6).</li>
	<li>Voeg 10 ml nuclease-oplossing toe (50 E/ml deoxyribonuclease en 1 E/ml ribonuclease in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) en plaats de tube gedurende 4 uur op een shaker bij 37 °C.</li>
	<li>Verwijder de nuclease-oplossing, was het kraakbeen driemaal met steriele PBS en voeg hypotone Tris-HCl-oplossing toe. Plaats de centrifugebuis op een shaker en spoel gedurende 20 uur op kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Verwijder de hypotone Tris-HCl-oplossing, was het kraakbeen driemaal met steriele PBS en voeg 1% Triton X-100-oplossing toe om het weefsel gedurende 24 uur onder te dompelen.</li>
	<li>Verwijder de Triton X-100-oplossing en spoel het gedecellulariseerde kraakbeen gedurende 3 dagen grondig af met gedestilleerd water, waarbij u het gedestilleerde water elke 12 uur ververst.</li>
	<li>Week het kraakbeen gedurende 4 uur in een perazijnzuuroplossing (0,1% PAA in 4% ethanol). Verwijder de perazijnzuuroplossing en was het kraakbeen drie keer met steriel gedestilleerd water.</li>
	<li>Plaats de roestvrijstalen zeef (poriegrootte: ~250 μm) op een centrifugebuis van 50 ml. Decanteer het gedecellulariseerde kraakbeen langzaam in de roestvrijstalen zeef en vang het kraakbeen op. Test de mate van decellularisatie en het behoud van de matrix van het kraakbeen door het gehalte aan DNA, collageen en glycosaminoglycaan (GAG) te schatten.</li>
	<li>Doe het gedecellulariseerde kraakbeen in een maalkom, voeg vloeibare stikstof toe en maal het gedecellulariseerde kraakbeen tot een poeder. Neem 2 g van het gedecellulariseerde kraakbeenpoeder, voeg 80 ml 0,5 M azijnzuur en 20 mg pepsine toe en verteer gedurende 24 uur. Centrifugeer op 400 x g gedurende 10 minuten; gooi het bezinksel weg en vang de supernatansoplossing (DC-ECM-oplossing) op.</li>
	<li>Decanteer 1 ml DC-ECM-oplossing per putje in platen met 6 putjes. Plaats de 6-wells platen in een lyofilisator. Vries de DC-ECM-oplossing in. Zodra de temperatuur in de vriesdroger daalt tot -40 °C, zet u de vacuümpomp aan en houdt u de vacuümgraad gedurende 22 uur op 10 Pa.</li>
	<li>Haal de gevriesdroogde DC-ECM-oplossing eruit, plaats deze in centrifugebuizen en bewaar bij -20 °C. De minimale opslagperiode van gevriesdroogde DC-ECM-oplossing is meer dan een half jaar.</li>
	<li>Voeg 1 ml steriel gedestilleerd water toe om 20 mg gevriesdroogde DC-ECM-oplossing in de centrifugebuis op te lossen. Schud gedurende 1 minuut met behulp van een vortexmixer met een snelheid van 1.000 tpm bij RT. Voeg 1 mg vitamine B2 (0,1% g/v) toe aan de DC-ECM-oplossing, incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C en bestraal gedurende 3 minuten met UV-licht (370 nm, 3,5 mW/cm2) om een hydrogel (DC-ECM-hydrogel) te vormen.</li>
</ol>2. Detectie van gedecellulariseerd kraakbeen
<ol><li>DNA-gehaltedetectie van gedecellulariseerd kraakbeen LET OP: Extraheer het DNA met behulp van de DNEasy Blood & Tissue Kit.<ol><li>Neem eerst 20 mg DC-ECM-kraakbeen in een centrifugebuis. Voeg 180 μL buffer GTL en 20 μL proteïnase K toe door vortexoscillatie en incubeer het kraakbeen gedurende 4 uur bij 56 °C totdat het volledig is opgelost.</li>
		<li>Schud de centrifugebuis gedurende 15 s met behulp van een vortexmixer met een snelheid van 1.000 tpm bij RT. Voeg vervolgens 200 μL Buffer GL en watervrije ethanol toe en meng grondig door vortextrillingen. Centrifugeer de monsters gedurende 1 minuut met een snelheid van 6.000 x g bij 4 °C.</li>
		<li>Voeg 500 μL buffer GW1 toe aan de adsorptiekolom en centrifugeer de monsters gedurende 1 minuut met een snelheid van 12.000 x g bij 4 °C. Voeg 500 μL buffer GW2 toe aan de adsorptiekolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 20.000 x g bij 4 °C. Voeg ten slotte 50 μL gesteriliseerd water toe aan de adsorptiekolom en centrifugeer gedurende 1 minuut met een snelheid van 6.000 x g bij 4 °C om de DNA-oplossing op te vangen. Bepaal het DNA-gehalte met behulp van een spectrofotometer.</li>
	</ol></li>
	<li>Detectie van collageengehalte in het gedecellulariseerde kraakbeen<ol><li>Om het collageengehalte in het gedecellulariseerde kraakbeen te detecteren, gebruikt u hydroxyproline als collageenaminozuurmarker. Zuur 5 mg gedecelluleerd kraakbeen aan met 5 ml zoutzuur 6 M bij 100 °C gedurende 20 minuten en neutraliseer het vervolgens met 5 ml natriumhydroxideoplossing van 6 M.</li>
		<li>Bereken het gehalte aan hydroxyproline door de extinctie van het monster bij 570 nm te meten met een spectrofotometer. Verkrijg een concentratie-absorptie lineaire regressie met behulp van het standaard hydroxyprolinemonster.</li>
	</ol></li>
	<li>Detectie van GAG-gehalte in het gedecellulariseerde kraakbeen OPMERKING: Het GAG-gehalte in het DC-ECM-kraakbeen werd gedetecteerd met behulp van een colorimetrische kwantitatieve detectiekit voor GAG in weefsel. Alle onderstaande reagentia zijn beschikbaar in de kit.<ol><li>Neem 200 mg DC-ECM-kraakbeenpoeder en voeg 500 μL reagens A toe door vortexoscillatie. Incubeer het monster gedurende 16 uur bij 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 14.000 x g .</li>
		<li>Neem 50 ml monsteroplossing en voeg 50 μl zoutrijke oplossing (reagens B) en 50 μl zuuroplossing (reagens C) toe door vortexoscillatie. Incubeer het monster gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Voeg 750 μL kleurstofoplossing (reagens D) toe door vortexoscillatie en incubeer het monster gedurende 30 minuten in donkere omstandigheden. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op 14.000 x g en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Voeg 1 μL reinigingsoplossing (Reagens E) toe en meng goed. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 14.000 x g en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Voeg 1 μL dissociatieoplossing (reagens F) toe aan het monster en meng goed. Incubeer het monster gedurende 30 minuten onder donkere omstandigheden. Bepaal ten slotte het GAG-gehalte met behulp van een spectrofotometer bij 600 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Scanning elektronenmicroscoop (SEM) en transmissie elektronenmicroscoop (TEM) analyse van het gedecellulariseerde kraakbeen<ol><li>Vergelijk het gedecellulariseerde kraakbeen en het normale kraakbeenweefsel. Plaats het monster in een 2,5% glutaaraldehyde-oplossing, incubeer het een nacht bij 4 °C en was het vervolgens driemaal met PBS.</li>
		<li>Fixeer het monster gedurende 1 uur in 1% OsO4 en was het vervolgens drie keer met PBS.</li>
		<li>Dehydrateer het monster door achtereenvolgens onderdompeling in 50%, 70%, 90% en 100% ethanol, evenals 100% aceton gedurende elk 15 minuten. Breng het monster gedurende 15 minuten in een gemengde oplossing van hexamethyldisilazaan en ethanol (1:1), gevolgd door onderdompeling in zuiver hexamethyldisilazaan gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Plaats het monster in een HCP-2-droger en droog het vervolgens met vloeibare stikstof. Smeer vervolgens het volledig gedroogde preparaat in met een dunne laag goud-palladium met behulp van sputtercoating en beeld af met SEM. De sputtercoating werd uitgevoerd met een vermogen van 120 W gedurende 5 minuten. Het experiment werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: een werkspanning van 15 kV en een vacuümgraad lager dan 5 x 10−5 Pa.</li>
		<li>Voor de TEM-analyse wordt het monster gedurende 1 uur in een mengsel van watervrij aceton en hars (1:1) geplaatst, gevolgd door een mengsel van watervrij aceton en hars (1:3) gedurende 3 uur. Plaats het monster vervolgens een nacht in hars.<ol><li>Plaats het monster in ingebedde met medium gevulde capsules en verwarm gedurende 9 uur op 70 °C.</li>
			<li>Snijd het monster na het inbedden in dunne plakjes van 70 nm met behulp van een ultrafijne microtoom en leg het op een koperen gaas.</li>
			<li>Spuit 20 μL uranylacetaatkleuringsoplossing op het koperen gaas en kleurs gedurende 15 minuten bij RT. Verwijder de kleuroplossing door het gaas twee keer voorzichtig te wassen met gedestilleerd water.</li>
			<li>Spuit vervolgens 20 μL loodcitraatkleuringsoplossing op het koperen gaas en kleur gedurende 15 minuten bij RT. Was het gaas drie keer met gedestilleerd water.</li>
			<li>Plaats het koperen gaas op een schone petrischaal bekleed met filtreerpapier. Fotografeer de secties na het drogen aan de lucht met TEM. De sonde werd aangebracht met een neerwaartse kracht van 500 nN, gescand met een snelheid van 1 Hz en had een elastische constante (k-waarde) van 40 Nm-1. De straal van de sondepunt werd gemeten op 8 nm.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+hydrogels+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering.</a> European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).</li>
<li>Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+hydrogels+for+osteochondral+and+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).</li>
<li>Bejleri, D., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+materials+for+cardiac+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217(2019).</li>
<li>Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix%3A+New+promising+and+challenging+biomaterials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine.</a> Biomaterials. 289, 121786(2022).</li>
<li>Barbulescu, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+cardiovascular+tissue+engineering%3A+Current+techniques+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040(2022).</li>
<li>Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+in+decellularized+extracellular+matrix-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels.</a> Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+articular+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair.</a> International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).</li>
<li>Li, T., Javed, R., Ao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+decellularized+extracellular+matrix-based+biomaterials+for+peripheral+nerve+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration.</a> Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).</li>
<li>Xia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+cartilage+as+a+prospective+scaffold+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering+C-Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair.</a> Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).</li>
<li>Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desktop-stereolithography+3D+printing+of+a+radially+oriented+extracellular+matrix%2Fmesenchymal+stem+cell+exosome+bioink+for+osteochondral+defect+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration.</a> Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+delivery+in+tissue-specific+hydrogel+enabled+meniscal+repair+in+an+orthotopic+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model.</a> Biomaterials. 132, 59-71 (2017).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensified+stiffness+and+photodynamic+provocation+in+a+collagen-based+composite+hydrogel+drive+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis.</a> Advanced Science. 6 (16), 1900099(2019).</li>
<li>Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.Nanoscale+and+mechanical+properties+of+the+physiological+cell-ECM+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).</li>
<li>Abdolghafoorian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heart+valve+decellularization+on+xenograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol biedt een systematische aanpak voor de bereiding van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels die de natuurlijke ECM van kraakbeenweefsel nauw nabootsen. Het protocol omvat een combinatie van fysische, chemische en enzymatische verstoring om cellulair materiaal te verwijderen met behoud van de structuur en samenstelling van de ECM. De kritieke stappen van het protocol omvatten het aanpassen van de decellularisatietijd en -methoden en het zorgen voor volledige decellularisatie.
<p cl...

Kraakbeenweefselmanipulatie is een zich snel ontwikkelend vakgebied dat tot doel heeft beschadigd of ziek kraakbeenweefsel te regenereren1. Een belangrijke uitdaging op dit gebied is de ontwikkeling van biomimetische steigers die de groei en differentiatie van chondrocyten, de cellen die verantwoordelijk zijn voor de productie van kraakbeen, kunnen ondersteunen. De ECM van kraakbeenweefsel speelt een cruciale rol bij het reguleren van het gedrag van chondrocyten. DC-ECM is een effectieve steiger voor weefselmanipulatietoepassingen3.
Er zijn een aantal technieken ontwikkeld om DC-ECM uit kraakbeenweefsel te produceren, waaronder chemische, enzymatische en fysische methoden. Deze methoden resulteren echter vaak in het genereren van ECM-hydrogels die onvoldoende biomimetisch zijn, wat hun potentieel voor gebruik in weefselmanipulatietoepassingen beperkt 4,5. Er is dus behoefte aan een effectievere methode voor het produceren van DC-ECM-hydrogels.
De ontwikkeling van deze techniek is belangrijk omdat het het gebied van weefselmanipulatie vooruit kan helpen door een nieuwe benadering te bieden voor het creëren van biomimetische steigers die weefselregeneratie en -herstel kunnen ondersteunen. Bovendien zou deze techniek gemakkelijk kunnen worden aangepast om ECM-hydrogels uit andere weefsels te produceren, waardoor de potentiële toepassingen ervan worden uitgebreid.
In de bredere literatuur is er een groeiende belangstelling voor het gebruik van DC-ECM als steiger voor weefselmanipulatietoepassingen6. Talrijke studies hebben de effectiviteit van DC-ECM-hydrogels aangetoond bij het bevorderen van celgroei en differentiatie in verschillende weefsels, waaronder kraakbeen 7,8. Daarom is de ontwikkeling van een protocol voor het produceren van DC-ECM-hydrogels die de natuurlijke ECM van kraakbeenweefsel nauw nabootsen, een belangrijke bijdrage aan het veld.
Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, komt in deze behoefte tegemoet door een nieuwe methode te bieden voor het produceren van DC-ECM-hydrogels die de natuurlijke ECM van kraakbeenweefsel nauw nabootsen. Het protocol omvat het decellulariseren van kraakbeenweefsel, het isoleren van de resulterende ECM en het creëren van een hydrogel door de ECM te verknopen met een biocompatibel polymeer. De resulterende hydrogel heeft veelbelovende resultaten laten zien bij het ondersteunen van de groei en differentiatie van chondrocyten.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl, pH7.6</td><td>Beyotime</td><td>ST776-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH8.0</td><td>Beyotime</td><td>ST780-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>-80 &deg;C Freezer</td><td>Eppendorf</td><td>F440340034</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease</td><td>Aladdin</td><td>D128600-80KU</td><td></td></tr><tr><td>DNEasy Blood &amp;Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>No. 69506</td><td></td></tr><tr><td>GAG colorimetric quantitative detection kit</td><td>Shanghai Haling</td><td>HL19236.2</td><td></td></tr><tr><td>HCP-2 dryer&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Spectrofotometer</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease</td><td>Aladdin</td><td>R341325-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sigma500</td><td>ZIESS</td><td>N/A</td><td>Scanning elektronenmicroscoop</td></tr><tr><td>Spectra S</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Transmissie elektronenmicroscoop</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen zeef</td><td>SHXB-Z-1</td><td>Shanghai Xinbu</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beyotime</td><td>P0096-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>Uv-lamp</td><td>Omnicure 2000</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vitamine B2</td><td>Gibco</td><td>R4500-5G</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Shanghai Qiasen</td><td>78HW-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix (DC-ECM) hydrogels zijn veelbelovende biomaterialen voor weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde vanwege hun biocompatibiliteit en het vermogen om natuurlijke weefseleigenschappen na te bootsen. Dit protocol heeft tot doel DC-ECM-hydrogels te produceren die de natuurlijke ECM van kraakbeenweefsel nauw nabootsen. Het protocol omvat een combinatie van fysische en chemische verstoring en enzymatische vertering om het celmateriaal te verwijderen met behoud van de structuur en samenstelling van de ECM. De DC-ECM wordt verknoopt met behulp van een chemisch middel om een stabiele en biologisch actieve hydrogel te vormen. De DC-ECM-hydrogel heeft een uitstekende biologische activiteit, ruimtelijke structuur en biologische inductiefunctie, evenals een lage immunogeniciteit. Deze eigenschappen zijn gunstig voor het bevorderen van celadhesie, proliferatie, differentiatie en migratie en voor het creëren van een superieure micro-omgeving voor celgroei. Dit protocol biedt een waardevolle bron voor onderzoekers en clinici op het gebied van weefselmanipulatie. Biomimetische hydrogels kunnen mogelijk de ontwikkeling van effectieve weefselmanipulatiestrategieën voor kraakbeenherstel en -regeneratie bevorderen.

Om een betere DC-ECM-kraakbeenhydrogel te bereiden, hebben we de eerdere literatuur bestudeerd en beoordeeld en de verschillende decellularisatieprotocollen vergeleken in termen van de decellularisatieratio, immunogeniciteit en mechanische functionaliteit9.
Op basis hiervan bereidden we de DC-ECM kraakbeenhydrogel voor en onderzochten we het effect van een radiaal georiënteerde extractieve matrix/mesenchymale stamcel exosoom bio-inkt bij de behandeling van osteochondral...

Dit artikel introduceert een nieuwe methode voor de synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix (DC-ECM) hydrogels. DC-ECM-hydrogels hebben een uitstekende biocompatibiliteit en bieden een superieure micro-omgeving voor celgroei. Daarom kunnen ze ideale celsteigers en biologische afgiftesystemen zijn.

Synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Ons protocol is belangrijk omdat het het mogelijk maakt om ziekten te creëren in hydrogels die sterk lijken op de aard van kraakbeenweefsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om ziekten te produceren in hydrogels met duidelijke biologische activiteit in ruimtelijke structuur, lage immunogeniciteit en biologische industriële functie. Hak om te beginnen het verzamelde kraakbeen met een scalpel in stukjes van één tot twee kubieke millimeter groot.Dompel in een centrifugebuis van 50 millimeter 20 gram van het gehakte kraakbeen onder in 20 milliliter hypotone Tris-hydrochloridebuffer. Zet de buis drie uur op 80 graden Celsius en daarna drie uur in de oven op 37 graden Celsius. Draai de centrifugebuis gedurende 30 seconden op 1000 RPM.Filter vervolgens het gedecellulariseerde kraakbeen met behulp van een plastic zeef die op een centrifugebuis van 50 milliliter is geplaatst. Was het kraakbeen driemaal met steriele PBS voordat u het opvangt. Voeg 10 milliliter trypsine-oplossing toe aan het verzamelde kraakbeen en incubeer het gedurende 24 uur op een shaker bij 37 graden Celsius, waarbij de trypsine om de vier uur wordt vervangen.Was na het filteren van de suspensie het getrypsiniseerde kraakbeen met hypertone buffer. Zodra het kraakbeen behouden is, voeg je 10 milliliter nuclease-oplossing toe en plaats je deze gedurende vier uur op een shaker bij 37 graden Celsius. Voeg na het wassen met steriele PBS hypertone Tris-hydrochloride-oplossing toe aan het kraakbeen en plaats deze op de shaker zoals getoond.Eenmaal gewassen met steriele PBS, dompelt u het weefsel gedurende 24 uur onder in 1%Triton X-100-oplossing. Spoel na het verwijderen van de Triton X-100 het gedecellulariseerde kraakbeen gedurende drie dagen af met gedestilleerd water en ververs het water elke 12 uur. Voeg na drie dagen perazijnzuuroplossing toe aan het kraakbeen en laat het vier uur weken.Eenmaal gewassen met PBS, vangt u het kraakbeen op met behulp van een plastic zeef, zoals eerder gedemonstreerd. Bereid met vloeibare stikstof gedecellulariseerd kraakbeenpoeder. Voeg 80 milliliter 0,5 molair azijn en 20 milligram pepsine toe aan twee gram kraakbeenpoeder en verteer het mengsel gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.Centrifugeer de suspensie na de digestie gedurende 10 minuten bij 400 G en vang het supernatant op, dat nu DC-ECM-oplossing wordt genoemd Voor het bewaren van de DC-ECM-oplossing, voegt u één milliliter van de oplossing toe aan elk putje van een plaat met zes putjes en plaatst u deze in een lyofilisator. Zodra de oplossing is gevriesdroogd, brengt u deze over in een centrifugebuis. Om een hydrogel te vormen, lost u 20 milligram gevriesdroogde DC-ECM-oplossing op in één milliliter steriel gedestilleerd water.Eenmaal gewerveld, voeg je één milligram vitamine B2 toe aan de DC-ECM-oplossing. Bestraal het na incubatie gedurende drie minuten met UV-licht. Voeg buffer GTL en proteïnase K toe aan 20 milligram DC-ECM-kraakbeenpoeder en meng grondig met behulp van vortexoscillatie.Voor volledige oplossing van het kraakbeen incubeert u het mengsel gedurende vier uur bij 56 graden Celsius. Eenmaal gewerveld, voeg je 200 microliter buffer GTL toe, gevolgd door watervrije ethanol. Centrifugeer het monster na het vortexen gedurende één minuut bij 6000 G bij vier graden Celsius.Verzamel en kwantificeer vervolgens het DNA zoals beschreven in het manuscript. Voor het analyseren van collageen, zuur vijf milligram DC-ECM-poeder in zoutzuur bij 100 graden Celsius gedurende 20 minuten. Neutraliseer het vervolgens met vijf milliliter natriumhydroxide-oplossing van zes molairen.Bereken het hydroxyprolinegehalte van het geneutraliseerde monster met behulp van absorptie op 570 nanometer ten opzichte van de hydroxyprolinestandaard. Voeg na het mengen 500 microliter reagens A toe aan 200 milligram DC-ECM-poeder. Incubeer het monster gedurende 16 uur bij vier graden Celsius.Eenmaal gecentrifugeerd, verzamel 50 microliter monsteroplossing en voeg 50 microliter reagens B toe, gevolgd door reagens C.Voeg na 10 minuten incuberen van het monster 750 microliter reagens D toe en incubeer gedurende 30 minuten in het donker. Voeg na het centrifugeren een microliter reagens E toe aan de pellet en meng goed voor het centrifugeren. Dissocieer vervolgens het monster vóór de meting van het GAG-gehalte.In het geprepareerde DC-ECM-kraakbeen werd het DNA-gehalte aanzienlijk geëlimineerd. Het collageen- en GAG-gehalte bleef echter behouden in vergelijking met het natuurlijke kraakbeen. De SEM- en TEM-analyse demonstreerden de ultrastructuur van de geprepareerde DC-ECM.De bereide hydrogel in de omgekeerde buis stroomde niet naar de bodem, waardoor gelering werd aangetoond. Verder, in vergelijking met de DC-ECM-oplossing, verkortte de toevoeging van vitamine B2 de geleringstijd als gevolg van de geïnduceerde verknoping tijdens de DC-ECM-hydrogelvorming. De DC-ECM-hydrogelviscositeit was hoger dan de viscositeit van de oplossing en verhoogde afschuifsnelheden verlaagden de viscositeit van de oplossing.Bovendien gaf de hoge opslagmodulus van de DC-ECM-oplossing en hydrogel aan dat ze beide gel- in plaats van vloeibare eigenschappen hadden. De SEM-analyse toonde aan dat de poriegrootte van de DC-ECM-oplossing aanzienlijk was afgenomen in de hydrogelvorm na verknoping en vriesdrogen. Het protocol omvat een combinatie van fysische en chemische verstoring en enzymatische vertering om celmateriaal te verwijderen met behoud van de structuur en het gesprek van de ECM.

synthesis-of-decellularized-cartilage-extracellular-matrix-hydrogels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De biosynthese van kraakbeenachtige extracellulaire matrix door chondrocyten kan worden beïnvloed door toepassing van mechanische stimuli. Deze methode beschrijft de technische uitvoering van dynamische druk-stammen chondrocyten ingekapseld in 3D constructen en de evaluatie van geïnduceerde veranderingen in chondrocyte metabolisme.

Mechanische stimulatie van Chondrocyten-agarose Hydrogelen

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Kraakbeenherstel vormt een onopgeloste medische uitdaging en cel-gebaseerde benaderingen om menselijk articulair kraakbeen te ontwikkelen zijn een veelbelovende oplossing. Hier beschrijven we driedimensionale (3D) biomimetische hydrogels als een ideaal hulpmiddel voor de uitbreiding en rijping van menselijke articulaire kraakbeencellen.

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Hier presenteren we een protocol om een nier cortex extracellulaire matrix afkomstige hydrogel te behouden van de inheemse nier extracellulaire matrix (ECM) structurele en biochemische samenstelling. Het fabricageprocédé en de toepassingen daarvan worden beschreven. Tot slot, een perspectief over het gebruik van deze hydrogel ter ondersteuning van de nier-specifieke cellulaire en weefsels regeneratie en bioengineering wordt besproken.

Fabriceren van een nier Cortex extracellulaire Matrix afkomstige Hydrogel

Decellularized kraakbeen afkomstige steigers kunnen worden gebruikt als een steiger aan gids kraakbeen reparatie en als een middel om te regenereren osteochondraal weefsel. Deze paper beschrijft het proces van de decellularization in detail en biedt suggesties voor deze steigers in in vitro-instellingen.

Fabricage van Decellularized kraakbeen afkomstige Matrix steigers

Het doel van dit protocol is productie van hele extracellulaire matrix vezels die voor reparatie van de wond wordt gericht die geschikt voor preklinische evaluatie als onderdeel van een regeneratieve steiger implantaat zijn. Deze vezels worden geproduceerd door de cultuur van fibroblasten op holle vezel membranen en geëxtraheerd door ontbinding van de membranen.

Productie van extracellulaire Matrix vezels via cultuur van de cel van de membraan van opofferende holle vezel

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Het protocol verduidelijkt twee verschillende decellularisatiemethodologieën die worden toegepast op inheemse longweefsels van runderen, en geeft een uitgebreid overzicht van hun respectieve karakteriseringen.

Ontwikkeling en karakterisering van gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels voor de longen

Ontdek de synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels met behulp van fysieke en chemische disruptie en enzymatische digestie. Deze methode behoudt de structurele integriteit en biologische activiteit voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

Synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels

Meer video's verkennen